Umfassende Bewertung der Wirksamkeit und Sicherheit von Plazenta-gezielte Medikamentenverabreichung mit drei komplementäre Methoden

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Nanomedizin über die Wirksamkeit und Sicherheit von Medikamenten zu beantworten, die mit Nanopartikeln beladen sind, die der Mutter und dem Fötus verabreicht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genaue biochemische Messung der Menge des Arzneimittels ermöglicht, die an die Plazenta abgegeben wird. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von plazentavermittelten Schwangerschaftskomplikationen, da es wichtig ist, eine präzise Ausrichtung der Arzneimittelabgabe an die Plazenta zu gewährleisten.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Hochfrequenz-Ultraschalluntersuchung der Embryonalentwicklung Geduld und Erfahrung erfordert, um sie zu beherrschen. Für die intravenöse Injektion von Nanopartikeln übertragen Sie eine embryonal Tag 14.5 schwangere Maus mit wärmeerweiterten Schwanzvenen in einen Halteapparat und reinigen Sie den Schwanz mit einem Alkoholtupfer. Führen Sie dann die Nadelspitze einer 28-Gauge-Insulinspritze in eine erweiterte Schwanzvene ein und drücken Sie den Kolben langsam über fünf bis 10 Sekunden mit gleichmäßigem Druck nieder, um die Nanopartikel in die Schwanzvene abzugeben.

30 Minuten nach der Injektion legen Sie die anästhesierte trächtige Maus in Rückenlage in die Bildgebungskammer eines in vivo Fluoreszenzbildgebungssystems. Wählen Sie die 2D-Fluoreszenz und die entsprechenden fotografischen Parameter für die Abbildung der Indocyaningrün-Fluoreszenzsignale aus und stellen Sie die Belichtung auf auto und die Anregungs- und Emissionswellenlängen auf 710 bzw. 820 Nanometer ein. Stellen Sie sich dann das Tier vor und bringen Sie die trächtige Maus in ihren Käfig zurück.

48 Stunden nach der Injektion verwenden Sie eine Graefe-Zange, eine Graefe-Gewebezange und eine Präparierschere, um die Föten und Plazenten zu sammeln, und stellen Sie das entnommene Gewebe so dar, wie es gerade für das gesamte Tier gezeigt wurde. Für die Hochfrequenz-Ultraschalluntersuchung der Embryonalentwicklung wird 24 Stunden nach der Nanopartikel-Injektion die anästhesierte trächtige Mutterin auf einer auf 37 bis 42 Grad Celsius vorgewärmten Ultraschallbildgebungsplattform in Rückenlage befestigt und der 40-Megahertz-Schallkopf in den mechanischen Arm eingesetzt. Passen Sie dann die Position des Schallkopfs an, um Längsschnittbilder des Fötus und der Plazenta mit der interessierenden Region innerhalb der Fokuszone zu erhalten.

Wählen Sie für die Bildgebung und Analyse im B-Modus den B-Modus und senken Sie den Schallkopf über den Bauch, bis der Fötus und die Plazenta sichtbar sind. Klicken Sie auf Scan/Freeze, um das Imaging zu starten und zu stoppen, auf Cine Store, um die Cine-Schleife zu speichern, und auf Frame Store, um die Frame-Bilder zu speichern. Klicken Sie dann auf Messen, um die Länge des Schwangerschaftssacks, die Rumpflänge der fetalen Krone, den biparietalen Durchmesser, den Bauchumfang, den Plazentadurchmesser und die Plazentadicke zu analysieren.

Für die Pulswellen-Doppler-Bildgebung und -Analyse klicken Sie bei Verwendung derselben Scanprojektion zuerst auf Farbe, wählen Sie dann Pulswelle aus und platzieren Sie das Feld für das Probenahmevolumen in der Mitte der Nabelarterie. Klicken Sie auf Scannen/Einfrieren, um die Bildgebung zu starten, und auf Cine Store, um die Bilder der Nabelschnurarterie zu erfassen. Klicken Sie dann auf Messen, um die Spitzengeschwindigkeit der Nabelschnurarterie zu berechnen.

Klicken Sie für die Bildgebung und Analyse im Farbdopplermodus mit derselben Scanprojektion auf Farbe, und passen Sie die Schallkopfposition an, um Bilder des fetalen Herzens wie gezeigt zu erhalten. Klicken Sie dann auf Messen, um die fetale Herzfrequenz der gespeicherten Cine-Bildschleife zu berechnen. Für die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) wird zunächst einer schwangeren Maus am Embryonaltag 14,5 eine Einzeldosis Nanopartikel injiziert, wie gezeigt.

Nach 24 Stunden perfundieren Sie das Herz des trächtigen Tieres 10 Minuten lang mit 50 Millilitern eiskalter 0,9%iger Kochsalzlösung, um alle ungebundenen Nanopartikel zu entfernen, und sammeln Sie die Föten und Plazenten für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Am Tag der Analyse geben Sie 500 Mikroliter frisch zubereitete Homogenisierungslösung zu jeder 200-Milligramm-Gewebeprobe und homogenisieren Sie die Proben zweimal bei voller Geschwindigkeit für 30 Sekunden pro Dissoziation. Nach der zweiten Homogenisierung zentrifugieren Sie die Proben und filtrieren die Überstände durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter in ein HPLC-Fläschchen.

Legen Sie die Probenfläschchen zur Injektion in ein Autosampler-Tablett und schalten Sie den HPLC-Entgaser ein, um Luft aus dem System zu entfernen. Schalten Sie als Nächstes die Strömung ein, um die Säule 30 Minuten lang mit der mobilen Phase auszugleichen, um das Grundlinienrauschen zu reduzieren, und stellen Sie die Temperatur der Säule auf 25 Grad Celsius ein. Injizieren Sie dann 20-Mikroliter-Probenvolumina mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute innerhalb von 30 Minuten und klicken Sie auf Methode ausführen, um die Analyse zu starten.

Wenn die Läufe abgeschlossen sind, wechseln Sie die mobile Phase manuell zu Acetonitril in HPLC-Qualität und lassen Sie das Acetonitril etwa 15 Minuten lang laufen, um das System zu schützen. Die In-vivo-Bildgebung zeigt 30 Minuten nach der Injektion von plazentaren Chondroitinsulfat-gebundenen fluoreszenzkonjugierten Nanopartikeln starke Indocyanin-Grün-Signale im Gebärmuttergewebe, während die ungebundenen Nanopartikel hauptsächlich in der Leber und im Milzbereich lokalisiert sind. 48 Stunden nach der Injektion wird ein Fluoreszenzsignal in der Plazenta von Tieren beobachtet, die mit Plazenta-Chondroitinsulfatsulfat-gebundenen Nanopartikeln injiziert wurden, wobei keine Signale im Fötus nachgewiesen wurden.

Die Hochfrequenz-Ultraschallüberwachung von plazentaren Chondroitinsulfat-gebundenen, fluoreszenzkonjugierten Nanopartikeln, die injiziert wurden, zeigt eine signifikante Abnahme der wichtigsten Entwicklungsmeilensteine des Fötus und der Plazenta. Interessanterweise beeinträchtigt die Behandlung mit Methotrexat-gebundenen Nanopartikeln auch leicht die Entwicklung des Fötus und der Plazenta, was darauf hindeutet, dass die Nanopartikel die Abgabe von Methotrexat an die Plazenta über die erhöhte Permeabilität und den Retentionseffekt verbessern können. Die Messung der Methotrexat-Konzentrationen mittels HPLC zeigt eine Retentionszeit von sieben Minuten in der Plazenta von Methotrexat-gebundenen Nanopartikel-injizierten Mäusen.

24 Stunden nach der Injektion sind die Plazenta-Methotrexat-Spiegel in der Methotrexat-gebundenen Nanopartikel-injizierten Gruppe signifikant niedriger als die in der Plazenta-Chondroitinsulfat- und Methotrexat-gebundenen Nanopartikelgruppe gemessenen, wobei in den Föten der letzteren kein Methotrexat nachgewiesen wurde. Methotrexat kann auch 48 Stunden nach der Injektion von Plazenta-Chondroitinsulfat und Methotrexat-gebundenen Nanopartikeln in der Plazenta nachgewiesen werden, was zeigt, dass Plazenta-Chondroitinsulfat und Methotrexat-gebundene Nanopartikel die Plazenta nicht passieren können, wodurch mögliche nachteilige Auswirkungen auf den Fötus minimiert werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass sich die Plazenta um den Embryonaltag 9 1/2 herum zu bilden beginnt, und daher sollte das In-vivo-Bildgebungsexperiment besser am Embryonaltag 10 1/2 oder später durchgeführt werden.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Immunfluoreszenzfärbung und -analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Lokalisierung der Nanopartikel in der Plazenta zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Reproduktionsmedizin, um die Möglichkeit einer plazentagerichteten Behandlung bei Schwangerschaftskomplikationen zu erforschen.