Untersuchen der Kinase-Aktivität von LRRK2 In-vitro-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kinaseaktivität der leucinreichen Wiederholungskinase zwei zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Kinase-Assay-Gemisch mit rekombinantem LA zwei und einem myelinbasischen Proteinsubstrat hergestellt wird. Als nächstes wird ein mit einem TP markiertes Radio hinzugefügt und die Mischung wird eine Stunde lang inkubiert.

Dann werden die Proteine denaturiert, auf einem Polyacrylamid-Gel abgetrennt und einem Western Blot unterzogen. Abschließend wird die Membran einem Phospho-Sieb ausgesetzt und die Aktivität gemessen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die zeigen, dass LA zwei aktiv ist und wie Mutationen seine Aktivität durch Autophosphorylierung und Phosphorylierung von MBP verändern.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die radioaktiven Schritte aufgrund der zu treffenden Sicherheitsvorkehrungen schwer zu erlernen sind. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, lesen Sie bitte das schriftliche Protokoll über die ordnungsgemäße Verwendung und Entsorgung radioaktiver Isotope zur Verhinderung der Ausbreitung von Radioaktivität. Alle Reaktionsgemische sind in 1,5-Milliliter-Probenröhrchen mit Schraubverschlüssen mit O-Ring vorzubereiten.

Beginnen Sie den Assay, indem Sie zuerst das Wildtyp-Protein LA zwei sowie Varianten auf Eis auftauen. Dann verrührst du die folgenden Zutaten auf Eis. 10 Nanomolare Kinase, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, Myelin-Basisprotein, 0,5 Mikroliter 10-facher Kinasepuffer und genug Wasser, um das Volumen auf 50 Mikroliter zu erhöhen.

Nachdem Sie den Arbeitsbereich und/oder das Personal für die Arbeit mit Radioaktivität vorbereitet haben, stellen Sie die Heizblöcke auf 30 Grad Celsius bzw. 100 Grad Celsius ein. 32 PATP aus dem minus 20 Grad Celsius Gefrierschrank nehmen. Scannen Sie den Behälter vor dem Gebrauch von außen und hinter einer Plexiglasscheibe.

Beurteilen Sie mit dem Geigerzähler die Radioaktivität der 32 PATP bei jeder Reaktion auf Eis. Fügen Sie einen Mikroliter 32 PATP und 10 Mikromolar Kälte hinzu. Ein TP Verwende a pro Haustier, um gut zu mischen.

Zentrifugieren Sie dann die Reaktionen, um die Flüssigkeit an den Boden des Röhrchens zu bringen, wodurch das Risiko einer Kontamination minimiert wird. Als nächstes entfernen Sie ein 15-Mikroliter-Aliquot als Nullzeitpunkt und beenden die Reaktion durch Zugabe von fünf Mikrolitern vierfachem SDS-Probenpuffer. Anschließend denaturieren Sie das Aliquot bei 100 Grad Celsius für 10 Minuten.

Die verbleibende Probe wird 60 Minuten lang bei 30 Grad Celsius inkubiert. Entfernen Sie dann ein zweites 50-Mikroliter-Aliquot. Viermal Probenpuffer hinzufügen und 10 Minuten lang bei 100 Grad Celsius inkubieren.

Um die Reaktionen auf der SDS-Seite aufzulösen, laden Sie 20 Mikroliter jeder Probe auf eine 10. Nun, vier bis 12% Biss Polyacrylamid Gel zusammen mit einer Spur von Proteinstandard. Lassen Sie das Gel mit Mopps laufendem Puffer bei 160 Volt für 90 Minuten laufen oder bis die DIA-Front das Ende des Gels erreicht.

Übertragen Sie das Protein 16 Stunden lang bei 25 Volt auf eine PVDF-Membran, gemäß den im schriftlichen Protokoll beschriebenen Schritten. Sobald die Membran getrocknet ist, legen Sie sie zwischen zwei Celluloseacetat-Folien und setzen Sie sie entweder einem Phosphorschirm oder einem Röntgenfilm aus, um eine radioaktiv markierte Proteinexposition zu erkennen. Die Zeit kann von mehreren Stunden bis zu über einer Woche reichen, abhängig von der spezifischen Aktivität des verwendeten Radioisotops und der Enzymkinetik der Reaktion.

Wenn Sie einen Phospho-Bildschirm verwenden, speichern Sie das Bild als hochauflösende TIFF- oder Bitmap-Datei für den Film. Verwenden Sie einen Desktop-Scanner, um den Film zuerst zu scannen. Verwenden Sie hier Bild J für die Bildanalyse.

Die Ergebnisse des Assays, der mit dem Wildtyp-Lerche zwei sowie der überaktiven Kinase G 2 0 1 9 S und der D 1 99 4 A-Kinase durchgeführt wurde, mit dem Myelin-Basisprotein als Phosphatzepter, wie gezeigt, ist die Autophosphorylierung von Lark zwei bei etwa 200 Kilodalton sichtbar, wobei mehrere Banden phosphoryliertes MBP darstellen, die von 20 bis 40 Kilodalton sichtbar sind. Zu beachten ist das Fehlen einer Autophosphorylierung in der Spur D 1 90 94 a und eine erhöhte Phosphorylierung aufgrund der Mutation G 2 0 1 9 s. Die verbleibende Phosphorylierung von MVP in der Kinase-Totgasse kann auf eine unvollständige Ablation der Kinaseaktivität von Lark zwei durch die D 1 99 4 A-Mutante zurückzuführen sein oder das Vorhandensein von spurenkontaminierenden Kinasen in der Reaktion widerspiegeln.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Strahlung äußerst gefährlich sein kann und bei einem solchen Eingriff immer Schutzmaßnahmen wie Abschirmungen verwendet werden sollten.