Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Einfluss mechanischer Belastung auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine auf hochparallele und kostengünstige Weise zu untersuchen. In dieser Demonstration wird die Spaltung von Kollagen durch Matrix-Metalloproteinase eins untersucht. Im ersten Schritt werden Kollagentrimmer auf dem Glasdeckglas einer Durchflusszelle befestigt, gefolgt von der Anbringung von mikrometergroßen magnetischen Kügelchen an den einzelnen Kollagenmolekülen. Der zweite Schritt besteht darin, die Durchflusszelle in die magnetische Pinzette einzubauen und zu überprüfen, ob unspezifisch angebrachte Kügelchen von der Deckglasoberfläche entfernt wurden.

Als nächstes wird die Protease zu den Durchflusszellen gegeben. Der letzte Schritt besteht darin, die Proteolyserate zu bestimmen, indem die Beadablösung in Echtzeit überwacht wird. Durch die Messung der Bead-Ablösungsraten bei unterschiedlichen Proteasekonzentrationen und -kräften ist es möglich, aus kleinsten Mengen an Substrat und Protease zoologische Standardparameter abzuleiten.

Darüber hinaus liefert diese Technik einzigartige Informationen über die Wirkung mechanischer Kraft auf die Proteolyserate und auf die strukturellen Veränderungen im Substratprotein, die mit der Spaltung einhergehen. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Methoden wie optischen T-Spuren und Rasterkraftmikroskopie besteht darin, dass diese Technik einen hohen Durchsatz aufweist und kostengünstig ist. Obwohl diese Methode einen Einblick in die effektive Kraft auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine geben kann, können die Instrumente und Techniken auf ein breites Spektrum biophysikalischer Probleme angewendet werden, einschließlich der Wirkung der Kraft auf die Proteinfaltung und -bestätigung.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Durchflusszellen, indem Sie die Deckgläser mit Ultraschall reinigen. Legen Sie die Deckgläser in einen kleinen Glasbehälter, der sie aufnehmen kann und in den Ator passt. Füllen Sie den Behälter mit Isopropanol und beschallen Sie es in einem Badeapparat 20 Minuten lang, bevor Sie das Isopropanol verwenden, und spülen Sie die Deckgläser mit reichlich deionisiertem Wasser aus.

Füllen Sie den Behälter mit Wasser und beschallen Sie ihn 20 Minuten lang. Nach der Beschallung gleitet die Abdeckung in einen Strom gefilterter, staubfreier Luft. Überprüfen Sie die Deckgläser und verwenden Sie nur solche, die frei von Flecken sind.

Flammen Sie die Eindeckeinlagen einige Sekunden lang vorsichtig ab, um sie von Staub und Feuchtigkeit zu reinigen, indem Sie die Abdeckung passieren. Schlüpft durch eine Gasflamme, die von einem Bunsenbrenner erzeugt wird, wobei darauf zu achten ist, dass sich das Deckglas nicht durch übermäßige Hitze verzieht. In diesem Schritt werden verbleibende Oberflächenverunreinigungen entfernt.

Verwenden Sie als Nächstes doppelseitiges Klebeband, um die beiden Abdeckfolien miteinander zu verbinden. Indem Sie das Klebeband zunächst etwa drei Zentimeter lang und 0,3 Zentimeter breit zuschneiden, befestigen Sie das Band an einem 22 x 40 Millimeter großen Deckglas, wobei Sie in der Mitte einen 1,6 Zentimeter großen Kanal lassen. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf den Deckglas, um sicherzustellen, dass das Klebeband richtig haftet.

Die magnetische Pinzette wurde von diesem Labor unter Verwendung einer Aluminium-L-Halterung mit einer Lochblende von einem Millimeter konstruiert und auf einem vertikalen Z-Übersetzer montiert, um die Höhe der Pinzette zu modulieren. Zwei permanente Seltenerdmagnete wurden an der Halterung auf beiden Seiten der Lochblende befestigt, um den Magnetfeldgradienten zu erzeugen. Die richtige Kalibrierung der Magnetfalle ist für dieses Verfahren unerlässlich.

Um den Erfolg zu gewährleisten, verwenden wir zwei verschiedene Methoden, die in diesem Abschnitt beschrieben werden. Zur Kalibrierung der Magnetfalle Verwenden Sie für die Kalibrierung zuvor präparierte DNA von Lambda-Phagen, die an ihren fünf Primzahlen und drei Primzahlen mit Biotin und Doxygen markiert sind, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Um die DNA zuerst an die Durchflusszelle zu binden, füllen Sie die Durchflusszelle mit Anti-D-Sauerstoff und Antikörperlösung und lassen Sie den Antikörper 15 Minuten lang an der Glasoberfläche haften.

Als nächstes essen Sie die Oberfläche der Durchflusszelle, um ein unspezifisches Anhaften der DNA zu verhindern, indem Sie der Durchflusszelle eine BSA-Lösung hinzufügen. Es ist zu beachten, dass für diesen und alle nachfolgenden Schritte das der Durchflusszelle zugesetzte Reagenzvolumen mindestens das Doppelte betragen sollte. Das Volumen der Durchflusszelle, das in dieser Demonstration 75 Mikroliter beträgt, inkubiert die Durchflusszelle 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Nachdem Sie diesen Schritt wiederholt haben, fügen Sie 50 Pico-Molar funktionalisierter Lambda-DNA hinzu und lassen Sie sie 15 Minuten lang am Deckglas haften, waschen Sie überschüssige DNA mit einem XPBS ab. Fügen Sie zum Schluss mit Streptavidin beschichtete superparamagnetische Kügelchen hinzu und lassen Sie sie 15 Minuten lang an der immobilisierten DNA haften. In dieser Demonstration werden 2,8 Mikrometer große Kügelchen verwendet.

Überschüssige Kügelchen mit einem XPBS abwaschen. Führen Sie als Nächstes die Kalibrierung der magnetischen Pinzette durch, indem Sie die Permanentmagnete an eine Position bringen, die weit von der Probenoberfläche entfernt ist. Legen Sie dann die vorbereitete Durchflusszelle in das Mikroskop.

Bringen Sie die Permanentmagnete in Position über der Durchflusszelle. Wählen Sie die Brennebene der funktionalisierten Lambda-DNA-Kügelchen, indem Sie sich auf die Kügelchen konzentrieren, die von beiden Glasoberflächen entfernt sind. Die richtige Fokusebene ist eine, in der die gewünschten Kügelchen ein helles Zentrum haben.

Nehmen Sie ein Video von einer Perlenbewegung auf, bei der 80 Hertz für 500 Bilder größer sind. Bewegen Sie den Magneten näher an die Probenoberfläche und nehmen Sie ein Video der Perlenbewegung an jeder Position auf. Bei Abständen über fünf Millimetern bewegen Sie sich in Schritten von einem Millimeter für Abstände zwischen einem und fünf Millimetern.

Bewegen Sie sich in Schritten von 0,5 Millimetern für Entfernungen von weniger als einem Millimeter, bewegen Sie sich in Schritten von 0,25 Millimetern Verfolgen Sie für jedes Dataset die Mitte der Perlen mit einer 2D-Gaußschen Anpassung. Berechnung der Kraft über Brownsche Fluktuationen, wie im schriftlichen Verfahren beschrieben. Bestätigen Sie die Genauigkeit der Kräfte, indem Sie die Kraftberechnung über eine Leistungsspektrum-Lian-Anpassung überprüfen.

Um die Abrollfrequenz zu ermitteln, kann die Beziehung zwischen aufgewendeter Kraft und Abrollfrequenz im Text vor der Bindung des Kollagenpeptids an Flusszellen gefunden werden, das Kollagenpeptid exprimieren und die MMP 1-Proteine exprimieren und reinigen. Beginnen Sie mit der Zugabe der Anti-Mikrofon-Antikörperlösung in die Durchflusszelle und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit sich das Anti-Mikrofon an der Oberfläche der Durchflusszelle anlagern kann. Essen Sie die Flusszelle, um eine unspezifische Bindung von Proteinen zu verhindern, indem Sie fünf Milligramm pro Milliliter verwenden. BSA Fügen Sie 150 picomolares Kollagenpeptid hinzu und lassen Sie es 45 Minuten lang über den M-Tag an den Antikörper binden.

Waschen Sie überschüssiges Kollagen mit PBS-Puffer ab, bevor Sie 2,8-Mikrometer-Kügelchen in die Durchflusszelle geben. Sie sollten mit starken Magneten von der Streptokokken-Teilung und der beschichteten Bead-Lösung getrennt und dann in PBS resuspendiert werden. Dieser Vorgang sollte dreimal wiederholt werden.

Dieser Schritt ist wichtig, damit die 2,8-Mikrometer-Kügelchen an das oberflächenimmobilisierte Kollagenpeptid binden. Fügen Sie als nächstes mit Streptokokken dividierte Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Kügelchen hinzu und lassen Sie sie 45 Minuten lang an den Kollagenmolekülen haften. Sobald die Durchflusszelle mit Kollagenpeptid und magnetischen Kügelchen zusammengebaut ist, bilden Sie die Durchflusszelle in der Magnetfalle ab.

Bei geringer Krafteinwirkung ist eine Teilpopulation der Kügelchen manchmal schwach und haftet auf unspezifische Weise an der Oberfläche. Die Anwendung von bescheidener Kraft sorgt dafür, dass diese Perlen freigesetzt werden. Geben Sie aktiviertes Enzym in die Durchflusszelle.

In diesem Fall wurde MMP one durch Zugabe von 3,5 Millimolar A PMA voraktiviert und drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubiert. Sobald eine Durchflusszelle wieder in die magnetische Pinzette eingeführt wird, nehmen Sie ein Video auf, das sich über einige Sichtfelder erstreckt und in der Regel mehrere hundert angehängte Kügelchen ergibt. Diese Messung entspricht der Zeit, die gleich Null ist.

Wiederholen Sie den gleichen Vorgang, indem Sie mehrere Sichtfelder zu regelmäßigen Zeitpunkten aufzeichnen, bis sich alle Kügelchen ablösen oder keine weitere Proteolyse mehr erkennbar ist. Die magnetische Pinzette wurde für Ein-Mikrometer- und 2,8-Mikrometer-Kügelchen kalibriert. Sowohl unter Verwendung der Größe der beobachteten Brownschen Fluktuationen als auch der Berechnung der Abrollfrequenz an unterschiedlichen Magnetpositionen in den forcierten Proteolyse-Experimenten kann die normierte Anzahl der verbleibenden Kügelchen als Funktion der Zeit aufgetragen werden, um die Proteolyserate zu ermitteln.

Und dieser Vorgang kann für unterschiedliche Enzymkonzentrationen und -kräfte wiederholt werden. Die Proteolyseraten hängen von der aufgewendeten Kraft ab. Die Proteolyseraten wurden mit einem Pico-Newton, 6,2 Pico-Newton und 13 Pico-Newton bestimmt.

Der Anteil der unpro-Beads liegt bei mehr als 15 Minuten, bleibt über verschiedene Experimente hinweg annähernd konstant bei 0,25. In unserem Fall ermöglichte uns der Assay, die katalytische Effizienz von MMP one in Abhängigkeit von der aufgewendeten Kraft zu messen. Bei der Analyse der Daten fanden wir heraus, dass sich die Kollagen-Dreifachhelix vor der Proteolyse lokal abwickeln muss.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass mindestens 30 bis 50 Perlen pro Treibstoff der Ansicht erforderlich sind, um eine gute statistische Signifikanz Ihrer Daten zu erhalten. Vergessen Sie nicht, dass ein PMA extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe, Laborkittel und Gesichtsmaske bei der Durchführung dieses Experiments immer getroffen werden sollten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Wirkung der Kraft auf die proteolytische Spaltung einzelner Proteine mit einer magnetischen Pinzette messen kann. Die magnetische Pinzette ist ein großartiges Werkzeug, um biophysikalische Experimente mit einzelnen Molekülen zu verstehen. Diese Technik kann auf andere Protease- und Substratkombinationen ausgeweitet werden.

Darüber hinaus können ähnliche Techniken verwendet werden, um die strukturelle Dynamik von Proteinen sowie andere Proteine zu verstehen, die RNA und/oder DNA binden oder modifizieren.