Schneller und spezifischer Nachweis von Acinetobacter baumannii-Infektionen mit einem Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-/Cas12a-basierten System

Meine Forschungsschwerpunkte liegen im Bereich Atemwegserkrankungen und Infektionen. Ich werde mich mit den aktuellen Technologien befassen, die in diesem Bereich voranschreiten, und mit den Forschungslücken des gesamten Projektfeldes. Zu den Schlüsseltechnologien, über die wir hier sprechen, gehören Next-Generation-Sequencing, CRISPR, Einzelzell-RNA-Sequenzierung und Organanalysemodelle. Sie haben eine harte Figur in Bezug auf die Diagnostik von Standard-Herzkrankheiten, arbeiten und finden eine bessere Behandlung. Mein Protokoll adressiert die Notwendigkeit eines schnellen und spezifischen Nachweises von Acinetobacter baumannii und überwindet Einschränkungen in aktuellen diagnostischen Fragen wie zeitaufwändige und kulturbasierte Techniken.

[Erzähler] Entwerfen Sie zunächst 12 Paar Primer mit Primer-Design-Tools, die auf Standard-Designprinzipien basieren. Besorge dir vier Vorwärts-Primer und drei Rückwärts-Primer, um 12 Primerpaare zusammenzustellen. Bewerten Sie jedes Primerpaar auf Spezifität und Wirksamkeit mit dem Primer-BLAST-Tool des National Center for Biotechnology Information. Entwerfen Sie dann die CRISPR-RNA oder Guide-RNA oder gRNA mit der LbaCas12a CRISPR-RNA-Gerüstsequenz als fixierte Sequenz. Integrieren Sie ein zielspezifisches Segment, das sicherstellt, dass sich das an den Protospacer angrenzende Motiv oder PAM am Fünf-Prime-Ende des nicht-komplementären Strangs befindet. Für die Konstruktion des positiven rekombinanten Plasmids amplifizieren Sie zunächst das Acinetobacter baumannii 16S rDNA-Segment mit den Vorwärts- und Rückwärts-Primer-Sets. Bereiten Sie die 50-Mikroliter-PCR-Reaktionsmischung wie auf dem Bildschirm angegeben vor. Legen Sie die Bedingungen für den PCR-Zyklus auf der PCR-Maschine fest. Nachdem Sie das positive PCR-Produkt gereinigt haben, klonen Sie es in einen PUC57-Vektor, der mit BamHI- und SalI-Enzymen verdaut wurde. Das positive rekombinante Plasmid wird seriell in zehnfachen Schritten mit sterilisiertem, doppelt destilliertem Wasser verdünnt. Lagern Sie das verdünnte Plasmid bei minus 20 Grad Celsius für weitere Experimente. Mischen Sie anschließend den primerfreien Rehydrationspuffer, die Vorwärts- und Rückwärtsprimer von A. baumannii und doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Endvolumen von 465 Mikrolitern. Die Mischung ist vortexen und kurz geschleudert, bevor sie in Enzymreaktionsröhrchen aus dem RPA-Kit umgefüllt wird. Gründlich mischen und 25 Mikroliter 280 millimolares Magnesiumacetat hinzufügen. Als nächstes pipettieren Sie einen Mikroliter des positiven rekombinanten Plasmids, das 10⁷ Kopien pro Mikroliter enthält, mit verschiedenen Primerpaaren in Lösung A. Inkubieren Sie die Lösung 20 Minuten lang bei 39 Grad Celsius. Anschließend reinigen Sie die amplifizierten Produkte mit einem RPA-Aufreinigungskit. Lassen Sie das gereinigte Produkt 10 Minuten lang auf einem 1%igen Agarosegel bei 120 Volt laufen, um das Primerpaar mit der hellsten und breitesten Bande zu identifizieren. Um das RPA-Amplifikationssystem zu optimieren, halten Sie die Konzentrationen aller anderen Reaktionskomponenten konstant, während Sie das Endvolumen von Lösung A auf 465 Mikroliter einstellen. Fügen Sie dann geeignete Mengen RNA-freies, doppelt destilliertes Wasser hinzu, um die endgültigen Primerkonzentrationen wie angegeben zu erhalten, und inkubieren Sie. Ermitteln Sie nach der Reinigung und Elektrophorese des RPA-Produkts die optimale Primerkonzentration und Inkubationszeit durch Analyse der Bandenintensität und -verteilung. Zur Herstellung von Lösung B mischen Sie den einzelsträngigen DNA-Reporter, den CAST12a-Reaktionspuffer, die CRISPR-RNA CAST12a und das doppelt destillierte Wasser zu einem Endvolumen von 15 Mikrolitern. Geben Sie fünf Mikroliter des Rekombinase-Polymerase-Amplifikations- oder RPA-Produkts in Lösung B. Mischen Sie es gründlich, bis es homogen ist. Geben Sie die Proben in ein quantitatives Fluoreszenz-PCR-Instrument. Für Spezifitätstests erhalten Sie DNA-Templates von verschiedenen Spezies mit einem DNA-Extraktionskit oder durch Kochen von Bakterien in Wasser. Verwenden Sie Wasser als Negativkontrolle. 10 Nanogramm oder ein Mikroliter der DNA-Templates werden in Lösung A überführt, die Vorwärts- und Rückwärtsprimer enthält. Pipettieren Sie dann 25 Mikroliter 280 millimolares Magnesiumacetat. Gründlich mischen und bei 39 Grad Celsius 20 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation werden fünf Mikroliter des Reaktionsprodukts zu Lösung B gegeben und gemischt. Legen Sie die Proben in ein quantitatives Fluoreszenz-PCR-Instrument. Stellen Sie den Kanal auf FAM und lesen Sie das Fluoreszenzsignal jede Minute bei 39 Grad Celsius für insgesamt 60 Minuten. Für die Bewertung der Sensitivität der RPA-CRISPR CAST12a-basierten Detektionsplattform verwenden Sie ein positives rekombinantes Plasmid, das auf Konzentrationen von einem bis 10⁷ Kopien pro Mikroliter verdünnt ist, als Vorlage für die Reaktion. Verwenden Sie Wasser als Negativkontrolle. Übertragen Sie das Plasmid auf Lösung A, fügen Sie Magnesiumacetat hinzu und inkubieren Sie, wie zuvor gezeigt. Nach der Inkubation und dem Transfer in Lösung B das Fluoreszenzzeichen ablesenal. Das Primerpaar F3-R3 wurde als das effektivste für die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation identifiziert und zeigte die hellsten und dichtesten Banden in der Agarose-Gelelektrophorese. Die optimale Primerkonzentration für die Amplifikation wurde mit 0,44 Mikromolar bestimmt, und die optimale Reaktionszeit betrug 20 Minuten. Die Fluoreszenzintensität von CRISPR-RNA1 nahm im Laufe der Zeit zu, während dies bei CRISPR-RNA2 nicht der Fall war, was zur Selektion von CRISPR-RNA1 für den Nachweis von A. baumannii führte. Die Spezifitätsanalyse bestätigte, dass das A. baumannii-Detektorsystem ausschließlich A. baumannii-DNA detektierte, während bei anderen bakteriellen DNA-Proben keine Fluoreszenz beobachtet wurde. Das System konnte bereits eine Kopie pro Mikroliter DNA nachweisen und ist damit hochempfindlich. Der Lateral-Flow-Strip-Assay bestätigte die hohe Spezifität der Nachweismethode und zeigte keine Kreuzreaktivität mit anderen Bakterienarten. Der A. baumannii-Assay konnte DNA über Verdünnungsgrade von 10⁷ Kopien pro Mikroliter bis zu einer einzigen Kopie pro Mikroliter nachweisen, was seine Robustheit unter UV-Licht bestätigt.