Name: Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Erfahren Sie die multiplexe Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung proteolytischer Spaltung von Kollagen durch Matrix-Metalloproteinasen mit magnetischen Pinzetten. Diese hochparallele Methode liefert kinetische Parameter.

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Diese Arbeit wurde von der Burroughs Wellcome Career Award in der Scientific Interface (ARD), die National Institutes of Health durch New Innovator des NIH Regiepreis Programm 1-DP2-OD007078 (ARD), die William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA unterstützt ) und der Stanford Cardiovascular Institute Jüngere Promotionsstipendium (JC). Die Autoren danken James Spudich für das Ausleihen Mikroskopie Ausrüstung.

1. Flow Cell Preparation <ol><li> Deckgläser (# 1.5, 22x22 mm und 22x40 mm, VWR) werden gereinigt mittels Ultraschall. <ol><li> Fügen Sie die Deckgläser zu einem kleinen Glasbehälter halten können Deckgläser und Montage im Ultraschallbad (siehe Schritt 2). </li><li> Füllen Sie den Behälter mit Isopropanol und beschallen in einem Ultraschallbad für 20 Minuten. </li><li> Entsorgen Sie das Isopropanol und spülen Sie die Deckgläser mit reichlich deionisiertem Wasser durch einen Barnsted MilliQ Apparat oder ein ähnliches Gerät produziert. Füllen Sie den Behälter mit Wasser und beschallen für 20 Minuten. </li><li> Nach der Beschallung, trocknen Sie die Deckgläser in einem Strom von gefilterter, staubfreier Luft. Verwenden Sie nur Deckgläser, die sauber erscheinen (dh keine Flecken). </li><li> Sanft Flamme die Deckgläschen für einige Sekunden, um sie von den verbleibenden Staub und Feuchtigkeit zu reinigen: passieren die Deckgläser durch eine Gasflamme mit einem Bunsenbrenner hergestellt, dabei nicht auf das Deckglas durch übermäßige Hitze verformen. Dieser Schritt entfernt RestflächeVerunreinigungen. </li></ol></li><li> Mit doppelseitigem Klebeband befestigen Sie die zwei Deckgläser zusammen. Schneiden des Bandes ~ 3 cm Länge und 0,3 cm in der Breite. Befestigen Sie das Band auf 22x40 mm Deckglas Verlassen eines 1,6 cm-Kanal in der Mitte. Verwenden Sie eine Pipettenspitze Drücken Sie vorsichtig auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Band ordnungsgemäß eingehalten werden. </li></ol> 2. Magnetische Pinzette Einrichtung und Kalibrierung <ol><li> Magnetische Pinzetten waren Setup mit permanenten Selten-Erd-Magneten wie zuvor beschrieben 10,12. Ein Aluminium-L-Winkel wurde mit einem Durchmesser von 1 mm Pinhole konstruiert und montiert auf einer vertikalen z-Übersetzer (Thorlabs) zu modulieren, die Höhe der Pinzette. Zwei feste seltene-Erden-Magnete wurden an der Halterung auf beiden Seiten des Loches, um die magnetische Falle (1) zu schaffen befestigt. </li><li> DNA-Präparation: DNA aus Lambda-Phage an seinem 5 'und 3' Enden beschriftet mit Biotin und Digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) wurde verwendet, um die MAG kalibrierenmagnetische Pinzette. <ol><li> Mix 50 ul 4 nM λ-DNA mit 2 ul von 40 nM Biotin konjugierte Oligonukleotid und Wärme bei 60 ° C für 10 Minuten. Dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen über 1 Stunde. </li><li> Add-DNA-Ligase nach Angaben des Herstellers und ligieren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. </li><li> In 2 ul von 400 nM Digoxigenin konjugiert Oligonukleotid und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 45 Minuten. </li><li> In 1,5 ul von 10 mM ATP und weiterhin Ligation der Digoxigenin konjugierten Oligonukleotids an die λ-DNA für 3 Stunden. </li><li> Entfernen der überschüssigen Oligonukleotiden und DNA-Ligase unter Verwendung von 100 kDa Spinfilter (Microcon Ultracell YM-100). Insgesamt wurden 1000-fach Puffer Austausch in TE-Puffer ist ausreichend, um die überschüssigen Oligos zu entfernen. Hinweis: Es ist wichtig, nicht zu Schleuderdrehzahlen&gt; 500 xg verwenden, weil es zum Scheren der DNA führen wird. </li><li> Untersuchen einer Probe der DNA über Elektrophorese auf einem 0,7% igen Agarosegel, um sicherzustellen, dass die DNA-is nicht denaturiert oder geschert. </li><li> Messen Konzentration von DNA. Verwendung einer Nanodrop UV-Vis-Spektrometer (Thermo Scientific) wird empfohlen, da die zur Verfügung stehende Probenvolumen kann sehr klein sein. </li></ol></li><li> Bereiten Messzellen, wie in Kapitel 1 beschrieben. </li><li> Für die Befestigung der DNA an die Messzelle, fügen Anti-Digoxigenin-Antikörper (Schaf-IgG, 1 pg mL -1; Roche Bioscience, Mannheim, Deutschland) und lassen Sie es auf der Glasoberfläche für 15 Minuten einzuhalten. </li><li> Passivieren der Oberfläche der Durchflusszelle um nicht-spezifische Anhaften von DNA durch Zugabe von 2 mg ml -1 BSA, 0,1% Tween-20 in 1 × PBS zu verhindern. Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt 2.5. </li><li> In 50 pM von fuctionalized λ-DNA und lassen Sie sie auf das Deckglas für 15 Minuten zu befestigen. </li><li> Auswaschen der überschüssigen DNA mit 1x PBS. </li><li> Fügen Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Perlen (1 um Perlen = 2 pg mL -1; 2,8 um Perlen = 20 pg mL -1 </li><li> Auswaschen der überschüssigen Beads mit 1x PBS. </li><li> Magnetische Pinzette Kalibrierung <ol><li> Bewegen Sie die Permanentmagnete in eine Position, die weit weg von der Probenoberfläche (&gt; 15 mm) ist. </li><li> Den vorbereiteten Flusszelle in das Mikroskop. </li><li> Bewegen Sie die Permanentmagnete in Position über der Messzelle. </li><li> Wählen Sie die Brennebene der λ-DNA-funktionalisierten Kügelchen durch die Konzentration auf den Beads entfernt von den beiden Glasflächen. Die richtige Brennebene ist, in welcher die gewünschten Kügelchen einen hellen Zentrum. </li><li> Nehmen Sie ein Video von Perle Bewegung bei 80 Hz oder höher für 500 Bilder. </li><li> Bewegen Sie den Magneten näher an der Probenoberfläche. Bei Entfernungen über 5 mm, in Schritten von 1 mm bewegen. Für Entfernungen zwischen 1 und 5 mm, in 0,5 mm Schritten zu bewegen. Bei Entfernungen von weniger als 1 mm, 0,25 mm-Schritten verschieben. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.11.5 und 2.11.6 bei jeder neuen Position Magnet. </li><li> Für jeden Datensatzgesetzt ist, verfolgen die Mitte der Kugeln mit Hilfe eines 2D-Gauß-Fit. </li><li> Berechnen Sie die Kraft über Brownschen Schwankungen mit: </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 1"> wobei k B die Boltzmann-T thermische Energie ist, L die Länge der λ-DNA, und &lt;x 2&gt; ist die Varianz der Schwerpunktsposition. <ol start="10"><li> Bestätigen Sie die Richtigkeit der Kräfte, indem Sie die Kraft Berechnung über ein Leistungsspektrum Lorentz-Fit, um das Roll-Off-Frequenz zu finden. Angewandte Kraft auf den Roll-Off-Frequenz, die der Beziehung: </li></ol><img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 2"> Wobei f 0 die Roll-Off-Frequenz ist, ist ein Radius der Wulst und μ ist die Viskosität der Flüssigkeit 12. </li></ol> 3. Collagen Peptide Anbau an Durchflusszellen Um ein konkretes Beispiel für die Anwendung unserer Methodik liefern, beschreiben wir neuere Arbeiten in unserem Labor, die die Proteolyse eines trimeren Kollagen Modell-Peptid charakterisiert. Wir gehen davon aus, dass dieser allgemeine Ansatz im Großen und Ganzen kann an andere Proteine ​​und Polynukleotide angewandt werden. <ol><li> Die Kollagen-Modell Peptid aus einem N-terminalen His-6x-Tag zur Aufreinigung von einem 5x myc-Tag, (GPP) 10 bis Tripelhelixbildung durchzusetzen, das Kollagen α1 gefolgt Reste 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), die die Bildung MMP- 1-Erkennungsstelle, die Foldon Sequenz (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), und einem C-terminalen KKCK zu erleichtern Markierung mit Biotin-Maleimid. Foldon abgeleitet vom T4-Phagen-Protein Fibritin und stabilisiert Kollagen Modell Trimere, wenn entweder den N - oder C-Terminus 13,14. </li><li> Die Kollagen-Peptid und MMP-1 Proteine ​​wurden exprimiert und gereinigt wie zuvor beschrieben 4,15. &lt;/ Li&gt; </li><li> In anti-myc (15 ug ml -1) in die Flußzelle und Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um den anti-myc an die Oberfläche der Durchflusszelle zu befestigen. </li><li> Passivieren der Flußzelle, um die unspezifische Bindung von Proteinen unter Verwendung von 5 mg ml -1 BSA auf die gleiche Weise wie in Schritt 2.5 beschrieben zu verhindern. </li><li> In 150 pM Kollagen-Peptid und lassen Sie ihn an den Antikörper über das myc-Tag für 45 Minuten zu befestigen. </li><li> Auswaschen der überschüssigen Kollagen mit PBS-Puffer. </li><li> Fügen Streptavidin beschichteten superparamagnetischen Perlen (1 um Perlen = 2 pg mL -1 und 2,8 um Perlen = 20 pg mL -1) und es ihnen ermöglichen, auf die Kollagen-Moleküle für 45 Minuten zu befestigen. Die 1 um Kügelchen sollten auf die gewünschte Konzentration in PBS verdünnt werden. Die 3 um Perlen sollten aus der Lösung mit starken Magneten, dann in PBS resolubilisiert getrennt werden. Dieser Prozess sollte 3 Mal wiederholt werden. Wir haben festgestellt, dass dieser Schritt notwendig, GE istt 3 um die Beads an der Oberfläche immobilisierten Kollagen-Peptid zu binden. </li></ol> 4. Force-Proteolyse-Assay <ol><li> Sobald die Flußzelle mit Kollagenpeptid und magnetische Kügelchen montiert, Bild die Durchflusszelle in der Magnetfalle unter niedrigen, ~ 1 pN Kraft. Nach unserer Erfahrung ist eine Subpopulation der Kügelchen manchmal schwach an der Oberfläche in einer nicht-spezifischen Art und Weise haftet. Die Anwendung der bescheidene Kraft sorgt dafür, dass diese Perlen freigesetzt werden. </li><li> In aktivierte Enzym in die Flußzelle. In diesem Fall MMP-1 wurde durch Zugabe von 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric Acetat) und bei 37 ° C für 3 Stunden voraktiviert. Die Aktivierung wurde überprüft durch SDS-PAGE. </li><li> Sobald der Messzelle wird in den magnetischen Pinzette Apparat wieder eingeführt, ein Video überspannt ein paar Sichtfelder, was typischerweise zu mehreren hundert angeschlossenen Perlen. Dies wird t = 0 sein. </li><li> Wiederholen Sie den gleichen Prozess der Aufnahme mehrere Gesichtsfelder (während der Rückkehr to die gleichen Sichtfeld) in regelmäßigen Zeitpunkten, bis alle Perlen lösen oder keine weitere Proteolyse erkennbar ist. </li><li> Kinetische Daten-Analyse <ol><li> Anzahl der Kügelchen in den verschiedenen Bereichen der Ansicht zu verschiedenen Zeitpunkten und Mittelwertbildung ihnen. Normalisieren der Zahl der Raupen durch Teilen der durchschnittlichen Zahl der Raupen zu jedem Zeitpunkt durch die Anzahl der Kügelchen bei t = 0. Dies stellt sicher, dass wir die Preise der Proteolyse aus verschiedenen Experimenten zu vergleichen, weil die absolute Zahl der Perlen von Experiment zu Experiment unterschiedlich sein kann. </li><li> Zeichnen des Verhältnisses als Funktion der Zeit. In diesem Fall passten wir es zu einem exponentiellen Abfall plus einem konstanten. </li></ol><img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung 3"> wobei f (t) das Verhältnis der Perlen gebunden (oder Kollagenmoleküle unproteolyzed) ist, t die Zeit ist, a der Anteil der Perlen von einem Kollagen Haltegurt-befestigt ist, b die Abklingrate Konstante und cist der Anteil der Perlen, die nicht spezifisch gebunden sind. <ol start="3"><li> Das gleiche Experiment wird bei variierenden Kraft und MMP-1-Konzentrationen, um die Wirkung der Kraft auf Kollagen Proteolyse durch MMP-1 aufzuklären wiederholt. </li></ol></li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Das obige Protokoll beschreibt eine neuartige Verwendung von magnetischen Pinzette (Abbildung 1) zur Untersuchung der Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse. Wir kalibrieren die Pinzette für 1 um und 3 um Perlen sowohl mit dem Ausmaß der beobachteten Schwankungen und Brownsche Berechnung des Roll-off-Frequenz bei verschiedenen Magnet-Positionen (Abbildung 2). In den Experimenten Proteolyse Kraft, ist die Einrichtung ähnlich, außer dass die DNA wird mit Kollagen (Abbildungen 3, 4) ersetzt. Die normalisierte Zahl der Raupen verbleibenden kann als Funktion der Zeit, die Proteolyse Sätze (5) zu finden aufgetragen werden, und dieser Prozess kannwiederholt zum Variieren Enzymkonzentrationen und Kräfte. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Schematische Darstellung der magnetischen Falle Kalibrierungsprozess (nicht maßstabsgetreu). Zwei ständige Seltenerd-Magnete erzeugen ein Magnetfeld, das auf dem superparamagnetische Perle zieht. Übersetzen Sie den Magneten nach oben und unten passt die ausgeübte Kraft. Die Perlen werden abgebildet mit einem konventionellen Hellfeld-Mikroskop mit dem Licht, das durch eine Lochkamera zwischen den beiden Magneten Einschub:. Das Bild mit einem 40x Luft Ziels ergreifen. Die scharfen, runden Flecken an den Beads, die an dem Deckglas Oberfläche entsprechen. Die Out-of-focus freistehende Objekte sind Perlen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 2"> 2. Rollen des kalibrierten Kraft als Funktion des Magneten Abstand von der Probenoberfläche für 1 um (links) und 2,8 um (rechts) Kügelchens. Die Daten wurden auf die empirische Funktion passen <img alt="Gleichung4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Gleichung4"> , Wobei x der Abstand von dem Magneten. A = 31,8, b = 5.61, und c = 4,39 für die 1 um Perlen und a = 140, b = 3,10 und c = 1,86 für die Kügelchen 3 um. Diese Werte sind spezifisch für unser spezifisches Instrument und experimentelle Geometrie, und jedes Instrument einzeln kalibriert werden. Die Fehlerbalken stellen an jedem Punkt eine ~ 10% Variabilität aufgebrachte Kraft auf einem Wulst zu Wulst Basis aufgrund der Variabilität der Korngröße. Die Kraft ist proportional zu dem Volumen der Kügelchen und der Wulst Volumen variiert ~ 9% gegenüber dem mittleren (nach Angaben des Herstellers). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Force-Proteolyse-Assay-Setup (nicht maßstabsgetreu). Das Kollagen-Modell Trimer wird auf die Oberfläche des Deckglases über m angebrachtyc / anti-myc-Konjugation. Die Streptavidin-beschichteten superparamagnetischen Perlen sind mit den Kollagen Trimere über eine Biotin-Streptavidin Verknüpfung gebunden ist. Aktivierte MMP-1 schneidet das Kollagen im Laufe der Zeit, so dass die Perlen aus der Oberfläche herauszuziehen und weg von der Brennebene. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. Schematische Karikatur der Proteolyse als Funktion der Zeit. Die Karikatur zeigt eine Stichprobe Sichtfeld im Laufe der Zeit als Proteolyse stattfindet. Im Laufe der Zeit abnehmen MMP-1 schneidet das Kollagen und die Perlen und die sich von der Brennebene unter dem Einfluss des Magnetfeldes. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5. Proteolyse sind abhängig von der angewandten Kraft 16. Dargestellt sind Daten bei 1,0 pN (3 uM MMP-1, schwarz) gesammelt, 6,2 pN (3 uM MMP-1, rot) und 13 pN (0,2 uM MMP-1, MagierNTA). Die Preise der Proteolyse (Fit-Parameter) sind: 0,22 ± 0,02 min -1 (1 pN), 0,46 ± 0,09 min -1 (6,2 pN) und 2,08 ± 0,18 min -1 (13 pN). Der Anteil der Perlen bei lange Punkten (&gt; 15 Minuten) unproteolyzed bleibt etwa konstant bei ~ 0,25 in verschiedenen Experimenten. Fehlerbalken der Poisson-Statistik spiegelt die Anzahl der Beobachtungen zu jedem Zeitpunkt entsprechen. Der Fehler zu jedem Zeitpunkt für n Perlen n 1/2. Der Fehler in Anteil der Perlen angebracht wurde durch einen Fehler berechnet propagation.1 um Kügelchen für 1.0 und 6.2 pN pN Experimente und 2,8 um Kügelchen wurden für 13 pN Experimenten verwendet wurden.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt eine neue Verwendung für ein einzelnes Molekül klassischen Technik. Magnetische Pinzetten erlauben mittel-bis High-Throughput-Assays einzelnes Molekül in einer kosteneffizienten Weise. Jedoch, wie alle experimentellen Techniken gibt es Herausforderungen und mögliche Fallstricke. Grenzen der magnetischen Pinzette Im Vergleich zu einer optischen Falle die räumliche und zeitliche Auflösung eines MT Vorrichtung niedrig ist. Darüber hinaus sin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Micro Deckelglas # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Micro Deckelglas # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda-DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc-Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-Aminophenylmercuric Acetate </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotin-Maleimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Biotin markierte Oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Custom Synthesis </td></tr><tr><td> Digoxigenin markierten Oligo </td><td> IDT DNA </td><td> Custom Synthesis </td></tr><tr><td> CollagenPeptid-Gen </td><td> DNA 2,0 </td><td> Custom Synthesis </td></tr><tr><td> MMP-1-cDNA </td><td> Harvard Plasmid-Datenbank </td><td></td></tr><tr><td> z-Übersetzer </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Servoregler für Übersetzer </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

multiplexed einzelmolekül-kraftspektroskopie proteolyse messungen mit magnetischen pinzette

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Die Erzeugung und Detektion von mechanischen Kräften ist ein allgegenwärtiges Aspekt der Zellphysiologie, mit unmittelbarer Relevanz für Krebsmetastasen 1, 2 und Atherogenese Wundheilung 3. In jedem dieser Beispiele, Zellen sowohl üben eine Kraft auf die Umgebung und gleichzeitig enzymatisch Umgestaltung der extrazellulären Matrix (ECM). Die Wirkung von Kräften auf ECM Damit hat sich zu einem Gebiet von großem Interesse wegen seiner wahrscheinlich biologischen und medizinischen Bedeutung 7.4. Einzelmolekül-Techniken wie optische Fallen 8, Rasterkraftmikroskopie 9, 10,11 und magnetische Pinzette können die Forscher die Funktion von Enzymen auf molekularer Ebene durch Ausüben von Kräften auf einzelne Proteine ​​zu untersuchen. Dieser Techniken sind magnetische Pinzette (MT) zeichnen sich durch ihre niedrigen Kosten und hohen Durchsatz. MT üben Kräfte im Bereich von ~ 1-100 pN und kann Millisekunde zeitlicher Auflösung liefern,Qualitäten, die gut auf das Studium der Enzym-Mechanismen sind unter der Einzel-Molekül-Ebene 12 angepasst. Hier berichten wir über ein hoch parallelisierbaren MT-Assay um die Wirkung der Kraft auf die Proteolyse einzelner Protein-Moleküle zu studieren. Wir stellen die spezielles Beispiel der Proteolyse eines trimeren Kollagenpeptid von Matrix-Metalloproteinase 1 (MMP-1), aber diese Assay kann leicht angepasst werden, auf andere Substrate und Proteasen zu untersuchen.

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von magnetischen Pinzette, um die Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse auf der Ebene einzelner Moleküle in einem hoch parallelisierbaren Weise zu studieren.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Die Erzeugung und Detektion mechanischer Kräfte ist ein allgegenwärtiger Aspekt der Zellphysiologie mit direkter Relevanz für Krebsmetastasen1, Atherogenese2 ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, den Einfluss mechanischer Belastung auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine auf hochparallelisierte und kosteneffiziente Weise zu untersuchen. In dieser Demonstration wird im ersten Schritt die Spaltung von Kollagen durch Matrix-Metalloproteinasen-1 untersucht: Kollagentrimer werden an die Glasdeckenscheibe einer Durchflusszelle gebunden, gefolgt von der Anheftung von mikrometergroßen magnetischen Kügelchen an die einzelnen Kollagenmoleküle. Im zweiten Schritt wird die Durchflusszelle in die Magnet-Optoden-Apparatur eingesetzt und überprüft, ob unspezifisch gebundene Kügelchen von der Oberfläche der Deckenscheibe entfernt wurden.Anschließend wird die Protease zu den Flusszellen hinzugegeben. Im letzten Schritt wird die Proteolysegeschwindigkeit durch die Echtzeitüberwachung der Ablösung der Kügelchen bestimmt. Durch die Messung der Ablöseraten der Kügelchen bei variierenden Proteasekonzentrationen und Kräften lassen sich unter Verwendung geringster Mengen an Substrat und Protease standardmäßige kinetische Parameter der Enzymkinetik ableiten.Außerdem liefert diese Technik einzigartige Informationen über den Einfluss mechanischer Kräfte auf die Proteolyserate sowie über die strukturellen Veränderungen im Substratprotein, die mit dem Spaltungsvorgang einhergehen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden wie optischen T-Spuren und Rasterkraftmikroskopie besteht darin, dass sie hochdurchsatzfähig und kosteneffizient ist. Obwohl diese Methode Einblicke in die wirksame Kraft bei der proteolytischen Spaltung einzelner Proteine ermöglicht, können die verwendeten Geräte und Techniken auf ein breites Spektrum biophysikalischer Fragestellungen angewendet werden, einschließlich des Einflusses mechanischer Kräfte auf die Proteinfaltung und Konformation.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Flusszelle, indem Sie Deckgläser durch Beschallung reinigen. Geben Sie die Deckgläser in einen kleinen Glasbehälter, der sie aufnehmen kann und in den Ultraschallbadbehälter passt. Füllen Sie den Behälter mit Isopropanol und behandeln Sie ihn 20 Minuten im Ultraschallbad, anschließend entfernen Sie das Isopropanol und spülen die Deckgläser mit reichlich entionisiertem Wasser ab.Füllen Sie den Behälter mit Wasser und behandeln Sie ihn 20 Minuten lang mit Ultraschall. Trocknen Sie die Deckgläser nach der Beschallung in einem Strom gefilterter, staubfreier Luft. Prüfen Sie die Deckgläser und verwenden Sie nur diejenigen, die frei von Verschmierungen sind.Erhitzen Sie die Deckgläser vorsichtig einige Sekunden lang, um verblebenden Staub und Feuchtigkeit zu entfernen, indem Sie die Deckgläser durch eine Gasflamme eines Bunsenbrenners führen. Achten Sie dabei darauf, dass die Deckgläser durch übermäßige Hitze nicht verformt werden. Dieser Schritt entfernt restliche Oberflächenkontaminationen.Als Nächstes verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die beiden Deckgläser miteinander zu verbinden. Schneiden Sie zunächst ein etwa drei Zentimeter langes und 0,3 Zentimeter breites Stück Klebeband zu und befestigen Sie es an einem 22 mal 40 Millimeter großen Deckglas, sodass ein 1,6 Zentimeter breiter Kanal in der Mitte verbleibt. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass das Klebeband ordnungsgemäß haftet.Die Magnetpinzette wurde in diesem Labor mithilfe einer Aluminium-L-Form mit einer ein Millimeter durchmessenden Pinhole hergestellt und auf einem vertikalen Z-Translator montiert, um die Höhe der Pinzette zu regulieren. Zwei permanente Seltenerd-Magnete wurden beidseits der Pinhole am Halter befestigt, um den magnetischen Feldgradienten zu erzeugen. Eine korrekte Kalibrierung der magnetischen Falle ist für dieses Verfahren unerlässlich.Um den Erfolg sicherzustellen, verwenden wir zwei verschiedene Methoden, wie in diesem Abschnitt beschrieben. Zur Kalibrierung der magnetischen Falle verwenden Sie zuvor präparierte DNA aus dem Lambda-Phagen, die an ihren 5'- und 3'-Enden mit Biotin und Doxygen markiert ist, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um die DNA an die Durchflusszelle zu binden, füllen Sie zunächst die Durchflusszelle mit Anti-Doxygen-Antikörperlösung und lassen den Antikörper 15 Minuten lang an der Glasoberfläche haften.Anschließend wurde die Oberfläche der Durchflusszelle passiviert, um unspezifisches Anhaften von DNA zu verhindern, indem eine BSA-Lösung in die Durchflusszelle gegeben wurde. Beachten Sie, dass für diesen Passivierungsschritt und alle nachfolgenden Schritte das hinzugegebene Reagenzvolumen mindestens zweifach im Vergleich zum Volumen der Durchflusszelle sein sollte. Das Volumen der Durchflusszelle beträgt in dieser Demonstration 75 µL; inkubieren Sie die Durchflusszelle bei Raumtemperatur für 45 Minuten.Nachdem dieser Schritt wiederholt wurde, 50 Pikomolar funktionalisiertes Lambda-DNA zugeben und 15 Minuten lang an die Deckglasoberfläche binden lassen, überschüssiges DNA mit einem Mal XPBS abwaschen. Abschließend streptavidinbeschichtete superparamagnetische Kügelchen hinzufügen und 15 Minuten lang an die immobilisierte DNA binden lassen. In diesem Demonstrationsversuch werden 2,8-Mikrometer-Kügelchen verwendet.Spülen Sie überschüssige Kügelchen mit einem XPBS ab. Führen Sie anschließend die Kalibrierung der magnetischen Pinzette durch, indem Sie die Permanentmagnete an eine Position bewegen, die weit entfernt von der Probenoberfläche ist. Danach platzieren Sie die vorbereitete Durchflusszelle im Mikroskop.Bringen Sie die Permanentmagnete in Position über der Durchflusszelle. Wählen Sie die Fokusebene der mit Lambda-DNA funktionalisierten Kügelchen, indem Sie auf die Kügelchen fokussieren, die sich von beiden Glasoberflächen entfernt befinden. Die korrekte Fokusebene ist die, in der die gewünschten Kügelchen ein helles Zentrum aufweisen.Nehmen Sie ein Video der Bewegung der Perlen auf, das höher als 80 Hertz für 500 Bilder ist. Bewegen Sie den Magneten näher an die Probenoberfläche und nehmen Sie jeweils ein Video der Perlenbewegung an jeder Position auf. Für Abstände jenseits von fünf Millimetern bewegen Sie sich in Ein-Millimeter-Schritten; für Abstände zwischen einem und fünf Millimetern ebenfalls in Ein-Millimeter-Schritten.Bewegen Sie sich in 0,5 Millimeter-Schritten für Distanzen unter einem Millimeter, bewegen Sie sich in 0,25 Millimeter-Schritten. Verfolgen Sie für jeden Datensatz das Zentrum der Kügelchen mithilfe einer 2D-Gauß-Anpassung. Berechnen Sie die Kraft über Brown’sche Fluktuationen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben. Überprüfen Sie die Genauigkeit der Kräfte, indem Sie die Kraftberechnung über eine Lian-Anpassung des Leistungsspektrums prüfen.Um die Abrollfrequenz zu bestimmen, kann der Zusammenhang zwischen der angelegten Kraft und der Abrollfrequenz im Text vor der Anlagerung des Kollagenpeptids an die Durchflusszellen ermittelt werden, anschließend das Kollagenpeptid sowie das MMP-1-Protein exprimieren und reinigen. Beginnen Sie damit, die Anti-Myc-Antikörper-Lösung der Durchflusszelle hinzuzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur zu inkubieren, um die Bindung der Anti-Myc-Antikörper an die Oberfläche der Durchflusszelle zu ermöglichen. Blockieren Sie die Durchflusszelle, um unspezifische Proteinbindung zu verhindern, mit 5 Milligramm pro Milliliter BSA. Geben Sie 150 Pikomolar Kollagenpeptid hinzu und lassen Sie es 45 Minuten lang über den Myc-Tag an den Antikörper binden.Spülen Sie überschüssiges Kollagen mit PBS-Puffer weg, bevor Sie 2,8-Mikrometer-Kügelchen der Durchflusszelle hinzufügen. Diese sollten mithilfe starker Magnete von der Strep-Divid- und der beschichteten Kügelchenlösung getrennt und anschließend in PBS resuspendiert werden. Dieser Vorgang sollte dreimal wiederholt werden.Dieser Schritt ist entscheidend, damit die 2,8-Mikrometer-Kügelchen an die immobilisierte Kollagenpeptidoberfläche binden. Danach Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Kügelchen hinzufügen und 45 Minuten lang an die Kollagenmoleküle andocken lassen. Sobald die Durchflusszelle mit Kollagenpeptid und magnetischen Kügelchen bestückt ist, die Zelle im magnetischen Fallen-Setup abbilden.Unter geringer Kraft wirkt eine Teilpopulation der Kügelchen manchmal schwach und haftet unspezifisch an der Oberfläche. Die Anwendung einer mäßigen Kraft stellt sicher, dass diese Kügelchen gelöst werden. Geben Sie das aktivierte Enzym in die Durchflusszelle.In diesem Fall wurde MMP-1 durch Zugabe von 3,5 Millimolar A PMA voraktiviert und bei 37 Grad Celsius für drei Stunden inkubiert. Sobald eine Flusszelle wieder in die Magnet-Force-Messapparatur eingeführt wird, zeichnen Sie ein Video auf, das mehrere Sichtfelder umfasst, wodurch typischerweise mehrere hundert angeheftete Perlen erhalten werden. Diese Messung entspricht der Zeit gleich null.Wiederholen Sie denselben Vorgang der Aufnahme mehrerer Blickfelder zu regelmäßigen Zeitpunkten, bis alle Kügelchen abgelöst sind oder keine weitere Proteolyse erkennbar ist. Magnetische Pinzetten wurden für Kügelchen mit einem Mikrometer und 2,8 Mikrometern kalibriert. Unter Verwendung sowohl der Größe der beobachteten brownschen Fluktuationen als auch der Berechnung der Roll-off-Frequenz bei variierenden Magnetpositionen in den Experimenten zur erzwungenen Proteolyse kann die normalisierte Anzahl verbleibender Kügelchen als Funktion der Zeit aufgetragen werden, um die Proteolyserate zu bestimmen.Und dieser Prozess kann für unterschiedliche Enzymkonzentrationen und Kräfte wiederholt werden. Die Proteolyseraten hängen von der aufgebrachten Kraft ab. Die Raten der Proteolyse wurden bei einem Pico-Newton, 6,2 Pico-Newton und 13 Pico-Newton bestimmt.Der Anteil der unpro behafteten Perlen liegt bei mehr als 15 Minuten und bleibt über verschiedene Experimente hinweg mit etwa 0,25 annähernd konstant. In unserem Fall ermöglichte uns der Assay, die katalytische Effizienz von MMP1 als Funktion der aufgebrachten Kraft zu messen. Durch die Analyse der Daten fanden wir heraus, dass die Kollagentripelhelix lokal entwunden sein muss, bevor eine Proteolyse stattfinden kann.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden. Es ist wichtig zu beachten, dass mindestens 30 bis 50 Kügelchen pro Bildfeld erforderlich sind, um eine gute statistische Signifikanz Ihrer Daten zu erzielen. Vergessen Sie nicht, dass PMA äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborkittel und Atemschutzmaske stets getragen werden sollten, während dieses Experiment durchgeführt wird.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Einfluss von Kraft auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine mithilfe magnetischer Pinzetten messen kann. Die magnetischen Pinzetten sind ein hervorragendes Werkzeug, um Einzelmolekül-biophysikalische Experimente zu verstehen. Diese Technik kann auf andere Protease-Substrat-Kombinationen erweitert werden.Außerdem können ähnliche Techniken verwendet werden, um die strukturelle Dynamik von Proteinen sowie andere Proteine, die RNA und/oder DNA binden oder modifizieren, zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Magnetische Pinzette, ein leistungsfähiges Einzelmolekül-Manipulation Technik kann für die direkte Messung der Verdrehung angepasst werden (unter Verwendung einer Konfiguration mit der Bezeichnung frei umlaufenden magnetischen Pinzette) und Drehmoment (mit einer Konfigurations bezeichnet magnetischen Drehmoment Pinzette) in biologischen Makromolekülen. Richtlinien zur Durchführung solcher Messungen gegeben sind, einschließlich Anwendungen auf die Untersuchung von DNA und zugehörige...

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.

Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung

Dieses Protokoll stellt einen vollständigen experimentellen Workflow für die Untersuchung von RNA-Protein-Interaktionen mit optischen Pinzetten dar. Mehrere mögliche Versuchsanordnungen werden skizziert, einschließlich der Kombination von optischen Pinzetten mit konfokaler Mikroskopie.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Hier beschreiben wir eine magnetische Hochgeschwindigkeitspinzette, die nanomechanische Messungen an kraftsensitiven Biomolekülen mit einer maximalen Rate von 1,2 kHz durchführt. Wir stellen seine Anwendung auf DNA-Haarnadeln und SNARE-Komplexe als Modellsysteme vor, aber es wird auch auf andere Moleküle anwendbar sein, die an mechanobiologischen Ereignissen beteiligt sind.

Hochgeschwindigkeits-Magnetpinzette für nanomechanische Messungen an kraftempfindlichen Elementen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung einer magnetischen Einzelmolekülpinzette zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen telomeren DNA-bindenden Proteinen (Telomer-Repeat-Bindungsfaktor 1 [TRF1] und TRF2) und langen Telomeren, die aus menschlichen Zellen extrahiert wurden. Es beschreibt die Vorbereitungsschritte für Telomere und telomerische Repeat-Bindungsfaktoren, die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten sowie die Methoden der Datenerhebung und -analyse.

Analyse telomerer Protein-DNA-Wechselwirkungen mit einer magnetischen Einzelmolekülpinzette

Wir veranschaulichen die Verwendung eines axialen optischen Pinzetten-Systems mit konstanter Kraft, um die mechanischen Eigenschaften kurzer DNA-Moleküle zu untersuchen. Durch axiales Dehnen der DNA minimieren wir sterische Behinderungen und Artefakte, die bei herkömmlicher lateraler Manipulation auftreten, und können so DNA-Moleküle von etwa 100 nm Länge untersuchen.

Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Ein Verfahren, um die Persistenzlänge oder Biegesteifigkeit von Biopolymeren messen beschrieben. Das Verfahren verwendet eine Kinesin-Mikrotubulus angetriebenen Gleitflug Assay experimentell die Persistenzlänge einzelner Mikrotubuli und ist anpassbar an Aktin-basierten Assays Gleiteigenschaften.

Biegesteifigkeit Maße von Biopolymeren mit Gliding Assays

Cellulosomen sind Multienzymkomplexe, die für die Verdauung von Zellulose entwickelt wurden. AFM-basiertes SMFS wurde verwendet, um die mechanischen Eigenschaften und die Faltungskonfiguration von Cellulosom-assoziierten Proteinanordnungen zu untersuchen. Wir präsentieren einen vollständigen Workflow für die Immobilisierung, Datenerfassung und Datenanalyse von Proteinen, um die Wechselwirkungen einzelner Rezeptor-Liganden-Komplexe zu untersuchen, die an der Assemblierung von Cellulosomen...

Untersuchung von Rezeptor-Liganden-Systemen des Cellulosom mit AFM-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Erfahren Sie die multiplexe Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zur Untersuchung proteolytischer Spaltung von Kollagen durch Matrix-Metalloproteinasen mit magnetischen Pinzetten. Diese hochparallele Methode liefert kinetische Parameter.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

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