Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Biomaterialien zu beantworten, wie z. B. die Entwicklung eines Gerüsts mit hervorragenden Flüssigkeitstransferfähigkeiten, hochentwickelten Ultrastrukturen und skalierbarer Herstellung. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie auf die meisten Pflanzen für Stängelgewebe angewendet werden können, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Sammeln Sie zunächst frische oder gefrorene Proben von F.hispida-Blättern.

Lagern Sie alle verbleibenden frischen Proben für die zukünftige Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Lassen Sie das Blatt in deionisiertem Wasser bei 20 bis 25 Grad Celsius emers bleiben. Schneide das Blatt mit einer sauberen Biopsie-Stanze in Scheiben mit einem Durchmesser von acht Millimetern.

Um die Blattproben zu waschen, inkubieren Sie sie anschließend fünf bis 10 Minuten lang auf einer Schüttelplatte bei niedriger Geschwindigkeit und tauchen Sie sie in entionisiertem Wasser ein. Bereiten Sie dann 10 Vol.-% SDS in entionisiertem Wasser vor. Nach der Zubereitung der SDS-Lösung legen Sie die Blattproben auf eine Plastikschale.

Fügen Sie dann die SDS-Lösung hinzu, um die Proben vollständig zu bedecken. Legen Sie die SDS-emersen Blattproben abgedeckt auf eine Schüttelplatte, um eine Verdunstung zu verhindern. Dann inkubieren Sie die Blattprobe fünf Tage lang bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie nach fünftägiger Inkubation die SDS-Lösung durch entionisiertes Wasser. Inkubieren Sie die in deionisiertem Wasser eingeweichten Proben 10 bis 15 Minuten lang auf einer Schüttelplatte. Mischen Sie anschließend fünf Milliliter nichtionisches Tensid mit 50 Millilitern Bleichmittel.

Geben Sie diese Mischung in 445 Milliliter entionisiertes Wasser. Tauchen Sie die Proben dann in die frisch zubereitete nichtionische Tensidbleichlösung. Wechseln Sie die nichtionische Tensidbleichlösung alle 24 Stunden, bis die Proben freigegeben sind.

Lassen Sie dann die geklärten Proben zwei Minuten lang in entionisiertem Wasser auf einer Schüttelplatte emers. Für eine waschmittelfreie Dezellularisierung bereiten Sie fünf Volumenprozent Bleiche in 3 Vol.-% Natriumbicarbonatlösung vor. Erwärmen Sie anschließend die Lösung auf einer Heizplatte in einem Abzug auf 60 bis 70 Grad Celsius.

Sobald die Lösung die gewünschte Temperatur erreicht hat, weichen Sie die Blattproben ein. Reduzieren Sie dann die Geschwindigkeit der Rührplatte, um eine Beschädigung der Proben zu vermeiden, und suchen Sie nach den sichtbar gereinigten Proben und übertragen Sie sie vorsichtig aus dem Bad. Zum Schluss inkubieren Sie die Proben ein bis zwei Minuten lang in entionisiertem Wasser.

Da alle Proben von Natur aus unterschiedlich sind, wird empfohlen, den Fortschritt der Dezellularisierung etwa alle 15 Minuten zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Proben nicht beschädigt werden. MTM-, SAF- und UTS-Parameter werden zunächst untersucht, um die einzigartigen dezellularisierten Gerüsteigenschaften sowohl von P.aquatica- als auch von F.hispida-Arten zu untersuchen. Tatsächlich weisen alle drei Parameter ähnliche mechanische Eigenschaften auf, sowohl bei der detergenzienbasierten als auch bei der detergenzienfreien Dezellularisierung.

Die mechanische UTS-Eigenschaft von F.hispida zeigt jedoch einen signifikant höheren Mittelwert, wenn SDS anstelle von Bleiche zur Dezellularisierung verwendet wird. Der genomische DNA-Gehalt der untersuchten geklärten Pflanzenarten ist bei der Dezellularisierung im Vergleich zu den nicht dezellularisierten Proben ebenfalls signifikant reduziert. Als nächstes wird die metabolische Aktivität menschlicher dermaler Thyroblasten auch in Gegenwart von dezellularisierten P.aquatica- oder Garcinia-Gerüsten gemessen.

Interessanterweise hatten waschmittelfreie Gerüste einen geringeren Einfluss auf die zelluläre Stoffwechselaktivität, aber das Waschen mit Trishydrochlorid-Puffer, gefolgt von serumfreiem Medium nach der SDS-Reinigung, verringert die Auswirkungen auf die zelluläre Stoffwechselaktivität im Vergleich zum Waschen mit deionisiertem Wasser allein. Schließlich wird hier das Wachstum der mit Kalzin gefärbten mesenchymalen Stammzellen auf der Oberfläche der Blattstruktur von F.hispida gezeigt. Einmal gemeistert, können diese Techniken von etwa sieben Tagen bis zu nur 15 Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt werden.

Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Proben während der Dezellularisierung zu überwachen, da die Proben von Charge zu Charge variieren können, was zu unterschiedlichen Clearing-Zeiten führen kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Dequantifizierung oder mechanische Tests angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. inwieweit die Proben freigegeben sind und welchen anderen Geweben die Proben mechanisch ähnlich sind. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik dazu beigetragen, Forschern auf dem Gebiet des Tissue Engineering den Weg zur Herstellung von durchlässigen Gerüsten zu ebnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Pflanzengewebe für die Verwendung als Gerüste dezellularisiert. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Reinigungsmitteln und Bleichdämpfen gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung geeigneter Schutzausrüstung und die Verwendung eines Abzugs getroffen werden sollten.