Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mehrere potenzielle Phosphorylierungsstellen gleichzeitig zu bewerten und Stellen für eine anschließende Validierung mittels Phosphorylierungsstellen-Mutanten zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Biochemie und Zellbiologie bezüglich der Rolle posttranslationaler Modifikationen in der Zellsignalübertragung zu beantworten. Diese Technik ermöglicht eine einfache, kostengünstige Voruntersuchung von Phosphorylierungsstellen und des Proteins von Interesse.

Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Diagnose und Therapie von Erkrankungen wie Entzündungen und Krebs, da Phosphorylierung ein wichtiges biochemisches Ereignis in Signalwegen bei menschlichen Erkrankungen darstellt. Bei der Demonstration unterstützen wird Sol-Bi Shin, eine Doktorandin aus meinem Labor, die eine gezielte Mutagenese durchführen wird. Mischen Sie zunächst 50 Nanogramm des Plasmids pGEX JST NRF2, 125 Nanogramm des Vorwärtsprimers, 125 Nanogramm des Rückwärtsprimers, ein Mikroliter dNTP-Mix, 2,5 Einheiten PFU-DNA-Polymerase und 10x Reaktionspuffer auf Eis.

Geben Sie sterile destillierte Wasser hinzu, um das Volumen auf 50 Mikroliter aufzufüllen. Führen Sie eine PCR durch, um den mutierten Strang einzubauen, und kühlen Sie die Probe anschließend zwei Minuten lang auf Eis ab. Fügen Sie ein Mikroliter DPNI-Restriktionsenzym zur abgekühlten Probe hinzu.

Mischen Sie die Probe vorsichtig durch Pipettieren und zentrifugieren Sie die Probe anschließend eine Minute lang bei 13.000 × g. Inkubieren Sie die Probe zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die elterliche doppelsträngige DNA abzubauen. Geben Sie dann superkompetente E. coli-Zellen mit den Mutationen endA1 und RACA1 auf Eis. Fügen Sie 50 Mikroliter der Reaktionsmischung zu den gekühlten Zellen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis.

Unterdessen heizen Sie einen Heizblock auf 42 Grad Celsius vor. Nach Abschluss der Inkubation erhitzen Sie das Gemisch 90 Sekunden lang auf 42 Grad Celsius und kühlen es anschließend zwei Minuten lang auf Eis ab. Geben Sie vorgewärmte Lysogeny-Bouillon zu den transformierten Zellen hinzu.

Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 180 U/min. Anschließend die Zellen auf LB-Ampicillin-Agarplatten ausplattieren und die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Eine einzelne Kolonie in fünf Milliliter Lysogeny-Bouillon mit Ampicillin überführen.

Die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 180 U/min inkubieren. Die DNA der Probe mit einem Standard-Minipräp-Kit für die DNA-Sequenzanalyse extrahieren. Mindestens 200 Nanogramm des HDNA-Konstrukts in einem DNA-Analysator laufen lassen, um die Mutantensequenz zu verifizieren.

Expressieren und reinigen Sie das validierte mutierte NRF2-Protein. Bestimmen Sie die Menge an produziertem mutiertem NRF2, bevor Sie mit dem Kinase-Assay fortfahren. Um den Peptid-Konkurrenz-Assay zu beginnen, bereiten Sie eine 5X-Kinase-Pufferlösung mit einer Adenosinmonophosphat-Konzentration von 500 µM vor.

Dann tauen Sie gefrorene Proben von AMPK-Wildtyp, humanem NRF2 und drei Oligopeptiden auf, die die AMPK-Phosphorylierungsstellen von NRF2 nachahmen. Für jedes Peptid mischen Sie auf Eis 0,43 Milligramm des Peptids mit 0,15 Mikrogramm AMPK, 0,4 Mikrogramm NRF2 und sechs Mikrolitern 5X-Kinase-Puffer. Geben Sie sterile destillierte Wasser hinzu, um ein Endvolumen von 30 Mikrolitern zu erreichen.

Dann stellen Sie in einem abgeschirmten Bereich einen Heizblock auf 30 Grad Celsius ein. Geben Sie ein Mikrocurie gamma-32P-ATP zu jedem Reaktionsgefäß hinzu und mischen Sie jede Lösung durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren gründlich. Inkubieren Sie die Reaktionsansätze bei 30 Grad Celsius für 15 bis 30 Minuten.

Während der Inkubation bereiten Sie ein 7,5 %iges STS-PAGE-Gel vor. Geben Sie anschließend drei Mikroliter 10× STS-Probenpuffer zu jedem Röhrchen hinzu und mischen Sie gründlich, um die Kinase-Reaktion zu stoppen. Führen Sie die Proben im Gel bei 70 Volt für 20 Minuten und anschließend bei 140 Volt für eine Stunde durch.

Nach Abschluss der Gelelektrophorese vorsichtig das stark radioaktive Gel unterhalb der Bromphenolblaulinie entfernen. Das Gel vorsichtig aus der Gussform in ein Glasröhrchen überführen. Das Gel 20 Minuten lang in einer Lösung aus 50 % Methanol, 40 % Wasser und 10 % Essigsäure fixieren.

Dann das Gel vorsichtig auf Filterpapier legen und mit einer transparenten Folie abdecken. Das Gel für eine Stunde bei 80 °C in einem Vakuum-Gel-Trockner trocknen. Das getrocknete Gel entweder etwa 16 Stunden einem Phosphorimager-Screen oder zwei Tage lang einem Röntgenfilm aussetzen.

Verwenden Sie ein Phosphorimager, um eine hochauflösende TIFF- oder Bitmap-Datei des Screens zu erstellen. Um den AMPK-Aktivitätsassay zu beginnen, tauen Sie Proben von AMPK sowie von mutiertem und wildtypischem GST-NRF2 auf Eis auf. Kombinieren Sie 0,4 Mikrogramm mutiertes GST-NRF2 mit 0,15 Mikrogramm AMPK und sechs Mikrolitern 5X-Kinasepuffer.

Fügen Sie steriles destilliertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 30 Mikroliter aufzufüllen. Bereiten Sie auf diese Weise eine weitere Reaktionsmischung mit 0,4 Mikrogramm des wildtypischen GST-NRF2 vor. Geben Sie ein Mikrocurie gamma-32P-ATP zu jedem Reaktionsfläschchen hinzu.

Pipettieren Sie die Gemische mehrmals auf und ab und zentrifugieren Sie die Gemische kurz. Inkubieren Sie die Gemische 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius in einem abgeschirmten Bereich und beenden Sie danach die Kinase-Reaktion mit drei Mikrolitern 10X STS-Probebufffer. Führen Sie die STS-PAGE durch, fixieren Sie das Gel und trocknen Sie das Gel unter denselben Bedingungen wie beim kompetitiven Kinase-Assay.

Belichten Sie das Gel über Nacht auf einem Phosphor-Screen und scannen Sie den Screen mit dem Phosphorimager. Ein in-vitro-AMPK-Assay wurde in Gegenwart von drei 10-Rest-Aminosäure-Oligopeptiden durchgeführt, die AMPK-Phosphorylierungsstellen am menschlichen NRF2 nachahmen. Das Oligopeptid, das die Serin-558-Stelle nachahmt, zeigte den stärksten Wettbewerb um die AMPK-Phosphorylierung.

Ein NRF2-Mutant, bei dem Serin 558 durch Alanin ersetzt wurde, wurde anschließend synthetisiert und in einem In-vitro-Aktivitätsassay untersucht. Es wurde nur eine sehr geringe AMPK-vermittelte Phosphorylierung des S558A-Mutanten beobachtet, was darauf hindeutet, dass AMPK menschliches NRF2 direkt an Serin 558 phosphoryliert. Da Peptide kompetitiv an Proteine binden, kann das Prinzip dieser Methode auch zur Identifizierung anderer posttranslationaler Modifikationen wie Acetylierungen und Lysinresten sowie von Protein-Protein-Interaktionen angewendet werden.

Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit radioaktiven Isotopen äußerst gefährlich sein kann. Vor Durchführung dieses Verfahrens sollte bereits eine Schulung zur Sicherheit im Umgang mit radioaktiven Isotopen absolviert worden sein.