Untersuchung der Alpha-Synuclein-Akkumulation in primären embryonalen Dopamin-Neuronen der Maus

Nehmen Sie Mikroinselkulturen von primären embryonalen Dopaminneuronen der Maus in einer Multi-Well-Platte, die Medien enthält.

Diese Neuronen werden mit vorgeformten Fibrillen (PFFs) vorbehandelt – fehlgefalteten und aggregierten Formen des Alpha-Synuclein-Proteins.

PFFs fungieren als Seeds, die eine weitere Fehlfaltung und Oligomerisierung von endogenem alpha-Synuclein auslösen und phosphorylierte alpha-Synuclein-Fibrillen bilden. Diese Fibrillen bilden schließlich Lewy-Körper.

Ersetzen Sie das Medium durch ein Fixiermittel, um die Zellmorphologie zu erhalten.

Waschen Sie die Zellen mit Puffer.

Führen Sie einen detergenzienhaltigen Puffer ein, um die Zellmembranen zu permeabilisieren.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, um eine unspezifische Antikörperbindung zu verhindern.

Fügen Sie primäre Antikörper hinzu, die auf phosphoryliertes Alpha-Synuclein und ein Referenzprotein abzielen, das ubiquitär in Dopamin-Neuronen exprimiert wird.

Waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Einführung von Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern, die auf die jeweiligen Primärantikörper abzielen.

Erneut waschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen.

Fügen Sie einen DNA-bindenden Farbstoff hinzu, um die Zellkerne zu färben.

Quantifizieren Sie mit einem Fluoreszenzplattenscanner die Dopamin-Neuronen, die zytoplasmatische Alpha-Synuclein-Aggregate enthalten.

Geben Sie 3,75 Mikroliter mit 100 Mikrogramm pro Milliliter vorgeformter Fibrillen in jede Versuchsvertiefung und 3,75 Mikroliter PBS in jede Kontrollvertiefung.

Seien Sie bei der Arbeit mit PFFs vorsichtig mit unerwünschten Proteinverunreinigungen und reinigen Sie anschließend die Haube und alle PFF-assoziierten Instrumente mit 1 % SDS und 70 % Ethanol.

Laden Sie die 96-Well-Kulturplatte am entsprechenden experimentellen Endpunkt nach dem Färben nach den interessierenden Markern auf einen Plattenscanner mit hohem Gehalt, der mit einem 10-fach-Objektiv ausgestattet ist. Passen Sie die Einstellungen an die Spezifikationen der 96-Well-Platte an, z. B. den Plattentyp, den Hersteller, die Größe, den Abstand zwischen den Wells sowie die Art und das Volumen des Mediums.

Wählen Sie den Bildgebungsbereich der Wells aus, um alle Zellen in jeder Mikroinsel abzudecken, und verwenden Sie eine Well, um den Autofokus auf der DAPI-Expression anzupassen. Kalibrieren Sie die Erfassungszeit für jeden Fluoreszenzkanal auf der Grundlage der Intensität der Färbung in den Kontrollvertiefungen und passen Sie die Parameter so an, dass die Dopaminzellen in den vorgeformten fibrillenbehandelten Kontrollvertiefungen, die Phosphoserin-129-alpha-Synuclein-Aggregate innerhalb des Zellsomas beherbergen, eindeutig unterschieden werden, was eine eindeutige Quantifizierung der positiven und negativen Zellen von Phosphoserin-alpha-Synuclein ermöglicht.

Stellen Sie dann alle ausgewählten Wells gleichzeitig in allen Kanälen dar, wobei Sie für jedes Well genau die gleichen Parameter verwenden.