Name: Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Lernen Sie die elektrophysiologische Aufnahme des ZNS von Drosophila melanogaster-Larven. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Studien zur neuronalen Aktivität und Insektizidwirkung.

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Wir möchten danken Frau Rui Chen für die Dissektion und Bilder von Drosophila CNS in den Abbildungen dargestellt.

1. Geräte und Materialien
<ol><li>Bereiten Sie die erforderlichen Komponenten (siehe Tabelle der Materialien) der Elektrophysiologie Rig Saug Elektrode Aufnahmen von Drosophila CNS durchführen. Hinweis: Vor dem Experimentieren ist es notwendig, Kammern für Dissektion der Drosophila CNS zu konstruieren und zum Baden der Ganglien in Kochsalzlösung bei Aufnahmen verwendet werden. Nachfolgend finden Sie eine schrittweise Gliederung der Kammer-Konstruktion.</li>
	<li>Bereiten Sie die Larven Kammer.<ol>
<li>Schmelzen Sie die schwarzen Wachs mit einer Heizplatte.</li>
		<li>Gießen Sie 2 mL geschmolzene Wachs in einer Kammer, die ein maximales Volumen von 2-2,5 mL hat.</li>
		<li>Lassen Sie das Wachs abkühlen und Aushärten für ca. 2 h.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein Loch in den gehärteten Wachs zu schnitzen, die ein Volumen von 500 µL halten wird, hat eine Fläche von ca. 0,5 cm2 und einer Tiefe von ca. 0,25 cm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ausrüstung und Software-Konfiguration
Hinweis: Das Setup der extrazellulären Aufnahme wird nachfolgend kurz beschrieben.
<ol><li>Bereiten Sie Ausrüstung für Dissektion und Aufnahme.<ol>
<li>Positionieren Sie das Gewebe Vorbereitung, Mikroskop, Saug-Elektrode, Mikromanipulatoren, Lichtquelle in den Faraday-Käfig zur Reduzierung von Lärm und äußere elektrische Felder (Abbildung 2) zu beseitigen.</li>
		<li>Verbinden (vorzugsweise Löten) Boden und positive Drähte auf abgeschirmt Krokodilklemmen, die mit der Badewanne und Mikroelektrode Inhaber bzw. verbunden werden. Hinweis: Verlötet und freiliegende Leitungen können mit Alu-Folie zur Lärmreduzierung abgedeckt werden.</li>
		<li>Schließen Sie den Boden und positive Drähte an Eingang 1 von AC/DC Differenzverstärker.
</li>
		<li>Anschließen Sie das Datenerfassungssystem an AC/DC Differenzverstärker indem ein Bajonett Neill-Concelman (BNC) Kabel von Eingang 1 das Datenerfassungssystem auf Kanal 1 Ausgang des Verstärkers. Hinweis: Es wird empfohlen, einen 50/60 Hz Lärm Eliminator zwischen der Datenerfassungs-Software und dem Verstärker zu integrieren. Die Verwendung eines BNC-T-Anschluss ist erforderlich.</li>
		<li>Falls gewünscht, gehören Sie einen Audio-Monitor in das Setup durch den Anschluss Eingang 1 des audio Monitors an Eingang 1 von der Datenerfassungs-Software.</li>
		<li>Füllen Sie 10 mL Spritze mit Kochsalzlösung und verbinden Sie es mit dem Druckanschluß des Elektrodenhalters. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen der Spritze, das Pellet Ag/AgCl und die Elektrode Öffnung bestehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Software für die Dissektion und Aufnahme. Hinweis: Die Umrisse der Methoden für Software-Setup basiert auf die Übernahme/Analyse-Software in der Tabelle der Materialien , die rohe elektrische Leistung zu digitalisieren und konvertieren Sie die Daten zur Häufigkeit Spike, aufgeführt. Jedoch können andere Software verwendet werden und mehrere Aufnahme-Konvertierungen verwendet werden.<ol>
<li>Öffnen Sie die Erfassung/Analyse-Software.</li>
		<li>Klicken Sie auf "Setup" aus dem Haupt-Symbolleiste und wählen Sie "Kanaleinstellungen", die wodurch ein Dialogfeld geöffnet wird.</li>
		<li>Reduzieren Sie die Anzahl der insgesamt Kanäle auf drei.</li>
		<li>Für Kanal 1, wählen Sie einen Bereich von 100 mV.</li>
		<li>Kanal 2 Klicken Sie auf der Registerkarte "Berechnung", die ein Drop-Down-Menü öffnet. Wählen Sie "zyklische Messungen", die wodurch ein zweites Dialogfeld geöffnet wird.</li>
		<li>Wählen Sie Kanal 1 als Quelle. Wählen Sie dann auf das Drop-down Menü Messung, Gerät Spike bei Veranstaltungen. Zu guter Letzt in den Erfassungsbereich Einstellungen aus dem Drop-down-Menü wählen Sie einfache Schwelle.</li>
		<li>Um die elektrische Aktivität in einem Rate-Grundstück in Hertz ausgedrückt zu konvertieren, 3rd Kanal im arithmetischen Modus festgelegt werden: das Eingabefenster geben Sie in "1000*smoothsec(ch2,2)". Dann wählen Sie die Einheiten im Dropdown-Menü Hertz. Hinweis: Erfolgreiche Aufnahmen können mit mehreren verschiedenen Aufnahme-Setups durchgeführt werden, aber "Einheit Spike bei Veranstaltungen und einfache Schwelle" ist wahrscheinlich die einfachste, da es erlaubt eine Anpassung der Schwelle oberhalb der Hintergrundaktivität für jeden einzelnen Aufnahme. Aufnahmen unter der Einstellung "Custom-Source Input" erhöhen Reproduzierbarkeit der Daten vorausgesetzt, die Hintergrundaktivitäten nicht anders zwischen den Aufnahmen ist.</li>
		<li>Engen Dialogboxen, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Die y-Achse sollte in Hz und der x-Achse in Zeit ausgedrückt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) zerlegen Sie und bereiten Sie der Larven Drosophila CNS vor
Hinweis: Methoden für die Larven CNS Dissektion sind deutlich in Hafer und Schedl27, aber diese zuvor veröffentlichten Methoden reduzieren Sie die Länge der absteigenden Neuronen, die wichtig für die Messung von Spike Frequenz sind. Hier ist eine zusätzliche Methode beschrieben, um die Larven CNS Verbrauchsteuern, die lange, intakte absteigende Neuronen unterhält.
<ol><li>Kochsalzlösung Vorbereitung.<ol>
<li>Bereiten Sie die Dissektion und Aufnahme Kochsalzlösung an folgende in mM28: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic Säure (HEPES); titrieren Sie pH-Wert auf 7,25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Larven Drosophila CNS zu sezieren.<ol>
<li>Identifizieren Sie und extrahieren Sie einer wandernden dritte Instar Drosophila Melanogaster aus dem Kulturfläschchen und in 200 µL der Saline (Abb. 3A).</li>
		<li>Greifen Sie die Mund-Haken mit einer feinen Pinzette und begreifen Sie den Bauch die Maden mit einem zweiten paar der Zange (Abb. 3 b). Hinweis: Gelten Sie nicht zuviel Druck auf den Bauch, da dies der kutikulären Dünnschicht des die Maden zu reißen führen kann.</li>
		<li>Ziehen Sie vorsichtig den Mund Haken und Bauch in verschiedene Richtungen zu trennen kaudalen Ende der Maden aus der Kopfregion und setzen die Eingeweide von Maden (Abbildung 3). Hinweis: Die CNS wird mit der Luftröhre und Verdauungstrakt verflochten. Geschnitten Sie die CNS Weg von jedem möglichem Gewebe um zu vermeiden, schneiden die absteigenden peripheren Nerven nicht.</li>
		<li>Die CNS aus dem Verdauungstrakt und Luftröhre mit Zange (Abbildung 3D) necken.</li>
		<li>Falls erforderlich, stören Sie die Blut-Hirn-Schranke, indem manuell vor der CNS nach der zerebralen Lappen mit einer Schere Vannas Frühling. Hinweis: Dies sollte basierend auf physiochemischen Eigenschaften der verwendeten Chemikalie erfolgen. Die rote Linie in Abbildung 4A ist die vorgeschlagene Durchtrennung und die durchtrennten CNS mit intakten absteigenden peripheren Nerven Stämme dargestellt in Abbildung 4 b. Die durchtrennten CNS ist bereit für Experimente nach Abschluss von Schritt 3.2.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) extrazelluläre Aufnahme von Drosophila CNS.
<ol><li>Aufnahme die CNS vorbereiten.<ol>
<li>Ziehen Sie eine Pipette Glaselektrode aus Borosilikatglas Kapillaren zu einem Widerstand von 5-15 mΩ.</li>
		<li>Legen Sie die durchtrennten CNS in die Wachs-Kammer, die 200 µL Kochsalzlösung enthält. Klemmen Sie eine unbeschichtete Insekt Pin mit der Krokodilklemme an die Masseleitung angelötet und setzen Sie den Stift in die Kochsalzlösung um den Stromkreis zu schließen.</li>
		<li>Orientieren Sie mit Hilfe der Mikromanipulatoren, sich die Elektrode am kaudalen Ende des durchtrennten ZNS. Beseitigen Sie Aufnahme Hintergrundgeräusche durch die Anpassung der Schwellenwert in der Akquisition/Analyse-Software vor der Kontaktaufnahme mit den peripheren Nerven-Stämmen.</li>
		<li>Ziehen Sie bequeme peripheren Nerven in die Absaugung Elektrode durch leichten negativen Druck auf die Spritze. Hinweis: Die Grundlinie feuern Frequenz ist die Anzahl der Neuronen in der Elektrode gezogen, wo führen zu mehr Neuronen oft erhöhte Resistenz der Elektrode korreliert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starten Sie die extrazelluläre Aufnahme des ZNS absteigenden Nerven-Aktivität.<ol>
<li>Starten Sie die Aufnahme auf der Datenerfassungs-Software und überwachen Sie die Grundlinie feuern Frequenz zu. Lassen Sie die Feuerrate, equilibrate für 5 min vor der Grundlinie feuern Tarifdaten zu sammeln.</li>
		<li>Die Vorbereitung und Aufnahme zu verwerfen, wenn das Muster der Abschuss von Kontrolle der Behandlung kein bersten Muster ähnlich dem in Abbildung 5Agezeigt ist. Hinweis: Veränderte Muster der Zündung schlägt abnorme oder instabile Aktivität des zentralen Pattern-Generator, der neuronale Funktion verändern können.</li>
		<li>Fügen Sie nach 5 min 200 µL der Saline + Fahrzeug bringen das Gesamtvolumen der Kammer in 400 µL Aufnahmesteuerung feuern Preise beginnen.</li>
		<li>Nachdem Grundlinie etablierten (3-5 min) wurde, 200 µL der Saline zurückziehen und 200 µL des experimentellen Agenten solubilisiert in Kochsalzlösung hinzufügen. Hinweis: Dimethyl Sulfoxid (DMSO) ist die empfohlene Lösungsmittel für lipophile Verbindungen und 0,1 % V/Vnicht überschreiten.</li>
		<li>Gelten Sie Droge-Konzentrationen in einer seriellen Weise (niedrige bis hohe Konzentrationen), und notieren Sie jede Konzentration für einen ausgewählten Zeitraum (bestimmt durch den Prüfarzt basierend auf die chemischen Eigenschaften der Droge29). Beschriften Sie diesem Zeitpunkt Drug Application in der Akquisition/Analyse-Software durch die Aufnahme einer Anmerkung, die das Medikament und die letztendliche Konzentration enthält. Hinweis: Brand Aktivität des ZNS wird sinken um ca. 10-20 % nach 30-50 min nach der Präparation und daher entsprechende unbehandelte Kontrollen durchgeführt werden und medikamentöse Behandlungen sollte diesen Zeitraum nicht überschreiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Daten zu analysieren. Hinweis: Mehrere Untersuchungen können auf die gesammelten Daten, wie z. B. Veränderungen in Aktionspotential platzt29, Spike Wellenform Amplitude und zeitlicher Verlauf und Bestimmung der mittleren Spitze Frequenzen nach Medikament Behandlung26,30 durchgeführt werden , 31 , 32. die am weitesten verbreitete ist die Bestimmung des Einflusses ein Medikaments muss die mittlere Spitze Frequenzen über einen bestimmten Zeitraum hinweg, die unten beschrieben ist.<ol>
<li>Tabellieren Sie mittlere Spitze Frequenzen durch die gesamte Region von Interesse (d. h. die medikamentöse Behandlung Zeitraum) auswählen und bestimmen Sie, mittlere Spitze Frequenzen automatisch durch das "Alter" befindet sich auf der Hauptsymbolleiste auf der Akquisition/Analyse Software.</li>
		<li>Ermitteln Sie die mittlere Spitze Frequenz des ZNS nach medikamentöse Behandlung auf die mittlere Spitze Frequenz der Fahrzeugkontrolle (Baseline). Die prozentuale Veränderung der Feuerrate nach medikamentöse Behandlung nach folgender Formel zu berechnen: (Frequenz/Baseline-Frequenz behandelt) × 100.</li>
		<li>Verwenden Sie das mittlere Spitze Frequenzen oder Prozent Feuern der Steuerung für jede Konzentration um eine Antwort Konzentrationskurve mit Standard Grafik-Software zu erstellen.</li>
		<li>Statistische Analysen durchführen (z. B. ungepaarten t-test) Bedeutung zwischen den Zeitpunkten, Konzentrationen oder medikamentöse Behandlungen zu bestimmen. Hinweis: Es gibt zwei primäre Methoden zur Erzeugung und Analyse von Konzentration-Wirkungs-Kurven. Die erste Methode ist eine Konzentration pro Individualanfertigung. Hier ist die Spikerate der einzelnen Konzentration auf Basis Spikerate für jede Zubereitung normalisiert. Die Leistungen werden gekürzt heruntergekommen der Vorbereitung durch verkürzte Aufnahmezeit, während die Fallstricke steigen Dissektion Zeit, weil diese Methode besteht aus 5-7 individuelle CNS Vorbereitungen pro Konzentration, und größere Fehler bars auf den gemittelten Daten Satz. Die zweite Methode ist mehrere Konzentrationen pro Individualanfertigung. Hier werden die Spikerate für jede der 3-5-Konzentrationen, die gleiche Grundlinie Spikerate normalisiert. Die Vorteile sind weniger Dissektion Zeit und weniger Variabilität zwischen repliziert für Droge-Konzentrationen, während die Fallstricke der Anforderung ein schnell wirkendes Medikament und unbekannten Auswirkungen der Vorbehandlungen Medikament Konzentration auf nachfolgende chemische Behandlungen sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Francis, S. A., Taylor-Wells, J., Gross, A. D., Bloomquist, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+physiological+actions+of+carbonic+anhydrase+inhibitors+to+Aedes+aegypti+and+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Toxicity and physiological actions of carbonic anhydrase inhibitors to Aedes aegypti and Drosophila melanogaster.</a> Insects. 8 (1), 2(2016).</li>
<li>Swale, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitor+profile+of+bis%28n%29-tacrines+and+N-methylcarbamates+on+acetylcholinesterase+from+Rhipicephalus+%28Boophilus%29+microplus+and+Phlebotomus+papatasi%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitor profile of bis(n)-tacrines and N-methylcarbamates on acetylcholinesterase from Rhipicephalus (Boophilus) microplus and Phlebotomus papatasi.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 85-92 (2013).</li>
<li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+inhibition+of+cholinesterases+in+insect+and+mammalian+nervous+systems+by+the+insect+repellent+deet%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for inhibition of cholinesterases in insect and mammalian nervous systems by the insect repellent deet.</a> BMC Biology. 7, 47(2009).</li>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Angaben in dem zugehörigen Video und Text haben wichtige Schritte, um die Aktivität und Spike erfassen Häufigkeit von Drosophila CNS ex VivoEntlastung zur Verfügung gestellt. Die Dissektion Wirksamkeit ist der wichtigste Aspekt der Methode, weil kurze oder paar absteigende Neuronen verkürzt die Grundlinie Feuerrate, die zu großen Abweichungen zwischen den Wiederholungen führt. Jedoch sobald die Dissektion Technik gemeistert hat, sind die Daten mit diesem Test sehr reproduzierbar und amendable für ei...

Das übergeordnete Ziel dieses Ansatzes ist es, Forscher der Electrogenesis des zentralen Nervensystems (ZNS) in das Modell Insekt, Drosophila Melanogasterschnell messen können. Diese Methode ist zuverlässig, schnell und kosteneffizient durchzuführen physiologische und toxikologische Experimente. CNS ist wichtig für Leben und daher die physiologischen Wege kritischer für ordnungsgemäße neurale Funktion haben ausgiebig erforscht wurden, in einer Bemühung zu verstehen oder neuronale Funktion zu ändern. Charakterisierung der Signalwege innerhalb der Arthropoden CNS ermöglichte die Entdeckung von mehreren chemischen Klassen von Insektiziden, die Wirbellosen neuronale Funktion, um Sterblichkeit zu induzieren, während Ziel folgen zu begrenzen, zu stören. Somit ist die Fähigkeit, die neuronale Aktivität der Insekten zu messen von wesentlichem Interesse auf dem Gebiet der Insekten Toxikologie und Physiologie, da das Nervensystem das Zielgewebe der Mehrheit der eingesetzten Insektizide1 ist. Doch weiter Wachstum von Grundlagen- und anwendungsorientierte Kenntnisse über das Insekt Nervensystem erfordert fortgeschrittene neurophysiologische Techniken, die in der Machbarkeit, begrenzt sind, da aktuelle Techniken arbeitsintensiv sind und erfordern einen hohen Aufwand, Insekt neuronale Zelllinien sind begrenzt, und/oder es gibt begrenzten Zugang zu den zentralen Synapsen der meisten Arthropoden. Charakterisierung der meisten Insekten neuronaler Proteine erfordert derzeit, das Ziel zu geklonten und heterologously ausgedrückt für nachfolgende Wirkstoffsuche und elektrophysiologische Aufnahmen, wie für Insekt nach innen Gleichrichter Kaliumkanäle2 beschrieben wurde , Insekt Ryanodin-Rezeptor3, Moskito Spannung-empfindliche K+ Kanäle4und andere. Um die Anforderung für die heterologe Expression und das Potenzial für geringe funktionelle Expression zu mindern, kultiviert Bloomquist und Kollegen zielte darauf ab, einen neuronalen Phänotyp in induzieren Spodoptera Frugiperda (Sf21) Zellen als eine neuartige Methode zur Insektizid Entdeckung5,6. Diese Methoden bieten einen gültigen Ansatz für die Entwicklung der neuen Chemie, doch sie schaffen oft einen unüberwindbaren Engpass für die Charakterisierung von pharmakologischen Wirkstoffen, Mechanismen der Insektizid Widerstand und Charakterisierung der physiologischen Grundprinzipien. Hier beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode, die es ermöglicht die Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von einer Modell-Insekt, die formbar Genetik7,8,9 hat und bekannte Expressionsmuster von neuronalen komplexe10,11,12 , die Charakterisierung von Resistenzmechanismen auf der Ebene der Nerven, die Wirkungsweise von neu entwickelten Medikamenten und anderen toxikologischen Studien zu ermöglichen.
Der Fruchtfliege, D. Melanogaster, ist gemeinsame Modellorganismus für die Definition von Insekten Nervensysteme oder Insektizid Wirkmechanismus und etabliert sich als Modellorganismus gut geeignet für das Studium der toxikologischen13, pharmakologische14 ,15, neurophysiologische16und pathophysiologischen17,18,19,20 Prozesse der Wirbeltiere. D.melanogaster ist ein holometabolous Insekt, die komplette Metamorphose, einschließlich ein Larven- und pupal Stadium vor Erreichen der reproduktiven Erwachsenstadium ausführt. Während des Entwicklungsprozesses das Nervensystem unterliegt erheblichen Umbau in verschiedenen Lebensphasen, aber die Larven CNS werden im Mittelpunkt dieser Methodik. Die voll entwickelte Larven CNS ist anatomisch einfach mit thorakalen und abdominalen Segmenten, die sind verschmolzen und bilden die ventralen Ganglion, die ein Array von wiederholten und fast identischen Neuromeric Einheiten21,22darstellt. Absteigende motorische Nerven stammen aus dem kaudalen Ende des Subesophageal Ganglien und hinabsteigen, um die Körperwand Muskeln und viszeralen Organe der Larven innervieren. Abbildung 1 beschreibt die Anatomie der Larven Drosophila CNS.
Drosophila Blut - Hirn-Schranke (BBB) am Ende der Embryogenese entwickelt und wird durch Subperineurial Gliazellen (SPG)21gebildet. Die SPG-Zellen bilden zahlreiche Filopodien-ähnliche Prozesse, die ausgebreitet, um eine zusammenhängende, sehr flach, Endothelzellen wie Blatt zu etablieren, das die gesamte Drosophila CNS23abdeckt. Die Drosophila BBB hat Ähnlichkeiten mit der vertebrate BBB, Erhaltung der Homöostase der neuronalen Mikroumgebung durch die Kontrolle des Eintrags von Nährstoffen und Xenobiotika in der CNS-21umfasst. Dies ist eine Voraussetzung für zuverlässige neuronale Übertragung und Funktion, noch der Schutz des ZNS durch die BBB schränkt die Permeation von synthetischen Drogen, die meisten Peptide und andere Xenobiotika24,25, das Potenzial einführt Probleme bei der Charakterisierung von Potenzen von kleinen Molekül-Modulatoren. Die Methode verwendet eine einfache Durchtrennung stören diese Barriere und pharmakologischen Zugriff auf den zentralen Synapsen. Die größte Stärke der beschriebenen Methode ist die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und relativ hohem Durchsatz Kapazität dieses Systems. Das Protokoll ist relativ leicht zu meistern, das Setup benötigt wenig Platz und nur einen ersten finanziellen Aufwand ist notwendig, die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien reduziert wird. Darüber hinaus ist das beschriebene Verfahren völlig amendable Aufzeichnen der zentrale absteigende Nerven-Aktivität von der Stubenfliege Musca Domestica26.

<table><tbody><tr><td>Drosophila melanogaster (Stamm OR)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>2376</td><td></td></tr><tr><td>Schwingungsisolationstisch</td><td>Kinetic Systems</td><td>9200 Serie</td><td></td></tr><tr><td>Faraday Cage</td><td>Kinetic Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop auf einem Galgen</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>Es können mehrere Zielfernrohre verwendet werden; Galgenstativ ist kritisch</td></tr><tr><td>AC/ DC-Differenzverstärker</td><td>ADInstruments</td><td>AM3000H</td><td>Das Modell 1700 kann anstelle des Audiomonitors Modell 3000 verwendet werden</td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>AM3300</td><td></td></tr><tr><td>Hum Bug Noise Eliminator</td><td>A-M Systems</td><td>726300</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System (PowerLab)</td><td>ADInstruments</td><td>PL3504</td><td>Es können mehrere PowerLab-Modelle verwendet werden.</td></tr><tr><td>Lab Chart Pro Software</td><td>ADInstruments</td><td>N/A - Online-Download</td><td></td></tr><tr><td>Faseroptische Leuchten</td><td>Edmund Optics</td><td>89-740</td><td>Es können verschiedene Lichtquellen verwendet werden, aber Faseroptiken sind am anpassungsfähigsten</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenhalter</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH715</td><td>Verschiedene Modelle sind akzeptabel</td></tr><tr><td>BNC-Kabel</td><td>World Precision Instruments</td><td>mehrfach basierend auf der Größe</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>PG52151-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikroelektrodenabzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Kann auch Narashige PC-100</td></tr><tr><td>Black Wax</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>974228</td><td></td></tr><tr><td>Unbeschichtete Insektenstifte, Größe #2</td><td>Bioquip</td> verwenden<td>1208S2</td><td></td></tr><tr><td>Fince Pinzette</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Federschere</td><td>Fine Science Werkzeuge</td><td>15000-03</td><td></td></tr></tbody></table>

elektrophysiologische aufnahme der zentralen nervensystems tätigkeit der dritte instar drosophila melanogaster

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

Die Mehrzahl der derzeit verfügbaren Insektizide Ziel des Nervensystems und genetische Mutationen von Wirbellosen neuronaler Proteine liefern oft schädliche Folgen, doch die aktuellen Methoden zur Erfassung von Nervensystem Aktivität des Individuums Tier ist teuer und aufwändig. Diese Absaugung Elektrode Vorbereitung der dritte Instar Larven Zentralnervensystem von Drosophila Melanogaster ist ein gefügig System zum Testen der physiologischen Wirkungen neuroaktive Erreger, bestimmen die physiologische Rolle von verschiedenen neuronalen Wege zur CNS Aktivität sowie der Einfluss von genetischen Mutationen zu neuronalen Funktion. Diese ex-Vivo -Vorbereitung erfordert nur mäßig sezieren elektrophysiologische und Geschick um reproduzierbare Aufnahmen von Insekten neuronaler Aktivität zu generieren. Eine Vielzahl von chemischen Modulatoren, einschließlich Peptide, kann das Nervensystem in Lösung mit physiologischer Kochsalzlösung, die Einfluss auf die CNS-Aktivität zu messen direkt zugewiesen werden. Weitere genetische Technologien, wie das GAL4/UAS-System können unabhängig voneinander oder in Kombination mit pharmakologischer Substanzen festzustellen, die Rolle der spezifische Ionenkanäle, Transporter oder Rezeptoren an Arthropoden CNS-Funktion angewendet werden. In diesem Zusammenhang sind die hier beschriebenen Assays für Insektizid Toxikologen, Insekt Physiologen und Entwicklungs Biologen für die D. Melanogaster ein etabliertes Modellorganismus ist von wesentlichem Interesse. Das Ziel dieses Protokolls ist eine elektrophysiologische Methode ermöglichen die Messung der Electrogenesis des zentralen Nervensystems in der Modell-Insekt, Drosophila Melanogaster, die eignet sich für eine Vielfalt von wissenschaftlichen Tests zu beschreiben Hypothesen.

Spontane Aktivität der absteigenden peripherer Nerven aus Drosophila Zentralnervensystem kann konsistente Reproduzierbarkeit extrazelluläre Saugelektroden mit aufgezeichnet werden. Spontane Aktivität der ausgeschnittenen und durchtrennten Drosophila CNS erzeugt ein zyklisches Muster platzen mit 1-2 s der Zündung mit ca. 1 s von in der Nähe von ruhenden Aktivität. Die CNS ist z. B. in der Nähe von ruhenden (1-2 Hz) für 0,5-1 s, gefolgt von einem Ausbruch (100-400 Hz) für ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum Aufzeichnen der absteigenden elektrische Aktivität von Drosophila Melanogaster Zentralnervensystems ermöglichen kostengünstige und praktische Erprobung von pharmakologischen Wirkstoffen, Genmutationen neuronaler Proteine, und/oder die Rolle der unerforschten physiologischen Wege.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in den Bereichen Insektentoxikologie und Insektenphysiologie zu beantworten, indem sie die Elektrogenese des Drosophila melanogaster Zentralnervensystems misst. Dies ermöglicht es, eine breite Palette von wissenschaftlichen Hypothesen zu testen und bei der Entdeckung neuer Insektizid-Wirk-Modi zu helfen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es ein einfaches, reproduzierbares und relativ hohes Durchsatzsystem mit minimalem finanziellen Input bietet, um das Nervensystem von Drosophila zu studieren.Öffnen Sie zunächst die Erfassungs-/Analysesoftware. Klicken Sie in der Hauptsymbolleiste auf Setup, und wählen Sie Kanaleinstellungen aus, wodurch ein Dialogfeld geöffnet wird. Reduzieren Sie die Anzahl der Gesamtkanäle auf drei.Kanal eins zeichnet das Rohsignal des Verstärkers mit einem Bereich von 100 Millivolt auf. Kanal zwei wird verwendet, um die Anzahl der Ereignisse von Kanal 1 zu zählen, die einen bestimmten Schwellenwert überschreiten. Klicken Sie dazu auf die Registerkarte Berechnung, um ein Dropdown-Menü für Kanal 2 zu öffnen.Wählen Sie Zyklische Messungen aus, wodurch ein zweites Dialogfeld geöffnet wird. Wählen Sie Kanal ei

electrophysiological-recording-central-nervous-system-activity-third

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Hier beschreiben wir elektrophysiologische Methoden zur Messung der synaptischen Transmission an der neuromuskulären Synapse von Drosophila Larve. Evozierte Freisetzung wird künstlich durch die Stimulierung der Motoneuronen Axone initiiert, und die Übertragung durch die NMJ kann durch die postsynaptische Reaktion im Muskel ausgelöst gemessen werden.

Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Elektrophysiologische Aufzeichnung in der Drosophila Embryo

The Giant Fiber System ist eine einfache neuronale Schaltkreis der...

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

Gleichzeitige Aufnahme von Calcium-Signale von identifizierten Neuronen und Fressverhalten von Drosophila melanogaster</em

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur elektrophysiologischen Aufzeichnung der Photorezeptoraktivität im Auge einer immobilisierten Drosophila, das eine präzise Messung von Spannungsänderungen als Reaktion auf Lichtreize ermöglicht.

Elektrophysiologische Aufzeichnung der Spannungsantworten von retinalen Photorezeptoren der Drosophila auf Lichtreize

Das Video zeigt die extrazelluläre Aufzeichnung der neuronalen Aktivität aus dem Zentralnervensystem (ZNS) von Drosophila-Larven. Das durchtrennte ZNS wird in einer Aufzeichnungskammer positioniert, und die elektrische Aktivität eines absteigenden Nervs wird aufgezeichnet, um die Ausgangsfeuerfrequenz zu bestimmen. Dann wird ein Prüfmittel eingeführt, und die Änderung der Brennhäufigkeit wird aufgezeichnet, um die erregende oder hemmende Wirkung des Mittels zu bestimmen.

Extrazelluläre Aufzeichnung der elektrischen Aktivität im zentralen Nervensystem der Drosophila

Dieses Protokoll beschreibt extrazellulären Aufnahme der Aktionspotentialantworten durch labellar Geschmack Neuronen in Drosophila gefeuert.

Elektrophysiologische Aufnehmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Geschmack Sensillen

Scharfe Mikroelektroden ermöglichen eine genaue elektrophysiologische Charakterisierung der Photorezeptor- und visuellen Interneuronenleistung in lebenden Drosophila. Hier zeigen wir, wie man mit dieser Methode qualitativ hochwertige Spannungsreaktionen einzelner Zellen auf kontrollierte Lichtstimulation aufzeichnen kann. Diese Methode ist ideal, um die neuronale Informationsverarbeitung in Facettenaugen von Insekten zu untersuchen.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Das Gesamtziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man Geruchsstoffe mit geringer Flüchtigkeit für die Single-Sensillum-Aufzeichnung von Drosophila- olfaktorischen Rezeptor-Neuronen, die auf langkettige cutikuläre Pheromone reagieren, präsentieren kann.

Elektrophysiologische Aufzeichnung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Trichoid Sensilla in Reaktion auf Odoranten der niedrigen Volatilität

Synaptische Ströme können fokal aus visualisierten synaptischen Boutons bei der Drosophila dritte Instar Larven neuromuskulären Synapse aufgenommen werden. Diese Technik ermöglicht die Überwachung der Tätigkeit von einem einzigen synaptische Bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Lernen Sie die elektrophysiologische Aufnahme des ZNS von Drosophila melanogaster-Larven. Diese Methode ermöglicht hochdurchsatzfähige Studien zur neuronalen Aktivität und Insektizidwirkung.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

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