Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mehrere potenzielle Phosphorylierungsstellen gleichzeitig zu bewerten und Stellen für eine anschließende Validierung durch Mutanten der Phosphorylierungsstelle zu identifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Biochemie und Zellbiologie über die Rolle posttranslationaler Modifikationen bei der Zellsignalübertragung zu beantworten. Diese Technik ermöglicht ein einfaches, budgetschonendes Vorab-Screening auf Phosphorylierungsstellen und das Protein von Interesse.

Die Implikation dieser Technik erstreckte sich auf die Diagnose und Therapie von Krankheiten wie Entzündungen und Krebs, da die Phosphorylierung ein wichtiges biochemisches Ereignis in den Signalwegen menschlicher Krankheiten ist. Die Demonstration wird von Sol-Bi Shin unterstützt, einem Doktoranden aus meinem Labor, der während der ortsgerichteten Mutagenese arbeitet. Kombinieren Sie zunächst 50 Nanogramm des Plasma-pGEX JST NRF2, 125 Nanogramm Forward-Primer, 125 Nanogramm Reverse-Primer, einen Mikroliter DNTP-Mix, 2,5 Einheiten PFU-DNA-Polymerase und 10x Reaktionspuffer auf Eis.

Fügen Sie steriles destilliertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 50 Mikroliter zu bringen. Führen Sie eine PCR durch, um den mutierten Strang einzubauen, und kühlen Sie die Probe dann zwei Minuten lang auf Eis ab. Geben Sie einen Mikroliter DPNI-Restriktionsenzym in die gekühlte Probe.

Mischen Sie die Probe durch sanftes Pipettieren und zentrifugieren Sie die Probe dann eine Minute lang bei 13.000 mal G. Inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die doppelsträngige DNA der Eltern zu verdauen. Werfen Sie dann superkompetente E.coli-Zellen mit endA1- und RACA1-Mutationen auf Eis. 50 Mikroliter des Reaktionsgemisches in die gekühlten Zellen geben und 30 Minuten auf Eis inkubieren.

In der Zwischenzeit einen Heizblock auf 42 Grad Celsius vorheizen. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, erhitzen Sie die Mischung 90 Sekunden lang auf 42 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann zwei Minuten lang auf Eis ab. Geben Sie vorgewärmte Lysogenie-Brühe in die umgewandelten Zellen.

Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 180 U/min. Verteilen Sie dann die Zellen auf LB-Ampicillin-Agar-Platten und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie eine einzelne Kolonie auf fünf Milliliter Lysogeny-Brühe mit Ampicillin.

Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 180 U/min. Extrahieren Sie die DNA-Probe mit einem Standard-Mini-Vorbereitungskit für die DNA-Sequenzanalyse. Lassen Sie mindestens 200 Nanogramm HDNA-Konstrukt in einem DNA-Analysator laufen, um die mutierte Sequenz zu verifizieren.

Exprimieren und reinigen Sie das validierte mutierte NRF2-Protein. Bestimmen Sie die Menge des produzierten mutierten NRF2, bevor Sie mit dem Kinase-Assay fortfahren. Um mit dem Peptid-Konkurrenz-Assay zu beginnen, bereiten Sie eine 5X-Kinase-Pufferlösung mit einer Adenosinmonophosphat-Konzentration von 500 Mikromolar vor.

Tauen Sie dann gefrorene Proben von humanem AMPK-Wildtyp-NRF2 und drei Oliogopeptiden auf, die die AMPK-Phosphorylierungsstellen von NRF2 nachahmen. Kombinieren Sie für jedes Peptid auf Eis 0,43 Milligramm des Peptids mit 0,15 Mikrogramm AMPK, 0,4 Mikrogramm NRF2 und sechs Mikrolitern 5X Kinase Buffer. Fügen Sie steriles destilliertes Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 30 Mikrolitern zu erreichen.

Stellen Sie dann in einem abgeschirmten Bereich einen Heizblock auf 30 Grad Celsius ein. Geben Sie eine Mikrocurie Gamma 32P ATP in jedes Röhrchen und mischen Sie jede Lösung gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Reaktionsgemische bei 30 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.

Bereiten Sie während der Inkubation 7,5% STS PAGE Gel vor. Geben Sie dann drei Mikroliter 10X STS-Probenpuffer in jedes Röhrchen und mischen Sie gründlich, um die Kinasereaktion zu stoppen. Lassen Sie die Proben 20 Minuten lang bei 70 Volt und dann eine Stunde lang bei 140 Volt im Gel laufen.

Entfernen Sie nach Abschluss der Gelelektrophorese vorsichtig das hochradioaktive Gel unterhalb der Bromphenolblau-Linie. Übertragen Sie das Gel vorsichtig vom Rollengießer in ein Glasröhrchen. Fixieren Sie das Gel in einer Lösung aus 50 % Methanol, 40 % Wasser und 10 % Essigsäure für 20 Minuten.

Legen Sie dann das Gel vorsichtig auf Filterpapier und decken Sie es mit transparenter Folie ab. Trocknen Sie das Gel mit einem Vakuum-Gel-Trockner eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius. Setzen Sie das trockene Gel zwei Tage lang entweder etwa 16 Stunden lang einem Phosphorsieb oder einem Röntgenfilm aus.

Verwenden Sie einen Phosphorimager, um eine hochauflösende TIFF- oder Bitmap-Datei des Bildschirms zu erzeugen. Zu Beginn des AMPK-Aktivitätsassays werden Proben von AMPK und von mutiertem und Wildtyp-GST NRF2 auf Eis aufgetaut. Kombinieren Sie 0,4 Mikrogramm mutiertes GST NRF2 mit 0,15 Mikrogramm AMPK und sechs Mikrolitern 5X Kinase-Puffer.

Fügen Sie steriles destilliertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 30 Mikroliter zu bringen. Bereiten Sie auf diese Weise ein weiteres Reaktionsgemisch mit 0,4 Mikrogramm Wildtyp-GST NRF2 vor. Geben Sie eine Mikrocurie Gamma 32P ATP in jedes Reaktionsgefäß

Pipettieren Sie die Mischungen mehrmals auf und ab und zentrifugieren Sie die Mischungen dann kurz. Inkubieren Sie die Mischungen 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius in einem abgeschirmten Bereich und beenden Sie dann die Kinasereaktion mit drei Mikrolitern 10X STS-Probenpuffer. Führen Sie STS PAGE aus, fixieren Sie das Gel und trocknen Sie das Gel unter den gleichen Bedingungen wie beim kompetitiven Kinase-Assay.

Setzen Sie das Gel über Nacht einem Phosphorsieb aus und scannen Sie das Sieb mit dem Phosphorimager. Ein in vitro AMPK-Assay wurde in Gegenwart von drei 10-Rest-Oligopeptiden durchgeführt, die AMPK-Phosphorylierungsstellen auf humanem NRF2 nachahmen. Das Oligopeptid, das die Serin-558-Stelle nachahmt, bot die größte Konkurrenz für die AMPK-Phosphorylierung.

Eine NRF2-Mutante, die Serin 558 durch Alanin ersetzte, wurde dann synthetisiert und in einem in vitro Aktivitätsassay bewertet. Es wurde eine sehr geringe AMPK-Phosphorylierung der S558 A-Mutante beobachtet, was darauf hindeutet, dass AMPK humanes NRF2 direkt an Serin 558 phosphoryliert. Da Peptide kompetitiv an Proteine binden, kann das Prinzip dieser Methode auch zur Identifizierung anderer Nachtranslations- und Modifikationen wie Acetylierung und Lysinreste und Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet werden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioisotopen äußerst gefährlich sein kann. Vor der Durchführung dieses Verfahrens sollte bereits eine Sicherheitsschulung für Radioisotope absolviert werden.