Name: Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Bewertung plazentagezielter Arzneimittelverabreichung mit In-vivo-Bildgebung, Hochfrequenzultraschall und HPLC. Diese Technik ermöglicht präzise biochemische Messungen für die Nanomedizin.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Nationalstiftung für Naturwissenschaften (81771617) und der naturwissenschaftlichen Grundlage der Provinz Guangdong (2016A030313178) an X.F. vergeben; einen Zuschuss von Shenzhen Grundlagenforschungsfonds (JCYJ20170413165233512) an X.F vergeben; und die Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menschliche Entwicklung der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R01HD088549 (der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Blick auf die National Institutes of Health), N.N.

Alle Maus Experimente strikt befolgt Protokolle (SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232) genehmigt durch das Animal Care und Nutzung Ausschuss von Shenzhen Institute of Advanced Technology, chinesische Akademie der Wissenschaften.
1. Synthese von Plazenta Chondroitinsulfat A gezielte Lipid-Polymer Nanopartikeln
<ol><li>MTX und ICG geladen Lipid-Polymer Nanopartikel zu synthetisieren (MNPs und INPs bzw.) und PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel (PlCSA-MNPs und PlCSA-INPs), wie in beschrieben ausführlich an anderer Stelle18.</li>
</ol>2. in Vivo Fluoreszenz Imaging
<ol><li>
Vorbereitung von schwangeren Mäusen
	<ol>
<li>Weibliche Mäusen CD-1 (8-12 Wochen) mit einem fruchtbaren Männchen der gleichen Sorte in einem Käfig zu platzieren (männlich: weiblich = 1:2) am Nachmittag und Überprüfung der vaginalen Stecker folgende Morgen. Wenn ein vaginale Stecker zu beobachten ist, definieren Sie die Maus als embryonale Tag 0,5 (E0.5).</li>
		<li>Schwanger Hausmäuse allein in einem Pathogen-freies Tier Raum mit einem 14 h Licht/10 h Dunkel-Zyklus und bieten Ihnen kostenfreien Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser bis E14.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intravenöse Injektion von Nanopartikeln
	<ol>
<li>Sterilisieren Sie vor dem Eingriff die Nanopartikel durch Filtration durch einen 0,22-μm-Spritze-Filter. Wiegen Sie die schwangere Maus bei E11.5, die Menge und Nanopartikel Injektionsvolumen bestimmen. Hinweis: Die Nanopartikel Injektionsvolumen sollte weniger als 1 % (Volumen/Gewicht) des Körpergewichts der schwangeren Maus. Zum Beispiel sollte das Injektionsvolumen Nanopartikel weniger als 0,25 mL in einem 25 g-Maus.</li>
		<li>Um die Rute Vene erweitern, wärmen Sie die Rute für ca. 5-10 min mit einem Heizkissen.</li>
		<li>Aspirieren Sie vor der Injektion INPs oder PlCSA-INPs in eine 28 g Insulin Spritze.</li>
		<li>Übertragen Sie die schwangere Maus an einer Haltevorrichtung, die die Maus gleichzeitig Zugriff auf die Rute Vene zurückhält. Reinigen Sie das Heck mit einem Alkoholtupfer. Dann legen Sie die Spritze in die Vene Schweif. Langsam injizieren die INPs oder PlCSA-INPs (5 mg/kg ICG Äquivalent) mit gleichmäßigem Druck über 5-10 s. Hinweis: Wenn eine Blase am Heck erscheint, weil dieses Ergebnis zeigt, dass die Nadel nicht in die Vene injizieren zu stoppen. Spritzen sollte zwischen Mäusen, die Übertragung von Krankheiten zu minimieren und Cross-Kontamination nicht weitergegeben werden.</li>
		<li>Notieren Sie die Einspritzzeit. Unterdessen üben Sie sanften Druck auf die Injektionsstelle bis die Blutung aufhört, dauert in der Regel 30-60 s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
In-Vivo Bildgebung
	<ol>
<li>30 min nach der Injektion Bild der schwangeren Mäusen mit Hilfe der Fluoreszenz in-Vivo imaging-System.</li>
		<li>Die schwangere Mäuse mit einer Sauerstoff-Durchflussmenge von 1,0 L/min und Isofluran bei 2-4 % in eine zugehörige Kammer des Referats Anästhesie zu betäuben und Vollnarkose durch langsame und regelmäßige Atmung zu überprüfen. Dann verschieben Sie sie in die bildgebenden Kammer. Legen Sie die narkotisierten schwangeren Mäusen in der bildgebenden Kammer Tierhaltung in Rückenlage.</li>
		<li>Platzieren Sie ein Prüfkopf über Mund und Nase ermöglichen das Einatmen von 1-2 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Durchflussmenge von 1,0 L/min, Narkose aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Wählen Sie die 2D-Fluoreszenz und fotografischen Parameter zum Bild der ICG-Fluoreszenz-Signale. Legen Sie die Belichtung auf Auto und die Erregung/Emission Wellenlängen, 710/820 nm.</li>
		<li>Am Ende des bildgebenden Verfahrens schalten Sie Isofluran Zustrom, die Narkose zu stoppen, und kehren Sie sorgfältig die schwangere Mäuse in ihren Käfigen.</li>
		<li>48 h nach der Injektion der Nanopartikel, die schwangere Mäuse mit Isofluorane zu betäuben und dann den Damm durch zervikale Dislokation zu opfern. Die Föten und der Plazenta mit Graefe Pinzette, Graefe Gewebe Zange und präparierscheren zu sammeln.</li>
		<li>Legen Sie die Plazenta und die Föten in der bildgebenden Kammer und Bild mit der in Schritt 2.3.4 beschriebenen Methode.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. HFUS Bewertung der embryonalen Entwicklung
<ol><li>
Tiermodelle
	<ol>
<li>Zu erhalten Sie und bereiten Sie die schwangere Mäuse vor, wie unter Punkt 2.1 beschrieben.</li>
		<li>Verwenden Sie HFUS, um Bild schwangeren Mäusen in E 6.5 (Protokolle 3.2 und 3.3.3). Bestätigen Sie zunächst die Schwangerschaft durch die Visualisierung von Embryonen am Tag E6.5, und dann nach dem Zufallsprinzip vergeben die schwangere Mäuse in drei Gruppen: die MNP-Gruppe, PlCSA-MNP-Gruppe und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Gruppe.</li>
		<li>Injizieren Sie PBS, MNPs oder PlCSA-MNPs (1 mg/kg MTX Äquivalent) in die Rute Venen von der schwangeren Mäusen täglich ab E6.5 wie unter Punkt 2.2 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung für die Bildgebung
	<ol>
<li>24 h nach der Injektion von Nanopartikeln, Bild die schwangere Mäuse mit dem HFUS imaging-System.</li>
		<li>Die schwangere Mäuse zu betäuben, wie unter Punkt 2.3.2 beschrieben. Schalten Sie die integrierte Temperaturregelung der imaging Plattform und Heizen Sie die Plattform, um 37-42 ° C. Die schwangere Mäuse in Rückenlage auf der Plattform mit Klebeband zu sichern.</li>
		<li>Ort die bugnase angeschlossenen Anästhesie über die Schnauze. Gelten Sie 2 % Isofluran mit ein Sauerstoff-Durchflussmenge von 1,0 L/min, stetige Narkose aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Chemisch entfernen Sie Haare aus dem Bauch mit einer Enthaarungscreme. Die restliche Sahne gründlich mit Wasser getränkten Gaze tilgen, und dann den Bauch mit akustischen Kopplung Gel bestreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bildgebende Verfahren
	<ol>
<li>Legen Sie die 40 MHz-Schallkopf in den mechanischen Arm.</li>
		<li>Richten Sie die Wandler um längs Bilder des Fötus und Plazenta mit der Region des Interesses liegt in der fokuszone zu erhalten.</li>
		<li>
B-Mode-Darstellung und Analyse Hinweis: Siehe Film 1.<ol>
<li>Klicken Sie auf B-Mode und senken Sie den Schallkopf über den Bauch zu, bis der Fötus und Plazenta ins Blickfeld kommen. Drücken Sie Scan/Freeze zum starten/stoppen imaging, Cine zu speichern drücken Sie zum Speichern des Cine-Loop und Frame zu speichern , um Bilder zu speichern drücken Sie die Taste.</li>
			<li>Klicken Sie auf Messen , Fruchtblase Länge (GS), fetale Rump Kronenlänge (CRL), Biparietal Durchmesser (BPD), Bauch Umfang (AC), Plazenta Durchmesser (PD) und Plazenta Dicke (PT) zu analysieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
PW-Doppler-Bildgebung und Analyse Hinweis: Siehe Film 1.<ol>
<li>Mit dem gleichen Scannen Projektion, klicken Sie auf die Schaltfläche " PW ", stellt die Probenahme Volumen Schachtel in der Mitte der Nabelarterie, und drücken Sie die Taste Scan/Freeze , Bildgebung zu initiieren. Klicken Sie, um Nabelarterie Bilder sammeln Cine speichern .</li>
			<li>Klicken Sie auf Messen , um die Nabelarterie Spitze Geschwindigkeit (UA) zu berechnen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Color Doppler-Modus Bildgebung und Analyse
		<ol>
<li>Mit den gleichen scan-Projektion, klicken Sie auf die Schaltfläche " Farbe " und passen Sie die Position der Wandler um Bilder des fetalen Herzens zu erhalten. Drücken Sie die Taste Scan/Einfrieren , Bildgebung und Cine Speichern , Bilder sammeln zu initiieren.</li>
			<li>Klicken Sie auf Messen , um die fetale Herzfrequenz (HF) zu berechnen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) HPLC-Analytik
<ol><li>
Gewebe-Vorbereitung
	<ol>
<li>Die schwangere Mäuse mit einer Einzeldosis von MNPs oder PlCSA-MNPs (1 mg/kg MTX Äquivalent) am späten Schwangerschaft zu injizieren (zB., E14.5) wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.</li>
		<li>Betäuben Sie nach 24 h die Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von avertin bei 240 μg/Körper-Gewicht (g). Stellen Sie sicher keine Antwort auf eine Prise Fuß um sicherzustellen, dass die Mäuse vollständig betäubt sind.</li>
		<li>Sprühen Sie den Brustbereich mit 75 % Ethanol. Kardiale Perfusion (Schneiden Sie den rechten Herzvorhof und Technologieprodukte durch die linke Herzkammer) durchführen wie zuvor beschrieben im Detail19,20 mit 50 mL eiskaltes 0,9 % Kochsalzlösung für 10 min, ungebundene Nanopartikel zu entfernen.</li>
		<li>Den Damm einschläfern. Führen Sie einen Kaiserschnitt um die Föten und der Plazenta mit Graefe Pinzette, sezieren, Schere und Graefe Gewebe Zange, sammeln und speichern Sie das Gewebe bei-80 ° C vor der Analyse.</li>
		<li>Bereiten Sie die Homogenisierung-Lösung (10 % Perchlorsäure) und halten Sie auf dem Eis. Etwa 200 mg des Gewebes zu sammeln, und jede Probe 500 μL der Homogenisierung Lösung hinzufügen. Homogenisieren der Proben mit einem Homogenisator auf Hochtouren für 30 s, und wiederholen Sie diese Prozedur zweimal.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Filtern Sie den überstand (ca. 300 μL) durch einen 0,45-μm-Spritze-Filter, und übertragen Sie die resultierende Flüssigkeit auf eine HPLC Vials. Probenfläschchen in einem Autosampler Tray für die Injektion zu platzieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Erarbeitung von Normen
	<ol>
<li>Bereiten Sie die folgende Lösung für die mobile Phase: 40 mM Kalium Phosphat Diabas-(pH-Wert 4,5) und Acetonitril (88:12, V/V). Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 μm Pore Größe Spritze Filter und übertragen Sie die resultierende Flüssigkeit auf eine saubere HPLC-Vorratsflasche. Hinweis: Stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M Phosphorsäure. Verwenden Sie Ultraschallschwingungen für 15 min zu entgasen die mobile Phase jedes Mal vorher zu verwenden.</li>
		<li>Wiegen Sie 10 mg MTX in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 1 mL 1 M Natronlauge.</li>
		<li>Vortex: bei hoher Geschwindigkeit, bis die MTX vollständig auflöst. Hinweis: Dies ist der primäre bestand und kann für mehrere Monate bei-20 ° C gelagert werden.</li>
		<li>Erstellen Sie die sekundäre MTX-Lager (500 μg/mL), verdünnen Sie 50 μL der primären Aktien 950 μL der mobilen Phase. Hinweis: Bewahren Sie bis zur Verwendung auf dem Eis, und bereiten Sie täglich frisch. Es ist wichtig, die mobile Phase für die Erarbeitung von Normen zu verwenden, um Spitzen mischen unterschiedliche Lösungen nach probeninjektion infolge zu vermeiden.</li>
		<li>Weitere machen Sie Verdünnungen, die Standards (Tabelle 1) zu schaffen. Speichern Sie die Standards auf Eis und bereiten Sie täglich frisch. Laufen Sie die Standards in Serie mit der experimentellen Proben.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Anzahl</td>
			<td>Endkonzentration (μg/mL)</td>
			<td>Standard, μL 500 μg/mL</td>
			<td>Mobile phase(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>0,5</td>
			<td>1</td>
			<td>999</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>998</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>980</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>50</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>800</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Vorbereiten der Standardkurve für MTX. Die Endkonzentration von MTX Standardlösung ist von 0,5-100 μg/mL.
<ol start="3"><li>
HPLC-Instrumentierung und Betriebsparameter Hinweis: Proben wurden analysiert, auf einem HPLC-System, ausgestattet mit einer Lösungsmittel-Pumpe, eine photometrische UV-Detektor (313 nm), und eine C18-Säule (250 × 4.6 mm, 5 µm Partikelgröße).<ol>
<li>Schalten Sie die HPLC Degasser um Luft aus dem System zu entfernen. Schalten Sie den Fluss, die Spalte mit der mobilen Phase für 30 min zur Grundlinie Lärmreduzierung äquilibrierung.</li>
		<li>Stellen Sie die Temperatur der Spalte auf 25 ° C, injizieren Sie 20 μl Probenvolumen bei einer Durchflussmenge von 1 mL/min zu, und klicken Sie auf der Run-Methode auf, um die Analyse zu starten.</li>
		<li>Wenn die Läufe abgeschlossen sind, ändern Sie manuell die mobile Phase in Acetonitril HPLC-Klasse. Führen Sie für ca. 15 min zum Schutz des Systems. Hinweis: Führen Sie diesen Schritt nach der empfohlenen Laufzeit Schaden auf die Spalte Nichtbeachtung kann.</li>
		<li>Berechnen Sie für die Quantitative Analyse die Peakflächen der standard MTX mit der HPLC-System-Software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+of+Factor+V+Leiden+and+Prothrombin+Gene+Mutation+and+Placenta-Mediated+Pregnancy+Complications%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis+of+Prospective+Cohort+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies.</a> PLOS Medicine. 7 (6), e1000292(2010).</li>
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<li>Parvani, J. G., Gujrati, M. D., Mack, M. A., Schiemann, W. P., Lu, Z. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+%CE%B23+integrin+by+targeted+ECO%2FsiRNA+nanoparticles+inhibits+EMT+and+metastasis+of+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Silencing β3 integrin by targeted ECO/siRNA nanoparticles inhibits EMT and metastasis of triple-negative breast cancer.</a> Cancer Research. 75 (11), 2316-2325 (2015).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+doxorubicin+by+CSA-binding+nanoparticles+for+choriocarcinoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment.</a> Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).</li>
<li>Jenkins, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+%28BLI%29+to+improve+and+refine+traditional+murine+models+of+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).</li>
<li>Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+safety+considerations+of+nanoparticle-mediated+drug+delivery+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy.</a> Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).</li>
</ol>

X.F. und B.Z sind Erfinder auf Patentanmeldung PCT/CN2017/108646 eingereicht von SIAT, die eine Plazenta-spezifische Medikament Übermittlungsmethode abdeckt und deren Anwendung. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

In diesem Manuskript beschreiben wir ein drei-Methode-System zur Feststellung, ob PlCSA-BP-geführte Nanopartikel ein wirksames Instrument sind für die Abgabe von Medikamenten, die Plazenta-targeting. Die Verwendung von in-Vivo Bildgebung zur Überwachung der Infrarot-ICG Fluoreszenzsignal bestätigt die plazentale targeting Spezifität der PlCSA BP. Using HFUS und HPLC, wir zeigten, dass PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel MTX effizient nur zu liefern kann die Plazenta-Zellen, nicht für den Fötus.
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Plazenta-vermittelten schwangerschaftkomplikationen, einschließlich Pre-Eclampsia, schwangerschaftverlust, plazentaren Abbrechens und kleine gestational Alter (SGA), sind häufig und führen zu erheblichen fetalen und mütterlichen Morbidität und Mortalität1,2, 3, und sehr wenige Medikamente erwiesen sich als wirksam für die Behandlung von Schwangerschaft4,5Störungen. Die Entwicklung von Strategien für selektiver und sicherer Plazenta gezielte Medikamentenverabreichung während der Schwangerschaft bleibt eine Herausforderung in der modernen medikamentösen Therapie.
In den letzten Jahren haben mehrere Berichte auf die gezielte Abgabe von Medikamenten an uteroplazentalen Gewebe durch Nanopartikel Beschichtung mit Peptiden oder Antikörper als Plazenta-bezogene Werkzeuge konzentriert. Dazu gehören Antikörpers Anti-epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR)6 , Tumor-Homing Peptide (CGKRK und iRGD)7, Plazenta gezielt Peptide8, plazentare Gefäßsystem gezielt Peptide9 und Antikörper gegen die Oxytocin-Rezeptor-10.
Hier zeigen wir, dass eine synthetische plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP) für die gezielte Bereitstellung von Nanopartikeln und ihre Droge Nutzlasten bis die Plazenta11verwendet werden kann. Die PlCSA-BP-geführte Nanopartikel sind komplementär zu den gemeldeten uteroplazentalen Ausrichtungsmethoden, denn sie richten sich an die Placenta Trophoblast.
Als nicht-invasive Methode in-Vivo Bildgebung verwendet wurde, um die Plazenta-spezifische Genexpression in Mäusen12überwachen und Indocyanine Green (ICG) ist weit verbreitet, Nanopartikel mit Fluoreszenz imaging Systeme13zu verfolgen, 14,15. So injiziert wir intravenös PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel geladen mit ICG (PlCSA-INPs), die PlCSA-INP-Verteilung bei schwangeren Mäusen mit einem Fluoreszenz-Imager zu visualisieren. Wir dann intravenös injiziert Methotrexat (MTX)-PlCSA-NPs in schwangeren Mäusen geladen. Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS), andere nicht-invasive, Echtzeit-imaging-Tool16,17 diente der fetalen und plazentaren Entwicklung bei den Mäusen zu überwachen. Zu guter Letzt haben wir Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), um MTX-Verteilung in der Plazenta und Föten zu quantifizieren.
In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich das drei-Methode-System verwendet, um die Bewertung der Effizienz der Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung durch PlCSA-BP-geführte darin.

<table><tbody><tr><td>CD-1 Mäuse</td><td>Beijing Vital River</td><td>201</td><td>Weiblich (8-12 Wochen)</td></tr><tr><td>Insulinspritze</td><td>BD</td><td>328421</td><td>für die IV-Injektion</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Sinopharm Chemisches</td><td>10009218</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Sojalecithin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>441601</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>880125</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Ultraschallprozessor</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Methotrexat (MTX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900324</td><td>für die Synthese von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>Indocyaningrün (ICG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1340009</td><td>für in vivo Bildgebung</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>IVIS-Spektrum-Instrument</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>für die In-vivo-Bildgebung</td></tr><tr><td>Ultraschall-Transmissionsgel</td><td>Guanggong</td><td>ZC4252418</td><td>für Ultraschallbildgebung</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Lunan Pharmaceutical</td><td>I0040</td><td>zur Aufrechterhaltung der Anästhesie</td></tr><tr><td>Enthaarungscreme</td><td>Nair</td><td>TMG001</td><td>zum Entfernen des Fells</td></tr><tr><td>40 MHz Schallkopf</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td>für die Ultraschallbildgebung</td></tr><tr><td>Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebungssystem</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo2100</td><td>für die Ultraschallbildgebung</td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>für die Anästhesie</td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Mindray</td><td>SK-500III</td><td>für die Herzperfusion</td></tr><tr><td>0,9% Kochsalzlösung</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td>für die Herzperfusion</td></tr><tr><td>1,5 mL Polypropylen-Röhrchen</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Gefrierschrank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88600V</td><td></td></tr><tr><td>Zentriuge</td><td>Cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>Perchlorsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td>zur Fällung von</td></tr><tr><td>Proteinen Homogenisator</td><td>SCIENTZ</td><td>SCIENTZ-48</td><td>zur Homogenisierung von Gewebe</td></tr><tr><td>Spritzenfilter (0,45 &mu; m)</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sinopharm Chemisches</td><td>10019763</td><td>zum Lösen von MTX</td></tr><tr><td>HPLC-Fläschchen</td><td>Wasser</td><td>670650620</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sinopharm Chemisches</td><td>20032117</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>JKchemisches</td><td>932537</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>C18-Säule</td><td>Wasser</td><td>186003966</td><td>für HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-System</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>für HPLC</td></tr></tbody></table>

umfassende bewertung der wirksamkeit und sicherheit von plazenta-gezielte medikamentenverabreichung mit drei komplementäre methoden

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Keine wirksamen Therapien gibt es derzeit für Plazenta-assoziierten Schwangerschaftskomplikationen und Entwicklung von Strategien für die gezielte Abgabe von Medikamenten, die Plazenta bei gleichzeitiger Minimierung der fetalen und mütterlichen Nebenwirkungen bleibt eine Herausforderung. Gezielte Nanopartikel Träger bieten neue Möglichkeiten für plazentare Störungen zu behandeln. Wir zeigten vor kurzem, dass eine synthetische plazentar Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP) verwendet werden könnte um Nanopartikel um Drogen, die Plazenta zu liefern. In diesem Protokoll beschreiben wir im Detail ein Systems zur Bewertung der Effizienz der Drug-Delivery der Plazenta durch PlCSA-BP, die drei separate Methoden in Kombination beschäftigt: in-Vivo Imaging, Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) und Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Mit in Vivo wurden bildgebende, PlCSA-BP-geführte Nanopartikel visualisiert in der Plazenta von lebenden Tieren, während HFUS und HPLC nachgewiesen, dass PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel gezielt und effizient Methotrexat der Plazenta geliefert. So kann eine Kombination dieser Methoden als ein wirksames Instrument für die gezielte Gabe von Medikamenten, um die Plazenta und die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien für mehrere Komplikationen während der Schwangerschaft verwendet werden.

In dieser Handschrift wurden PlCSA-BP-konjugiert Nanopartikel mit MTX (PlCSA-MNPs) oder ICG (PlCSA-INPs) schwangeren Mäusen intravenös injiziert. In-Vivo Bildgebung zeigte starke ICG-Signale in der Region des Uterus 30 min nach PlCSA-INP-Injektion. Die INPs waren hauptsächlich in der Leber und Milz Region (Abbildung 1A) lokalisiert. 48 h nach PlCSA-INP-Injektion wurden Schwangere Mäuse geopfert, enthüllt ICG Signale nur in der Plazenta, während mit k...

Wir beschreiben eine System, das drei Methoden zur Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung nutzt: in-Vivo Bildgebung zur Überwachung der Nanopartikel Akkumulation, Hochfrequenz-Ultraschall, Plazenta und fetalen Entwicklung zu überwachen , und HPLC, Drug-Delivery, Gewebe zu quantifizieren.

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Nanomedizin über die Wirksamkeit und Sicherheit von Medikamenten zu beantworten, die mit Nanopartikeln beladen sind, die der Mutter und dem Fötus verabreicht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue biochemische Messung der Menge des Arzneimittels ermöglicht, die an die Plazenta abgegeben wird. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von plazentavermittelten Schwangerschaftskomplikationen, da es wichtig ist, eine präzise Ausrichtung der Arzneimittelabgabe an die Plazenta zu gewährleisten.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Hochfrequenz-Ultraschalluntersuchung der Embryonalentwicklung Geduld und Erfahrung erfordert, um sie zu beherrschen. Für die intravenöse Injektion von Nanopartikeln übertragen Sie eine embryonal Tag 14.5 schwangere Maus mit wärmeerweiterten Schwanzvenen in einen Halteapparat und reinigen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer. Führen Sie dann die Nadelspitze einer 28-Gauge-Insulinspritze in eine erweiterte Schwanzvene ein und drücken Sie den Kolben langsam über fünf bis 10 Sekunden mit gleich

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Biotechnik

Twin-to-twin Transfusion-Syndrom und zwei Anämie Polyzythämie Sequenz sind zwei potenziell verheerende Probleme in Perinatalmedizin. Beide Erkrankungen treten nur in monochorialen Zwillingen und resultieren aus unsymmetrischen Durchblutung der Plazenta Gefäßanastomosen. Wir bieten ein einfaches Protokoll zur genauen Beurteilung der Anwesenheit von Gefäßanastomosen mit Farbstoff Injektion von Plazentagefäße nach der Geburt.

Präzise und einfache Auswertung der Gefäßanastomosen in Monochoriale Placenta mit Farbstoff

Bestimmung der Transport von Xenobiotika und Nanomaterialien über die Plazenta mit dem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menschliche Plazentaperfusion Modell

Wir präsentieren eine detaillierte Methode, um die menschliche Plazenta-Physiologie in vivo zu studieren. Die Methode kombiniert die Blutentnahme von den ankommenden und ausgehenden Gefäßen auf der mütterlichen und fötalen Seite der Plazenta mit Ultraschallmessungen von Volumen Blutfluss und Plazenta Gewebe Probenahme.

Der 4-Gefäß-Stichprobenansatz für integrative Studien der menschlichen Plazenta-Physiologie<em&gt; In vivo</em

Diese Studie stellt ein Protokoll für die reversible Gewebe, clearing, Immunostaining, 3D-Darstellung und Analyse von vaskulären Netzwerken im menschlichen Plazenta Zotten Proben in der Größenordnung von 1 bis 2 mm3.

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Synthese von Plazenta Chondroitinsulfat A Bindung Peptid (PlCSA-BP)-konjugiert Lipid-Polymer Nanopartikel über einstufigen Beschallung und Bioconjugate Techniken. Diese Partikel bilden ein neuartiges Instrument für die gezielte Bereitstellung von Therapeutika, die meisten menschlichen Tumoren und Plazenta Trophoblasten zur Behandlung von Krebserkrankungen und plazentare Störungen.

Synthese und Charakterisierung von Plazenta Chondroitin Sulfat (PlCSA) - Targeting Lipid - Polymer Nanopartikel

Hier stellen wir eine detaillierte Methodik zur Verfügung, um die zytotoxische Funktion natürlicher Killerzellen von den Plazenta durch einen farbimetrischen Plattentat zu isolieren und zu bewerten. Das reduzierte Mutterperfusionsdruckrattenmodell der Plazenta-Ischämie wurde ausgewählt, um die antikörpervermittelte Isolierung und Beurteilung der zytotoxischen Funktion natürlicher Killerzellen zu demonstrieren.

Ein platebasierter Cytotoxicity Assay zur Bewertung der Rate Placental Natural Killer Cell Cytolytic Funktion

Hier wird ein Protokoll der ex vivo mütterlich-fetalen Gefäßperfusion vorgestellt, um die Verabreichung eines Testartikels in die mütterliche Vaskulatur zu ermöglichen und die plazentale Übertragung von xenobiotischen Partikeln oder pharmakologischen Wirkstoffen zu bewerten, zusätzlich zu den Veränderungen in Plazentale Physiologie.

Ex Vivo Perfusion der Rodent Placenta

In dieser Arbeit beschreiben wir eine zeitspezifische Methode, um kritische Entwicklungswege in der Plazenta der Maus in vivo effektiv zu manipulieren. Dies geschieht durch die Injektion und Elektroporation von CRISPR-Plasmiden in die Plazenta trächtiger Muttertiere am Embryonaltag 12.5.

Maus-In-vivo-Plazenta-gezielte CRISPR-Manipulation

Es wird ein Protokoll vorgestellt, um zu evaluieren, ob kleine EVs (sEVs), die aus Plazenta-Explantaten isoliert wurden, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert wurden (ein Aspekt der Präeklampsie modellierend), die Blut-Hirn-Schranke bei nicht schwangeren erwachsenen weiblichen Mäusen stören.

Störung der Blut-Hirn-Schranke der Maus durch kleine extrazelluläre Vesikel aus hypoxischen menschlichen Plazenta

Biokompatiblen pH anspricht Sol-Gel-Nanosensoren können in Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) elektro Gerüste eingebracht werden. Die hergestellten Selbstberichts Gerüste können für die in situ Überwachung von Mikroumgebungsbedingungen, während die Kultivierung von Zellen auf dem Gerüst verwendet werden. Dies ist vorteilhaft, da die 3D-Zellkonstrukt kann in Echtzeit, ohne den Versuch zu stören überwacht werden.

Selbstberichts Gerüste für 3-Dimensional Cell Culture

Erfahren Sie eine Methode zur Bewertung plazentagezielter Arzneimittelverabreichung mit In-vivo-Bildgebung, Hochfrequenzultraschall und HPLC. Diese Technik ermöglicht präzise biochemische Messungen für die Nanomedizin.

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden (Video) | JoVE Journal

Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

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