Eine In-vitro-Technik zur Untersuchung der T-Zell-Interaktion mit gestützten planaren Lipid-Doppelschichten

Nehmen Sie einen Flow-Objektträger, der eine gestützte Lipiddoppelschicht (SLB) enthält.

Das SLB ist an spezifische Liganden konjugiert – interzelluläres Adhäsionsmolekül 1 oder ICAM-1 und Anti-CD3-Antikörper – die mit Fluorophoren markiert sind.

Fügen Sie T-Zellen und Fluorophor-markiertes Anti-CD107a-Fab hinzu – das Antigen-bindende Fragment eines Antikörpers gegen den Degranulationsmarker.

Der T-Zell-Rezeptor-CD3- oder TCR-CD3-Komplex bindet an den Anti-CD3-Antikörper und löst den TCR aus.

Ein triggerinduzierter Inside-Out-Signalweg aktiviert Integrine auf der Oberfläche, die an das immobilisierte ICAM-1 binden.

Die Konjugation induziert eine Reorganisation des Zytoskeletts – eine Umlagerung der Mikrotubuli und eine Aktinpolymerisation, die zu einer lateralen Ausbreitung der Zelle auf der SLB-Oberfläche führt.

Die Ausbreitung ermöglicht es mehr Liganden-Rezeptor-Interaktionen, einen supramolekularen Aktivierungscluster oder SMAC zu bilden, wodurch eine Immunsynapse entsteht.

T-Zell-lytische Granulate bewegen sich entlang von Mikrotubuli und verschmelzen mit der Plasmamembran, wodurch Degranulationsmarker auf der Zelloberfläche freigelegt werden, die an das Anti-CD107a-Fab binden.

Visualisieren Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop die Immunsynapse, die mit TCR-CD3-Komplexen, Integrinen und Degranulationsmarkern angereichert ist.

Beginnen Sie damit, die Glasdeckgläser mit einer Scherenzange aus Polypropylen 25 bis 30 Minuten lang in frisch zubereitete saure Piranha-Lösung zu tauchen. Spülen Sie die Deckgläser am Ende des Waschgangs bei jeder Wäsche siebenmal mit einer frischen Menge Reinstwasser aus und legen Sie die nassen Deckgläser beiseite, damit das restliche Wasser vom sauberen Glas abperlen kann.

Wenn die Deckgläser trocken sind, aliquotieren Sie zwei Mikroliter der endgültigen Liposomenmischung genau in der Mitte eines selbstklebenden Gleitkanals innerhalb einer sterilen Strömungshaube und richten Sie sofort, aber vorsichtig, ein sauberes und trockenes Deckglas mit dem Objektträger aus, damit das Deckglas sanft auf die klebrige Seite des Objektträgers abgesenkt werden kann, und verwenden Sie den Außenring der Polypropylen-Scherenzange, um einen sanften Druck auf den peripheren Kontakt des Objektträgers auszuüben. Deckglas mit dem Objektträger verbinden und darauf achten, dass der Slip fest mit dem Objektträger verbunden ist, um ein Auslaufen zu verhindern. Drehen Sie dann die Folie um und zeichnen Sie mit einem Permanentmarker vier Punkte um die Doppelschicht an der Außenseite der Folienbaugruppe.

Vor der ersten Injektion wird eine Öffnung des Kanals als Eintrittsöffnung und die andere als Ausgangsöffnung festgelegt, wobei diese Bezeichnung während des gesamten Experiments beibehalten wird. Um Blasenbildung zu vermeiden, führen Sie das Ende der Pipettenspitze direkt in die Eintrittsöffnung ein, bis Sie spüren, dass die Gummidichtung des Schiebekanals mit der Spitze durchdrungen wird.

Füllen Sie den Kanal langsam mit 50 Mikrolitern warmem Assay-Puffer. Injizieren Sie 200 Mikroliter Nickel(II)-chlorid in einer Kaseinblocklösung in die Eintrittsöffnung und entfernen Sie 50 Mikroliter des Puffers aus der Austrittsöffnung. Entfernen Sie nach einer 45-minütigen Inkubation die überschüssige Kaseinlösung aus der Austrittsöffnung.

Injizieren Sie 100 Mikroliter einer ICAM-1- und Streptavidin-Lösung in die Eintrittsöffnung für eine 45-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Entfernen Sie am Ende der Inkubation die überschüssige Proteinlösung aus der Austrittsöffnung und waschen Sie die Doppelschicht zweimal mit 100 Mikrolitern Assay-Puffer pro Waschgang. Anschließend werden die Doppelschichten 45 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 100 Mikrolitern Fluorophor-konjugiertem Anti-CD3-Antikörper markiert, gefolgt von zwei Waschgängen in 100 Mikrolitern Assay-Puffer pro Waschgang, wie gezeigt.

Um T-Zelle-Doppelschicht-Wechselwirkungen abzubilden, legen Sie den Objektträger auf den bei 37 Grad Celsius beheizten Tisch eines TIRF-Mikroskops (Total Internal Reflection Fluorescence) und stellen Sie den Tisch mit den Tintenmarkierungen so ein, dass die Doppelschicht auf dem Objektiv mit 100 Potenzen zentriert wird.

Für die Bildgebung mit granulierter Freisetzung fügen Sie fluoreszenzkonjugierte Anti-CD107a-Antikörper-Fab-Fragmente zur CD4-T-Zellsuspension hinzu und resuspendieren Sie die markierten Zellen in 50 Mikrolitern Assay-Puffer zur Injektion in die Eintrittsöffnung des Objektträgerkanals. Wählen Sie dann die entsprechende Anzahl von Versuchsfeldern aus und zeichnen Sie Bilder jedes Feldes 30 Minuten lang nach der Injektion einmal pro Minute auf.