Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Quantitative Multiplex-Co-Immunpräzipation (QMI) ermöglicht es Benutzern, gleichzeitig Hunderte von binären Wechselwirkungen in einem vordefinierten Proteininteraktionsnetzwerk zu messen. Durch die gleichzeitige Durchführung mehrerer Co-IPs im selben Lysat können Bioinformatik-Techniken dann untersuchen, wie sich Gruppen von Co-Verbänden koordiniert verändern. Die Entwicklung des Assays ist zeitaufwändig, aber sobald das QMI-Panel in der Hand ist, können Netzwerk-Skala-Daten über Signaltransduktionssysteme in einem relativ einfachen Nachttest gesammelt werden.

QMI erfordert die genaue Pipettierung verschiedener Proben und Reagenzien in 96 Bohrplatten. Beim Einrichten und Ausführen jedes Assays sollten sorgfältige Hinweise gemacht werden, um Fehler zu vermeiden. Für die Probenvorbereitung und Immunpräzipitation beginnen Sie mit der Lysierung der Probe in einem geeigneten Reinigungsmittel mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren für eine 15-minütige Inkubation auf Eis.

Am Ende der Inkubation drehen Sie die Probe herunter, um die Membranen und Ablagerungen zu entfernen, und führen Sie einen BCA-Test auf den Überstand durch, um die Proteinkonzentration gemäß Standardprotokollen zu bestimmen. Nach der Normalisierung der Proteinkonzentrationen bereiten Sie einen magnetischen Perlenstammmix vor, der pro Brunnen etwa 250 magnetische Perlen jeder Klasse enthält. Verwenden Sie die magnetische Trennung, um die magnetische Perlenmischung zweimal im Fly P Puffer zu waschen, bevor Sie die Perlen in 20 Mikroliter Fly P Puffer pro Probe wieder aufhängen.

Nach einer gründlichen Pipettierung, aliquot 20 Mikroliter Perlen in einem eiskalten Mikrozentrifugenrohr pro Probe und fügen Sie gleiche Mengen an Lysat mit normalisierten Proteinkonzentrationen zu jeder Röhre für Immunpräzipitation. Dann teilen Sie jede Lysatprobe in ein Rohr für jede Platte, die ausgeführt wird, und immunprezipitieren Sie die Proben auf einem Rotator bei vier Grad Celsius über Nacht vor Licht geschützt. Am nächsten Morgen verwenden Sie ein magnetisches Perlengestell, um das Lysat aus dem ersten Satz von Rohren zu entfernen und die Perlen zweimal in 500 Mikroliter eiskalten Fly P Puffer pro Wäsche zu waschen.

Nach der Berechnung des Resuspensionsvolumens die Immunpräzipitationen im berechneten Volumen des eiskalten Fly P-Puffers wieder aussetzen. Setzen Sie die magnetischen Perlen gründlich durch sanftes Pipettieren wieder auf und verteilen Sie 25 Mikroliter Perlen pro Brunnen über eine flache 96-Well-Platte auf Eis. In einer anderen 96-Well-Platte durch attinilierte Sondenantikörper auf eine zweifache Arbeitskonzentration verdünnt.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 25 Mikroliter jeder Sonde Antikörperverdünnung in die entsprechenden Brunnen der magnetischen Perle mit Assay-Platte zu verteilen und schütteln Sie mit hoher Geschwindigkeit auf einem horizontalen Plattenschüttler, um die magnetischen Perlen zu mischen und wieder aufzusetzen. Nach dem Mischen die Geschwindigkeit für eine stunde inkubation bei vier Grad Celsius vor Licht geschützt reduzieren. Am Ende der Inkubation die Platte dreimal mit frischem Fly P Puffer pro Wäsche auf einer magnetischen Plattenscheibe bei vier Grad Celsius waschen.

Nach der letzten Wäsche, die Perlen in 50 Mikroliter Streptavidin PE verdünnt ein bis 200 in Fly P Puffer. Schütteln Sie die Mischung und setzen Sie die Perlen wieder auf, bevor Sie die Platte bei vier Grad Celsius für 30 Minuten vor Licht geschützt inkubieren. Am Ende der Inkubation, waschen Sie die Platte dreimal mit Fly P Puffer auf einer magnetischen Platte Waschmaschine bei vier Grad Celsius und suspendieren Sie die Perlen in 125 Mikroliter Fly P Puffer.

Schütteln Sie die Platte eine Minute lang bei 900 Umdrehungen, um die Perlen gründlich wieder aufzuhängen und laden Sie die Platte in ein wiedergekühltes Durchflusszytometer. Wählen Sie in der Durchfluss-Zytometer-Software die Einstellung "Hohes RP1-Ziel", eine Stoppbedingung von 1.000 Perlen pro Region und ein Probenvolumen von 80 Mikrolitern aus. Halten Sie den Lauf auf halbem Weg an und setzen Sie die Perlen wieder aus, um eine Abgewöhnung zu verhindern.

Exportieren Sie am Ende der Ausführung die Datendateien im XML-Format. Um eine ANC-Analyse durchzuführen, füllen Sie die ANC-Eingabedatei aus, um die Details des experimentellen Entwurfs widerzuspiegeln, und führen Sie das Programm aus, das eine CSV-Datei in das Active Directory schreibt. Die Datei endet in Treffern.

csv wird die Protein-Co-Assoziationen melden, die sich bei einem falsch positiven Niveau von 0,05 zwischen der Kontrolle und den experimentellen Bedingungen in mindestens drei von vier experimentellen Replikationen signifikant unterscheiden. Fügen Sie für die gewichtete Korrelationsnetzwerkanalyse die Spaltentitel der Datendateiausgabe von Matlab ein, die mit mfi endet. csv in die erste Spalte einer neuen Kalkulationstabelle und fügen Sie die Spalten Experiment für Experimentnummer und Behandlung für experimentelle Behandlung und alle anderen zu analysierenden Variablen hinzu.

Speichern Sie diese Datei als Merkmale. csv und öffnen R Studio. Legen Sie das Arbeitsverzeichnis auf einen Ordner fest, der das mfi enthält.

csv und Eigenschaften. csv-Dateien, markieren Sie Codeabschnitte, und drücken Sie Befehlseingabe, um die R-Befehle auszuführen, wie in der kommentierten Befehlsdatei angegeben. Die gewichteten Korrelationsnetzwerkanalysemodule, die signifikant mit jedem experimentellen Merkmal korreliert sind, werden als Grafikdatei ausgegeben und die Korrelation jeder Interaktion mit jedem Modul wird als CSV-Datei ausgegeben.

Identifizieren Sie für jede Interaktion in der ANC-Ausgabedatei, ob diese Interaktion auch von CNA signifikant ist, und erstellen Sie eine neue Spalte, die angibt, ob jeder ANC-Treffer auch ein CNA-Treffer ist. Konvertieren Sie die Werte, um zwei Falten zu protokollieren, und berechnen Sie den Durchschnittswert für alle ANC-Union-CNA-Treffer. Erstellen Sie schließlich eine neue Kalkulationstabelle mit jedem ANC-Union-CNA-Treffer, der durch sein Immunitizipationsziel in einer Spalte, sein Prüfpunktziel in der zweiten Spalte und seinen Faltänderungswert in der dritten Spalte aufgeführt ist.

Importieren Sie diese Datei in Cytoscape als Netzwerk, um ein Knotenkantendiagramm zu erstellen. Proteininteraktionen mit hoher Sicherheit, die durch die beiden unabhängigen statistischen Ansätze identifiziert werden, werden als Knotenkantendiagramme mit der Open-Source-Software Cytoscape oder als Heatmaps unter Verwendung des R-Codes und der Analyseanweisungen im Ergänzenden Material visualisiert. Während des gesamten Protokolls müssen Benutzer darauf achten, pipette genau zu pipette, sorgfältige Aufzeichnungen zu führen und die Proben jederzeit kalt zu halten.

Wir haben QMI verwendet, um zu verstehen, wie Signaltransduktionswege zwischen verschiedenen Eingangstypen unterscheiden und Informationen von mehreren Rezeptoren integrieren.