Elektrophysiologischen Methoden für die Aufzeichnung Synaptic Potentials aus dem NMJ von Drosophila-Larven

Erstellung stabiler elektrophysiologischer Aufzeichnungen von neuromuskulären Verbindungen der Joof-Larve. Zuerst wird eine Larve geöffnet, um die Körperwand, die Muskeln und das Nervensystem vor der Aufnahme freizulegen. Die Axone an der Basis des ZNS sind posterior des Ventralganglion geschnitten.

Dann wird eine Aufzeichnungselektrode auf den interessierenden Muskel gelegt und eine Stimulationselektrode in der Nähe der innervierenden Motoneuronen platziert. Die durchtrennten Axone der Motoneuronen werden in die stimulierende Pipette gesaugt. Anschließend können exzitatorische Übergangspotentiale aufgezeichnet werden.

Hallo, ich bin Wendy MLA vom McCabe Lab in der Abteilung für Physiologie und zelluläre Biophysik an der Columbia University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Messung der Tic-Übertragung an der neuromuskulären Verbindung von GE-Lava. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die synaptische Physiologie und die Neurotransmission zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um das Experiment zu beginnen, sezieren Sie wandernde Drittel- und Sternlarven, um die Körperwand freizulegen. Dieses Protokoll wird für elektrophysiologische Experimente durch die Verwendung von kurzen Dissektionsstiften modifiziert.

Diese sind etwa zwei bis vier Millimeter lang und treffen während des Experiments in Elektroden weniger wahrscheinlich auf das Mikroskopobjektiv. Nachdem Sie die Körperwand freigelegt haben, verwenden Sie eine Pinzette, um das ZNS zu halten und es leicht anzuheben. Schneiden Sie dann die peripheren nervenmotorischen Axone und entfernen Sie das Gehirn.

Nach Entnahme des Gehirns wird das präparierte Präparat zweimal mit HL 3.1 Puffer mit einem millimolaren Calcium gewaschen. Jetzt, da die Dissektion abgeschlossen ist, können intrazelluläre Aufzeichnungen von den Muskelzellen der Larven gemacht werden. Legen Sie die Präparierplatte auf das elektrophysiologische Mikroskop und tauchen Sie das Präparat mit HL 3.1 Puffer plus Kalzium ein.

Befestigen Sie dann die Badelektrode so, dass sie mit der Lösung in Kontakt kommt. Die Saugelektrode dient zur Stimulation der peripheren Nerven, die den Muskel innervieren. Positionieren Sie die Saugelektrode zuerst in der Schale, um Vibrationen zu vermeiden, wenn die intrazelluläre Elektrode auf dem Muskel platziert wird.

Sobald sich die Elektrode in der Schale befindet, positionieren Sie sie in der Nähe des Motoneurons, das Muskel sechs innerviert. Im dritten Bauchsegment saugen Sie sanft, bis sich der Schnittnerv in der Glaspipette befindet. Achten Sie darauf, die Nerven beim Saugen nicht zu dehnen.

Heben Sie die Pipette leicht an, so dass sie den Muskel nicht berührt. Und dann positionieren Sie es so, dass es nicht an den durchtrennten Nervenfasern zieht. Sobald die Saugelektrode an Ort und Stelle ist, positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode für die intrazellulären Aufzeichnungen.

Verwenden Sie eine scharfe Mikroelektrode, die mit drei molaren Kaliumchlorid gefüllt ist. Positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode über der Mitte des sechsten Muskels. Stellen Sie den Eingangsversatz so ein, dass er für die Badlösung Null anzeigt.

Senken Sie die Elektrode langsam ab und nähern Sie sich dem Muskel unter starker optischer Vergrößerung, bis er die Muskeloberfläche berührt. Um zu bestätigen, dass der Muskel penetriert wurde, beobachten Sie das Oszilloskop. Das Ruhemembranpotential sollte mindestens minus 60 Millivolt betragen.

Sporadisches Miniatur-Nplate-Potential sollte nun sichtbar sein. Sobald die Aufzeichnungselektrode an Ort und Stelle ist, lassen Sie die Zellen eine Minute lang stabilisieren. Bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen, verwenden Sie einen Axon HS zwei, einen Kopftisch in einer Achsklemme zwei B-Verstärker, um Veränderungen des Membranpotentials zu erkennen.

Die Achsklemme zwei B ist eine Schnittstelle zu einem Computer, der die P-Klemmsoftware über die Zifferndaten 1322 A laufen lässt, die das Signal digitalisiert. Zeichnen Sie das Membranpotential auf einem PC auf. Wenden Sie mit der clamp X-Software Stimuli auf das motorische Axon an, um exzitatorische Membranpotentiale oder ejs zu erzeugen.

Sobald die ejs generiert sind, nehmen Sie die Miniatur-ejs über einen Zeitraum von drei Minuten ohne Stimuli-Synapse auf. Eine Soft-Mini-Analysesoftware kann verwendet werden, um die Spuren zu analysieren und die Mini-EJP-Amplitude und -Frequenz zu bestimmen. Um ejs zu generieren.

Verwenden Sie einen Master-Acht-Puls-Generator, um bis zum abgetrennten Ende eines Motoneuronenprogramms zu stimulieren. Der Generator liefert ein Programm für Rechteckimpulse von 0,3 Millisekunden. Ein Intervall von fünf Sekunden zwischen den Stimuli, um die synaptische Erholung zu ermöglichen.

Beim NMJ werden mindestens 10 evozierte Potentiale von jedem Muskel aufgezeichnet und die Amplituden gemittelt. Diese Abbildung zeigt eine typische Spur, die von Muskel sechs einer Wildtyp-Sallarve mit evozierten EJP-Antworten und spontanen Mini-EJ.PS Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man cy-Potentiale von der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Lava aufzeichnet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Dissektion innerhalb von drei bis 10 Minuten abzuschließen und die elektrophysiologischen Aufzeichnungen sofort zu starten, während die Zellen noch gesund und ansprechbar sind.

Wenn die Dissektion zu lange dauert, beträgt das Ruhemembranpotential der Muskelzellen weniger als minus 60 Millivolt, was zu gering ist, um es aufzuzeichnen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.