Bestimmung der Plasmamembran Partitionierung für peripher-assoziierte Proteine

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Zellbiologie zu beantworten, einschließlich der Entschlüsselung von Zellsignalwegen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass sie eigentlich keine ausgefeilten, mikroskopischen Ansätze erfordert. Es ist auch sehr schnell und daher für die Echtzeit-Beobachtung der Proteinverteilung in Zellen nutzbar.

Die Bewertung und Quantifizierung der Membranpartitionierung von peripher assoziierten Proteinen wird durch die Lichtbeugung erschwert, die eine Vermischung von Plasmamembran und zytoplasmatischer Fluoreszenz unter dem Mikroskop verursacht. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Vorbereitung des biologischen Materials, wie im Textprotokoll beschrieben. Färben Sie das vorbereitete Material mit dem Farbstoff FM 4-64, indem Sie ein Färbeprotokoll anwenden, das für das untersuchte Material geeignet ist.

Bei Tabak-BY-2-Zellen färben Sie 200 Mikroliter Zellsuspension mit 0,2 Mikrolitern 10 millimolare FM 4-64-Lösung in Dimethylsulfoxid. Um einen äquatorialen konfokalen Schnitt pro Zelle zu erfassen, stellen Sie eine sequentielle Zweikanal-Abtastung für das Chromophor ein, das als Protein-Tag verwendet wird, und für FM 4-64. Stellen Sie außerdem eine höhere optische Auflösung ein.

Ein Beispielaufbau ist ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3 und einer Bildgröße von 1.024 x 1.024 Pixeln. Installieren Sie Fiji ImageJ Distribution und das erforderliche Makro-Peripheriegerät. Wählen Sie in Fidschi im Hauptmenü Plugins, dann Makros, dann installieren und geben Sie den Pfad zur heruntergeladenen Datei mit dem ImageJ-Makro-Peripheriegerät an.

Installieren Sie die R Project-Software und die erforderlichen Pakete. Führen Sie die grafische Benutzeroberfläche von R aus, wählen Sie Pakete aus, installieren Sie dann Pakete im Hauptmenü und geben Sie das nächstgelegene Repository sowie das Paket ggplot2 für die Installation an. Laden Sie das Peripheriegerät des R-Pakets herunter.

Installieren Sie sie, indem Sie Pakete auswählen und dann Pakete aus lokalen Dateien installieren. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder des zytoplasmatischen Markers. Importieren Sie dazu die Bilder nach Fidschi mit Plugins, dann mit Bioformaten und dann mit dem Bioformats-Importer aus dem Fidschi-Menü mit den Standardeinstellungen.

Führen Sie das Makro Importoptionen für eine Analyseeinrichtung aus. Aktivieren Sie das Makro, indem Sie denselben Punkt auswählen, nachdem Sie auf das Menü des Menüwerkzeugs für periphere Proteine geklickt haben. Definieren Sie den entsprechenden Wert im Feld Gaußscher Weichzeichnungsradius Pixel.

Dies beeinflusst die Bildglättung und die Rauschunterdrückung. Ein niedriger Wert ist ausreichend und verursacht keinen Verlust von Bildinformationen. Stellen Sie nun im Feld Profil Linienbreite Pixel einen Wert ein.

Eine dickere Linie bewirkt eine höhere Glättung der Profilkurven. Es wird ein Standardwert von 10 Pixel empfohlen. Legen Sie einen Bildtitel fest, der anhand der Definition von Beispieltrennzeichen und exportierten Elementen analysiert wird.

Klicken Sie auf OK. Überprüfen Sie die Titelanalyse im nächsten Dialogfenster und klicken Sie zum Zurücksetzen auf OK oder Zurück. Führen Sie als Nächstes eine lineare Auswahl über den Plasmamembranbereich in den verarbeiteten Bildern durch und messen Sie die Fluoreszenzprofile. Wählen Sie dazu die gerade Linie des Fidschi-Werkzeugs aus der Fidschi-Symbolleiste aus.

Klicken Sie auf das Bild und ziehen Sie eine Linie über den Bereich der Plasmamembran. Die Linie muss im extrazellulären Raum beginnen und sollte senkrecht zur Plasmamembran verlaufen. Wählen Sie Regionen mit einer dickeren und homogeneren Schicht aus kortikalem Zytoplasma.

Die optimale Länge der linearen Auswahl beträgt fünf bis 10 Mikrometer. Führen Sie das Makro "Profil erstellen" aus, indem Sie in der Symbolleiste "Fidschi" auf das Werkzeug "Profil übernehmen" klicken. Die automatische Messung der Fluoreszenzprofile in beiden Kanälen wird durchgeführt und die Daten werden im Ergebnisfenster angezeigt.

Entsprechend der individuellen Signalvariabilität nehmen Sie repräsentative Zahlen der Profile für jede Zelle. Führen Sie das Makro Plotprofildaten zur grafischen Visualisierung der gemessenen Profile aus. Legen Sie den Parameter im Dialogfenster des aufgerufenen Makros fest.

Lassen Sie das Kontrollkästchen Filterung für Eingabedaten verwenden deaktiviert. Geben Sie an, ob das Diagramm aus den letzten Daten im Ergebnisfenster, aus einer einzelnen CSV-Datei oder aus allen CSV-Dateien in einem bestimmten Verzeichnis erstellt werden soll, indem Sie auf das entsprechende Optionsfeld klicken. Geben Sie an, welche Gruppierungsfaktoren für die Darstellung verwendet werden sollen, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen aktivieren.

Wählen Sie den Faktor I, wenn alle Profile in eindeutigen Diagrammen dargestellt werden sollen. Lassen Sie die Kontrollkästchen deaktiviert, wenn alle Daten in einem einzigen Diagramm dargestellt werden sollen. Klicken Sie auf OK. Geben Sie den Pfad und den Dateinamen für das Speichern der Ergebnisse oder für einen eventuellen Datenimport im nächsten Dialogfenster an.

Bestätigen Sie die Analyse, indem Sie in den Dialogfenstern auf OK klicken, in denen der ausgeführte R-Code angezeigt wird. Führen Sie das Setup-Makro für die Profilfilterung aus, wenn einige gezeichnete Profile übermäßige Signale im extrazellulären oder intrazellulären Raum aufweisen. Legen Sie anschließend die Parameter im Dialogfenster des aufgerufenen Makros fest.

Legen Sie für jeden Kanal den entsprechenden Intensitätsschwellenwert in der Datei fest und entfernen Sie Messungen mit einem übermäßigen extrazellulären oder intrazellulären Signal. Geben Sie den Bereich an, in dem der Intensitätsschwellenwert im Feld bei X-Koordinaten niedriger oder größer als angewendet werden soll, und klicken Sie dann auf OK. Führen Sie das Datenmakro des Zeichnungsprofils erneut aus, wobei das Kontrollkästchen Filter für Dateneingabe verwenden aktiviert ist. Fügen Sie nun die Daten aus der zuvor gespeicherten Datei hinzu.

Stellen Sie sicher, dass alle fehlerhaften Profile erfolgreich entfernt wurden, andernfalls verbessern Sie die Filterparameter. Führen Sie das Makro zum Erstellen eines Modells aus, um ein Modell der Plasmamembran und der Zytoplasma-Fluoreszenzverteilung basierend auf den Kalibrierungsdaten zu erstellen. Nachdem Sie die Parameter im Dialogfenster des aufgerufenen Makros wie im Textprotokoll beschrieben festgelegt haben, klicken Sie auf OK. Geben Sie den Pfad und den Namen der Eingabedatei in den nächsten Dialogfenstern an, und bestätigen Sie die Analyse, indem Sie im Dialogfenster, in dem der ausgeführte R-Code angezeigt wird, auf OK klicken.

Verarbeiten Sie als Nächstes die Bilder der Zellen, die das Protein von Interesse exprimieren. Importieren Sie die Bilder und richten Sie die Analyse wie zuvor ein. Die Glättung und die Linienbreite sollten identisch sein.

Fahren Sie mit dem Messen der Profile fort. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Profile durch Plotten, und stellen Sie die Filterung bei Bedarf wie zuvor beschrieben ein. Führen Sie das Makro calculate distribution aus, um eine Proteinverteilung zwischen der Plasmamembran und im Zytoplasma zu berechnen.

Geben Sie Eingabedaten und Modellquellen an, und legen Sie schließlich eine Datenfilterung fest. Lassen Sie das Kontrollkästchen aktiviert, um Ergebnisse zu entfernen, deren Restvariabilität größer ist, als wenn eine Ergebnisfilterung gewünscht ist. Geben Sie den Schwellenwert für die maximal zulässige Restvariabilität an, die durch die Signalzerlegung der Einzelprofilmessung nicht erklärt werden kann.

Wählen Sie Beispielgruppierungsfaktoren aus, die zum Erstellen eines Boxplots verwendet werden können. Klicken Sie auf OK, geben Sie die Eingabe- oder Ausgabepfade an, und bestätigen Sie die Analyse, indem Sie im Dialogfenster mit dem ausgeführten R-Code auf OK klicken. Hier ist ein Bild einer FM 4-64-gefärbten Zelle zu sehen, die ein pflanzliches Protein exprimiert, das über N-Myristoylierung und elektrostatische Wechselwirkung mit Phosphoinositiden mit der Plasmamembran assoziiert ist.

Diese Wechselwirkungen wurden experimentell durch Wortmannin gestört. Die Bedeutung der N-Myristoylierung wurde durch eine Mutation in Glycin an der zweiten Aminosäureposition getestet, die als N-Myristoylierungsstelle dient. Der Effekt einer Entfernung beider Plasmamembran-Bindungsfähigkeiten wurde durch Trunkierung der N-terminalen Domäne des Proteins getestet.

Das resultierende Boxplot zeigt eine Abnahme der Plasmamembranaffinität nach Mutation der N-Myristoylierungsstelle und nach medikamentöser Behandlung. Ihre gegenseitige Wirkung ist vergleichbar mit der Wirkung der Entfernung der N-terminalen Domäne. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Hauptschritte der Analyse in der richtigen Reihenfolge ausführen und wie Sie ihre Parameter einstellen.

Im Anschluss an diese Analyse kann ein statistisches Verfahren wie die ANOVA zur statistischen Auswertung der erhaltenen Daten durchgeführt werden. Obwohl diese Methode für pflanzliche Suspensionszellen entwickelt wurde, kann sie auch auf andere Zellen oder Gewebe mit glatten und klar unterscheidbaren Plasmamembranen angewendet werden.