Co-Immunopräzipitation Test zur Untersuchung funktionalen Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen
28. September 2018
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für co-Immunopräzipitation und eine enzymatische Aktivität auf Perle Assay, den Beitrag der spezifischen Proteins Domänen der Plasmamembran Rezeptoren Enzym Rekrutierung und Enzym-Aktivität gleichzeitig zu studieren.
Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Zellsignalbereich zu beantworten, wie z. B. die Bedeutung verschiedener Proteindomänen in der Interaktion mit Rezeptorenzymen und der enzymatischen Aktivierung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie gleichzeitige Tests von Rezeptorenzym-Wechselwirkungen und die funktionellen Folgen dieser Wechselwirkung auf die Enzymaktivität ermöglicht. Verwenden Sie für jede Platte 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%penicillin und Streptomycin.
Am Tag vor der Transfektion samen menschliche embryonale Niere 293-T-Zellen in 12 10-Zentimeter-Platten mit einem Hämozytometer, um die Zellen zu zählen. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in 5%C02. Sobald die Zellen 80 bis 90 % konfluent sind, verwenden Sie ein lipidbasiertes Transfektionsmittel, um fünf der Platten zu transfekieren.
Führen Sie die Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers für Haftzellen in 10-Zentimeter-Platten durch. Dann transfezieren Sie einen identischen zweiten Satz von fünf Platten zusammen mit einer zusätzlichen Platte, die als nicht transfizierte Kontrolle für die Messung der exprimierten Proteinmenge vor der Immunpräzipitation dient. Inkubieren Sie die transfizierten Platten in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% CO2 für 48 Stunden.
Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die Zellen auf GFP-Expression zu untersuchen und sicherzustellen, dass die Transfektion erfolgreich stattgefunden hat. Mischen Sie 15 Mikroliter 100-Millimolar-Natriumorthovanadate mit 50 Mikroliter n.B. 30% Wasserstoffperoxid, um ein frisches Pervanadate-Gemisch herzustellen. Um die markierten Versionen von PD-1 zu phosphorylieren, entfernen Sie das Medium aus den transfizierten PD-1-GFP-Zellen.
Fügen Sie 10 Milliliter reines DMEM und 10 Mikroliter Pervanadate zu jeder Platte hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Danach die Zellen dreimal in eiskaltem PBS mit fünf Millilitern PBS pro Waschgang waschen.
Bei der Durchführung der Immunpräzipitation sollten alle Schritte entweder auf Eis oder bei vier Grad Celsius durchgeführt werden. Ergänzen Sie den Lysepuffer mit Proteasehemmern, indem Sie eine Tablette der Inhibitoren in 10 Milliliter Puffer auflösen. Fügen Sie dem Puffer, der auf den PD-1-GFP-transfizierten Platten verwendet wird, auch ein Millimolar Natriumorthovanadate hinzu.
Fügen Sie den Zellen 500 Mikroliter eiskalteLysepuffer hinzu, um den Lysepuffer, der das Natriumorthovanadate enthält, nur den Platten hinzuzufügen, die PD-1-GFP-transfizierte Zellen enthalten. Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen sofort zu entfernen und von den Platten zu sammeln. Die Lysate in 1,5-Milliliter-Kaltrohre geben und 30 Minuten lang bei 0,005-facher Schwerkraft und bei vier Grad Celsius drehen.
Um den Post-Nuklei-Überstand aus den Lysaten zu sammeln, drehen Sie sie bei 10.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in neue Schläuche und entsorgen Sie das Pellet. Bewahren Sie die Überräube für den zweiten Satz von sechs Platten auf Eis für die spätere WCL-Analyse auf.
Um mit der Vorbereitung von Anti-GFP-Perlen zu beginnen, schütteln Sie die Flasche mit den Perlen vor dem Öffnen vorsichtig, um eine Absetzung zu verhindern. Entfernen Sie 40 Mikroliter der Anti-GFP-Perlen aus der Gülle pro Zustand. Zentrifuge bei 500-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für drei Minuten.
Entfernen Sie den Überstand, um die Perlen zu waschen, und stellen Sie sicher, dass der Kontakt zwischen der Pipette und den Perlen minimiert wird, um Verlust zu vermeiden. Resuspend ieren die Perlen in 80 Mikroliter Lysepuffer pro Probe. Fügen Sie die gewaschenen Perlen direkt in das Zelllysat aus den PD-1-GFP-exemitten Zellen des ersten Satzes von vier Platten hinzu.
Drehen Sie bei 0,005-facher Schwerkraft 30 Minuten bei vier Grad Celsius, um die GFP-markierten Proteine zu immunisieren. Waschen Sie die Perlen dreimal mit einem Milliliter Kaltlysepuffer, der kein Orthovanadate für jede Wäsche enthält. Dann Zentrifuge bei 2, 500 mal Schwerkraft für 10 Sekunden.
Teilen Sie das Lysat des aktiven SHP2 aus dem ersten Satz der Platten in drei gleiche Portionen und fügen Sie jedem der drei Rohre, die die gewaschenen PD-1-GFP-haltigen Perlen enthalten, einen Teil hinzu. Fügen Sie 1/3 des Lysatvolumens aus den nicht transfizierten Zellen in die zweite Röhre der Wildtyp-, PD-1-GFP-Perlen. Entsorgen Sie die restlichen 2/3.
Bebrüte die Perlen vier Stunden lang bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation bei 0,005-facher Schwerkraft. Danach die Perlen zweimal mit einem Milliliter Kaltlysepuffer für jede Wäsche waschen. Fügen Sie 80 Mikroliter Lysepuffer zu jeder Probe hinzu, um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen in jedem Rohr 100 Mikroliter beträgt.
Mit einer geschnittenen Pipettenspitze, Pipette sanft nach oben und unten zu mischen. Dann 50 Mikroliter aus jedem Rohr in zwei, frische, 1,5 Milliliter Röhren übertragen. Waschen Sie die Perlen einmal mit Phosphatase-Waschpuffer.
Entfernen Sie dann den Überstand vollständig. Fügen Sie 100 Mikroliter Assaypuffer zu den Perlen hinzu und brüten bei 30 Grad Celsius 30 Minuten lang unter sanfter Erregung. Wenn der Puffer gelb wird, beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 Mikroliter einer Mollösung Natriumhydroxid hinzufügen.
Zentrifuge bei 2, 500-mal Schwerkraft für 10 Sekunden. Danach den Überstand in zwei Brunnen der halben Fläche in einer 96-Well-Platte übertragen. Lesen Sie die Absorptionsstoffe bei 405 Nanometern und drücken Sie die Ergebnisse als relative optische Dichte über die Kontroll-Wild-Typ-Version von PD-1-GFP aus.
Drehen Sie zuerst die Perlen bei 2.000 Mal Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. 20 Mikroliter des zweifachen Laemmli-Puffers hinzufügen und bei 95 Grad Celsius fünf Minuten kochen. Messen Sie mit einem BCA-Kit die Proteinkonzentration der Eingangskontrollen.
Übertragen Sie 30 Mikroliter der am häufigsten verdünnten Probe in ein neues Rohr. Verwenden Sie den Lysepuffer, um den Rest der Eingabesteuerungen auf die gleiche Konzentration wie die am häufigsten verdünnte Probe zu verdünnen. Dann übertragen Sie 30 Mikroliter jeder der verdünnten Eingangssteuerungen in ein neues Rohr.
Fügen Sie den Lysaten gleiche Volumina von zwei Mal Laemmli-Puffer hinzu und kochen Sie sie fünf Minuten lang um 95 Grad Celsius. Danach drehen Sie die Perlen bei 2.000-facher Schwerkraft und vier Grad Celsius für 30 Sekunden, bevor Sie western Blot-Analysen durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. In dieser Studie wird ein kombinierter Co-Immunpräzipations- und enzymatischer Aktivitätstest für die parallele Bewertung von Rezeptorenzym-Wechselwirkungen und -Aktivierung entwickelt.
Es überrascht nicht, dass SHP2 nicht an PD-1 gebunden werden konnte, als ITSM mutierte. Bemerkenswerterweise hemmte die mutierte Version der ITIM die SHP2-Bindung nur bedingt. Dennoch zeigt der SHP2-Phosphatase-Aktivitätstest, dass ITIM und ITSM für die enzymatische Aktivität gleichermaßen unverzichtbar sind.
Dies zeigt ein zweistufiges Aktivierungsmodell, bei dem SHP2 unter Ruhebedingungen in eine autohemmte Konformation gefaltet wird. Nach Aktivierung von PD-1 wird SHP2 an das phosphorylierte ITSM rekrutiert. Das ITIM muss jedoch auch phosphoryliert werden, um SHP2 in seine aktive Konformation zu entfalten.
Nach seiner Entwicklung kann diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellsignalisierung ebnen, um die Funktion von Proteindomänen in Rezeptor-Enzym-Wechselwirkungen zu erforschen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Ko-Immunpräzipitation und einen enzymatischen Aktivitätsnachweis an den Bäden vor, um die Rolle spezifischer Proteindomänen in Plasmamembranrezeptoren zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung der Enzymrekrutierung und -aktivität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zelluläre Signalübertragung
- Proteinwechselwirkungen
- Enzymaktivitätsanalysen
Hintergrund
- Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen ist entscheidend für die Zellsignalübertragung.
- Unterschiedliche Proteindomänen können die enzymatische Aktivierung beeinflussen.
- Diese Technik liefert Einblicke in die funktionellen Konsequenzen dieser Wechselwirkungen.
- Sie ermöglicht gleichzeitige Untersuchungen von Wechselwirkungen und Aktivität.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Bedeutung von Proteindomänen bei Rezeptorinteraktionen.
- Beurteilung des Einflusses dieser Interaktionen auf die Enzymaktivität.
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Untersuchung dieser Prozesse.
Verwendete Methoden
- Ko-Immunpräzipitationstechnik.
- Enzymaktivitätsmessung an Beads.
- Verwendung von humanen embryonalen Nierenzellen 293-T für die Transfektion.
- Zellkultur in DMEM mit Zusätzen.
Hauptergebnisse
- Die Methode zeigt wirksam die Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Enzymen auf.
- Sie macht die funktionellen Folgen dieser Wechselwirkungen sichtbar.
- Bestimmte Proteindomänen beeinflussen die Enzymaktivität erheblich.
- Das Protokoll ist reproduzierbar und zuverlässig für weitere Untersuchungen.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ist wertvoll für die Untersuchung der Dynamik von Rezeptor-Enzymen.
- Es vertieft das Verständnis von Zellsignalisierungsmechanismen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf diesen Erkenntnissen aufbauen, um verwandte Fragestellungen zu untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen und der funktionellen enzymatischen Aktivität und schließt damit eine entscheidende Lücke bei der Target-Validierung, da Bindungsdaten allein keine funktionellen Ergebnisse vorhersagen können. Durch die Verknüpfung spezifischer Rezeptordomänen mit Enzymaktivierungszuständen liefert sie eine mechanistische Entschärfung von Risiken für frühe Entdeckungsprogramme, die auf Signaltransduktionswegen fokussiert sind. Der Ansatz unterstützt eine vorhersagende Sicherheit bei der Identifizierung von Leitstrukturen, indem er zwischen bindungsfähigen und aktivierungsfähigen molekularen Interaktionen unterscheidet.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem getestet wird, ob bestimmte Proteindomänen für die Rezeptorbindung und die nachgeschaltete Enzymaktivierung obligatorisch sind.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Target-Validierung, indem physische Interaktionen mit messbaren enzymatischen Ergebnissen in einem einzigen Assay korreliert werden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem Domänen identifiziert werden, die funktionale Konsequenzen hervorrufen, nicht nur Bindung, wodurch falsch-positive Ergebnisse bei der Target-Auswahl reduziert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Aktivitätsmessungen (z. B. relative optische Dichte), die eine zuverlässige Untersuchung von Verbindungen oder Mutanten gegenüber Rezeptor-Enzym-Komplexen ermöglichen.
- Reproduzierbarkeit: Verwendet kontrollierte Lyse, Immunpräzipitation und Aktivitätsbedingungen an der Matrix, um die Variabilität zwischen Wiederholungen und Laboren zu minimieren.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Mehrfach-Well-Formaten zur mittelhochdurchsatzfähigen Bewertung von Domänenmutanten oder therapeutischen Varianten.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar auf Rezeptor-Enzym-Paare, die an der Immunsignalübertragung beteiligt sind (z. B. PD-1/SHP2), zur Unterstützung der Target-Validierung in Modellen von Onkologie und Autoimmunerkrankungen.
- Translationaler Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit präklinischen Arbeiten, indem validiert wird, dass Domänenmutationen, die die Enzymaktivität in vitro beeinflussen, funktionelle Ergebnisse in zellulären Kontexten vorhersagen.
- Mechanistische Entschärfung von Risiken: Klärt Aktivierungsmechanismen (z. B. zweistufige Entfaltung von SHP2) auf, um die strukturbasierte Entwicklung allosterischer Modulatoren oder Inhibitoren zu unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Identifizierung ein und liefert funktionelle Interaktionsdaten, die bei der Entscheidungsfindung von Hit zu Lead in Signalwegprogrammen unterstützen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem Mutationen in Rezeptordomänen mit Veränderungen der Enzymaktivität verknüpft werden, um den Wirkmechanismus über die Bindungsaffinität hinaus zu klären.
- Screening: Liefert quantitative Messungen der enzymatischen Aktivität, die einen Vergleich von Wildtyp- und Mutantenrezeptoren unter standardisierten Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Gibt normalisierte relative Extinktionswerte bezogen auf Kontrollen aus und ermöglicht so den statistischen Vergleich von Aktivierungszuständen zwischen experimentellen Gruppen.
- Translationale Forschung: Verbindet funktionelle Daten auf Domänenebene mit präklinischer Relevanz, indem gezeigt wird, wie die Phosphorylierungszustände von ITSM und ITIM die SHP2-Aktivität regulieren.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung beliebiger Rezeptor-Enzym-Paare, bei denen die funktionellen Konsequenzen der Interaktion für die Target-Validierung entscheidend sind.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem Bindungsdomänen von Aktivierungsdomänen in Rezeptor-Enzym-Komplexen unterschieden werden.
- Operationaler Wert: Standardisiert die ko-immunpräzipitative Analyse mit funktionellen Endpunkten und verbessert dadurch die Reproduzierbarkeit sowie den Vergleich zwischen verschiedenen Forschungsteams.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem funktionelle Validierungsdaten früher in der Entdeckungspipeline bereitgestellt werden, wodurch die Ausscheidung in späteren Phasen reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend sowohl auf der Stärke der Interaktion als auch auf deren funktionellen Konsequenzen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Immunpräzipitation, Kinasensignalgebung und Optimierung enzymatischer Assays.
- Setzt den Zugang zu Lysepuffern mit Phosphatase- und Proteaseinhibitoren sowie Instrumentierung für Zentrifugation und Absorptionsmessung voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Transfektionseffizienz und Expressionslevel über verschiedene Bedingungen hinweg, um vergleichbare Immunpräzipitationsausbeuten sicherzustellen.
- Die Anpassung an alternative Modellsysteme kann eine Optimierung der Lysebedingungen und der Kompatibilität zwischen Antikörpern und Beads erfordern.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Notwendigkeit radioaktiver oder kolorimetrischer Substrate, die mit Bead-gebundenen Assays kompatibel sind, sowie das Risiko von Störungen durch die Beads in nachfolgenden Western-Blot-Analysen.
