Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Diese Methode erklärt ein detailliertes Verfahren für das Tissue Engineering der Stammvene. Wir demonstrieren auch die Vorbereitung von Dezellularisierungsaufbauten und Bioreaktoren für die Rezellularisierung mit einfachen Geräten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass für die Rezellularisierung eine einfache Blutprobe erforderlich ist, wodurch schmerzhafte Knochenmarkentnahmen und zeitaufwändige Zellkulturverfahren vermieden werden.

Für die Perfusion und das Waschen von Triton-X 100 bereiten Sie die Dezellularisierungseinrichtung eins vor. Kleben Sie alle drei Stücke der Tube A an eine Zwei-Liter-Kammer. Kleben Sie eine Tube an die Wand, wo die Kante den Boden der Kammer für den Einlass des Waschmittels berührt. Kleben Sie die anderen beiden Röhren mit einem Abstand von fünf bis 10 Zentimetern an die gegenüberliegende Wand, je nach Länge der Vene.

Mindestens fünf Zentimeter dieser Röhren sollten auch mit Klebeband am Boden der Kammer befestigt werden. Verbinden Sie den Einlassschlauch des Reinigungsmittels mit dem Schlauch B über die männlichen und weiblichen Köderanschlüsse. Verbinden Sie dann Sonde B mit Sonde F und Sonde F mit Sonde C.Verbinden Sie Sonde C mit dem Veneneinlass.

Setzen Sie nun den Schlauch F in die Kassette der Schlauchpumpe ein. Nehmen Sie einen weiteren Schlauch C und verbinden Sie ein Ende mit dem Ausgang der Vene. Legen Sie das andere Ende in ein Glasgefäß, das mit einem unteren Schlauchauslass ausgestattet ist und 45 Zentimeter über der Kammer positioniert ist, und kleben Sie es fest.

Dieser dient als Waschmittelauslass. Schieben Sie dann ein Ende des Rohrs G in den Schlauchauslass des Glasgefäßes und stecken Sie das andere Ende in die Venenkammer. Bereiten Sie als Nächstes die zweite Dezellularisierungseinrichtung für die TnBP-Perfusion vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Bereiten Sie auch die dritte Dezellularisierungseinrichtung für die DNA-Perfusion vor, wie im Text beschrieben, und platzieren Sie sie bei 37 Grad Celsius. Um den Rezellularisierungsbioreaktor vorzubereiten, führen Sie das Rohr H in einen Anschluss einer Kappe mit vier Anschlüssen ein, die als Ausgang der Vene dient. In den zweiten Anschluss wird der Schlauch I eingeführt, der als Medieneinlass dient.

Und in den dritten Anschluss führen Sie den Schlauch J für den Einlass der Vene ein. Stecken Sie dann das andere Ende des Rohrs H in den vierten Anschluss, um als Medienausgang zu dienen. Verbinden Sie die Reduzierverbinder mit den inneren Enden der Schläuche H und J. Biegen Sie das andere Ende des Röhrchens J in eine U-Form und binden Sie es mit einer Naht zusammen.

Legen Sie nun ein 60-Milliliter-Röhrchen mit flachem Boden in ein 250-Milliliter-Glas. Verbinden Sie als Nächstes ein Ende des Rohrs K mit dem Einlass der Vene und das andere Ende mit dem Rohr E.Verbinden Sie das Rohr E mit einem zweiten Rohr K und dann mit dem Medieneinlass. Setzen Sie dann die vorbereitete Kappe in das in der Flasche enthaltene Röhrchen ein.

Zum Schluss sterilisieren Sie den Bioreaktor durch Autoklavieren. Führen Sie zwei Gefrier-Tau-Zyklen an einer menschlichen Stammvene durch, wie im Textprotokoll beschrieben, bevor Sie mit einer Schere eine zwei Millimeter lange Biopsie schneiden. Fixieren Sie die Biopsie 24 bis 48 Stunden lang bei Raumtemperatur in Formaldehyd.

Binden Sie jedes Ende der Vene mit einer Naht an die Widerhaken eines männlichen und weiblichen Köderverbinders. Verbinden Sie die Vene mit der Dezellularisierungseinrichtung eins und füllen Sie die Kammer mit einem Liter Lösung zwei. Perfundierten Sie nun 15 Minuten lang mit 35 Millilitern pro Minute und leeren Sie den Inhalt des Setups.

Fügen Sie dann einen Liter Lösung vier hinzu und perfundieren Sie vier Stunden lang mit 35 Millilitern pro Minute. Leeren Sie den Inhalt, fügen Sie 500 Milliliter Lösung zwei hinzu, perfundieren Sie fünf Minuten lang und leeren Sie den Inhalt erneut. Trennen Sie die Vene von Perfusionseinrichtung eins und verbinden Sie sie mit Perfusionseinrichtung zwei.

Fügen Sie dann einen Liter Lösung fünf hinzu, schalten Sie den Rührer ein und perfundierten Sie vier Stunden lang mit 35 Millilitern pro Minute. Trennen Sie die Vene von der zweiten Perfusionseinrichtung und waschen Sie die Außenseite der Vene zweimal mit 20 Millilitern Reinstwasser. Waschen Sie dann mit einer Spritze das Innere der Vene zweimal fünf bis 10 Minuten lang mit 20 Millilitern Reinstwasser.

Nach der Perfusion mit Perfusionseinrichtung drei, wie im Textprotokoll beschrieben, verbinden Sie die Vene mit der Perfusionseinrichtung eins. Füllen Sie einen Liter Lösung zwei und perfundierten Sie über Nacht mit 35 Millilitern pro Minute. Wiederholen Sie den Perfusionsprozess viermal, um das Kernmaterial vollständig zu entfernen.

Nach der Perfusion entleeren Sie das Setup, füllen Sie einen Liter Lösung zwei und perfundierten Sie 24 Stunden lang mit 35 Millilitern pro Minute. Nach 24 Stunden leeren Sie die Anlage wieder und füllen sie mit einem Liter Reinstwasser auf. Perfundierte für weitere 24 Stunden mit 35 Millilitern pro Minute.

Wiederholen Sie abschließend die Perfusion unter den gleichen Bedingungen, jedoch mit Lösung sieben. Nach Überprüfung der Dezellularisierung, wie im Textprotokoll beschrieben, sterilisieren Sie die Vene, indem Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen legen, das 50 Milliliter Lösung acht enthält. Rühren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit 80 Umdrehungen pro Minute in einem Shaker.

Um die Sterilität in einem Laminar-Flow-Schrank zu wahren, wird die sterile Vene nun mit einer sterilen Pinzette in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen mit 50 Millilitern steriler Lösung sieben mit 500 Mikrolitern Anti-Anti übertragen. Bewegen Sie die Vene wie zuvor für 12 Stunden und wechseln Sie die Lösung sieben mindestens zweimal dazwischen. Übertragen Sie die Vene mit einer sterilen Pinzette in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, fügen Sie 50 Milliliter Endothelmedium hinzu und rühren Sie 11 Stunden lang.

Verbinden Sie nun die Vene, indem Sie sie mit sterilem Naht und Pinzette an den Veneneinlass und -auslass des Bioreaktors binden, und ziehen Sie die Kappe an der 250-Milliliter-Flasche fest. Füllen Sie den Bioreaktor mit dem gleichen Endothelmedium. Fügen Sie Heparin in einer Menge von 50 Einheiten pro Milliliter hinzu und perfundierten Sie eine Stunde lang mit zwei Millilitern pro Minute im Inkubator.

Sammeln Sie 15 bis 25 Milliliter frisches Blut vom Spender in heparinbeschichteten Vacutainer-Röhrchen und verdünnen Sie es eins zu eins mit Steen-Lösung. Später fügen Sie den von endokrinen Drüsen abgeleiteten vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor und eine subtile Salicylsäure hinzu. Nachdem Sie das Endothelmedium aus dem Bioreaktor entleert haben, geben Sie das Blut hinein und perfundieren Sie 48 Stunden lang mit zwei Millilitern pro Minute in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid.

Arbeiten Sie etwa 12 Stunden später im Laminar-Flow-Schrank, um einen Tropfen Blut aus dem Bioreaktor zu entfernen und den Blutzucker mit einem Blutzuckermessgerät zu messen. Wenn der Wert weniger als drei Millimol pro Liter beträgt, fügen Sie Glukose hinzu, um ihn in den Bereich von sieben bis neun Millimol pro Liter zu bringen. Nach 48 Stunden zurück im Inkubator entleeren Sie das Blut aus dem Bioreaktor in der Laminar-Flow-Kabine.

Fügen Sie 30 Milliliter sterile Lösung sieben hinzu, perfundieren Sie fünf Minuten lang und lassen Sie die Lösung ab. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die blutrote Farbe verloren gegangen ist. Zum Schluss fügen Sie 30 bis 45 Milliliter Endothelmedium hinzu und perfundieren 96 Stunden lang im Inkubator mit zwei Millilitern pro Minute.

Trennen Sie die rezellularisierte Vene vom Bioreaktor im Laminar-Flow-Schrank, schneiden Sie mit einer Schere fünf Millimeter Ränder der Vene ab und entsorgen Sie sie. Nehmen Sie wie zuvor eine Biopsie, legen Sie sie in Formaldehyd und führen Sie eine Überprüfung der Rezellularisierung durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Die grobe Morphologie einer normalen Vene sieht hellrot aus.

Die rote Farbe geht in fortschreitenden Dezellularisierungszyklen verloren und sieht nach fünf Behandlungszyklen blass und weiß aus. Die Vene, die durch Perfusion von peripherem Blut und Endothelmedium rezellularisiert wurde, sah wieder hellrot aus. Hier ist ein repräsentatives Hämotoxylin- und Eosin-Färbebild einer normalen Vene zu sehen, das das Vorhandensein vieler blauer Kerne zeigt.

Bei der Hämotoxylin- und Eosin-Färbung der dezellularisierten Vene wurden jedoch keine blauen Kerne gefunden. In der rezellularisierten Vene, die mit Blut und Endothelmedium durchblutet wurde, zeigte die Hämotoxylin- und Eosin-Färbung das Vorhandensein von Zellanhaftung am Lumen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Dezellularisierung der Vena saphena durch Detergenzien und die Rezellularisierung mit peripherem Blut und endothelialem Medium durchgeführt wird.

Diese Technik der Dezellularisierung unter Verwendung der Perfusion von Triton-X 100, TnBP und DNA unter Druck war erfolgreich und reproduzierbar bei der Entfernung von Zellkernen aus menschlichen Stammvenen. Obwohl diese Technik 20 Tage dauert, verkürzt die Lagerung der dezellularisierten Vene als After-Shelf-Produkt die Eingriffszeit auf acht Tage. Die Rezellularisierung von Venen mit dem peripheren Blut des Empfängers kann als klinisch relevant angesehen werden.

Venen, die mit einem ähnlichen Protokoll rezellularisiert wurden, erwiesen sich bei der klinischen Transplantation als vielversprechend, indem sie eine funktionelle Blutversorgung nach der Operation gewährleisteten. Mit leichten Modifikationen kann dieses Protokoll für jeden Venentyp und als personalisiertes Transplantat in Kliniken für alle Gefäßoperationen verwendet werden.