Name: Entwicklung eines In Vitro Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Gel-Kontraktionsanalyse zur Bewertung der Kontraktilität mesenchymaler Zellen nach epithelial-mesenchymaler Transition. Diese zugängliche Methode erleichtert die Erforschung entzündlicher Erkrankungen wie idiopathische Lungenfibrose.

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Wir danken Dr. Tadashi Koyama für die technische Hilfe. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; ein Stipendium für die Forschungsgruppe für Atemversagen des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales; ein Stipendium für die Erforschung allergischer Erkrankungen und Immunologie, Japan.

1. Vorbereitung und Kultur von Lungenepithelzellen <ol><li> Kultur A549 humanen Lungenepithelzellen (adhärente Zelllinie) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie die Zellkulturmedien von Kulturschale und wäscht einmal mit 5: - 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS. </li><li> 2 ml Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (0,05%) und inkubiere bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 min. </li><li> Sammle die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, enthaltend Zellkulturmedium, zentrifugieren die Röhrchen bei RT für 4 min bei 150 × g. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 2 ml Zellkulturmedium pelletieren und eine Probe für die Zellzählung entfernen. Zählen Sie die Anzahl der Zellen einer Zählkammer mit Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen. </li><li> Seed A549-Zellen auf10 cm Polystyrol - Platten in einer Dichte von 0,5-1,0 x 10 6 Zellen / Schale mit 10 ml Medium für Gelkontraktion Assays. Seed die Zellen auf 6 - Well - Polystyrol - Platten mit einer Dichte von 0,5 bis 1,0 × 10 5 Zellen / Vertiefung mit 2 ml Medium für EMT Bestätigung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Std. </li></ol> 2. EMT Verfahren <ol><li> Zugabe von 10 &amp; mgr; l von TGF-β1 (5 ug / ml) und 10 &amp; mgr; l TNF-α (10 ug / ml) auf die Platte für Gelkontraktion Assay ausgesät in Schritt 1.6. Hinzufügen 2 ul TGF-β1 (5 ug / ml) und 2 &amp; mgr; l TNF-α (10 ug / ml) auf die Platte für EMT Bestätigung ausgesät in Schritt 1.6. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 48 Stunden. </li></ol> 3. Bestätigung der EMT Verfahren durch PCR und Western Blot <ol><li> Bestätigen Änderung in der Morphologie (von Kopfsteinähnliche Form auf die Spindel) der behandelten Zellen unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie. Hinweis: Normal A549 Zellen haben Cobble stone förmig und dreieckig geformte Optik , die ein Merkmal von Epithelzellen, aber nach Stimulation mit TGF-β1 und TNF-α, erscheinen die Zellen lang und spindelförmige daß ähnelt Mesenchymzellen 14,15. </li><li> Bewerten Sie die Expression eines epithelialen Marker, wie zum Beispiel E-Cadherin und mesenchymalen Marker, wie zB N-Cadherin, Vimentin und α-Glattmuskelaktin unter Verwendung von PCR oder Western-Blot. <ol><li> Extrahieren der Gesamt - RNA aus den Zellen unter Verwendung von RNA - Extraktions - Kits 16 und synthetisieren cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase 17 gemäß dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Messen Sie die Expression von mRNA - Spiegel unter Verwendung von Echtzeit - PCR - System 18 und monomeren Cyaninfarbstoff PCR - Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Die spezifischen Primer für GAPDH (Glycerinaldehyd - 3-phosphat - Dehydrogenase), ACTA2 (alpha-Actin-2), CDH1 (Cadherin-1; E-Cadherin) und VIM (Vimentin) sind in Tabelle 1 gezeigt </strong&gt;. </li><li> Lysieren die Zellen eine Lyse - Puffer (Tabelle 2) Lösung , die 1% Protease - Inhibitor - Cocktail verwendet. Messen alle Probenproteinkonzentrationen unter Verwendung eines Protein - Assay - Kit 19,20, und die gleichen Mengen an Protein zu einem Polyacrylamidgel. <ol><li> Führen SDS - Gel-Elektrophorese und halbtrockenen Transfer der Proteine ​​auf eine PVDF - Membran 21. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern in Blocking-Puffer mit 1 - 2 Stunden. Nach der Inkubation waschen zweimal die Membran mit Waschpuffer und Inkubation der Membran 1 Stunde mit dem zweiten Antikörper. Hinweis: Lesen Sie die Materialien / Ausrüstung Tabelle für Antikörper und in diesen Studien verwendeten Verdünnungen. Siehe Tabelle 2 für die Komponenten der Blocking - Puffer. </li><li> Waschen Sie die Membran mit Waschpuffer zweimal. Machen Sie Fotos von der Membran mit der Western - Blot - Nachweis - Kit 22 eine kalte CCD - Kamera 11,23 verwenden. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Gelkontraktion Assay zur Beurteilung von EMT <ol><li> Aspirieren den konditionierten Medien aus dem Zellkulturgefäß, und wäscht gut mit von 5 bis 10 ml PBS abgestorbene Zellen zu entfernen. Nach dem Waschen aspirieren sofort die PBS. </li><li> 2 ml 0,05% Trypsin / EDTA und Inkubation bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3 min. </li><li> Sammeln Sie die abgelösten Zellen in Zentrifugenröhrchen, das DMEM mit Trypsin-Inhibitor ergänzt (1 mg / ml), Zentrifuge die Röhrchen bei RT für 4 min bei 150 × g. </li><li> Mix Typ-1-Kollagen-Gel mit destilliertem Wasser, und 4 × konzentriert DMEM anpassen, um die Volumina einer Kollagenkonzentration von 1,75 mg zu erreichen / ml und 1 × DMEM Konzentration. Achten Sie darauf, während dieser Schritt das Gel-Medium auf Eis zu halten. Hinweis: Um 6 ml Gel-Medium zu machen, gut mischen 3,5 ml Typ-1-Kollagen-Gel (3 mg / ml), 1,5 ml 4 × konzentriert DMEM, und 1 ml destilliertem Wasser. </li><li> eine Probe für die Zellzählung Resuspendieren des Zellpellets in 500 &amp; mgr; l PBS und zu entfernen. Grafdie Anzahl der Zellen, die ein Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung mit der Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen. </li><li> Füge das Gelmedium das Volumen einzustellen , um eine Zelldichte von 3,0 × 10 5 Zellen zu erreichen / Vertiefung (6,0 × 10 5 Zellen / ml) und sanft , aber es schnell und ohne Gelbildung durch Pipettieren gemischt. </li><li> Dispense 0,5 ml des Gemisches in jede Vertiefung einer 24-Well nicht behandelten Platte schnell und sorgfältig gepflegte zylindrische Form zu machen. Achten Sie darauf , keine Luftblasen zu ermöglichen , die Gele (1A) zu verunreinigen. Hinweis: Das Gelmedium, die Zellen enthält, viskos ist und kann leicht gelieren und Form sichelförmige Form in dem Bohrloch. </li><li> Inkubiere die Platte für 15 min in einem Zellinkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit vollständig zu gelieren. </li><li> Lösen sich von der Platte Gelen ohne Brechen durch einen sterilisierten Spatel in einer Weise bewegt einen Umfang in eine Richtung zu ziehen. Mit einem Spatel übertragen sanft die Gele bis 60 mm Gewebekulturschalendie 5 ml DMEM / 1% FBS mit oder ohne TGF-β1 (5 ng / ml) und TNF-α (10 ng / ml). </li><li> Sie vorsichtig die Gerichte schütteln Gele auf dem Medium schweben zu gewährleisten. Inkubieren in einem Zellinkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Luftfeuchtigkeit. </li></ol> 5. Messung der Gel-Größe <ol><li> Messen der Größe Kollagengel nach 0, 24, 48 und 72 h ein Bildanalysesystem verwendet wird. <ol><li> Schalten Sie das Geldokumentationssystem (2A), und stellen Geschirr in die Lichtabschirmungs Schrank. Dann nehmen Sie den Deckel von Geschirr im Schrank. </li><li> Öffnen Sie die zugehörige Gel Analysesoftware. Klicken Sie auf die &quot;Bildaufnahme-Taste&quot; in der Menüleiste, um das Bild der Gele im Schrank zu zeigen. Klicken Sie dann auf &quot;Acquire&quot; in der Menüleiste Bilder der Gele (2B) zu nehmen. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Erkennung Taste&quot; in der Menüleiste (Abbildung 2C) und stellen Sie den Messbereich (gelber Kreis in 2C) durch Ziehen der Maus. Klicken Sie dann auf die &quot;Auto-detect - Taste&quot; in der Menüleiste (siehe Taste in 2D). Die Software erkennt automatisch die Gele zeigt eine Heatmap (2D). </li><li> &quot;OK&quot; klicken , zu extrahieren , die Umrisse der Gele durch Bildverarbeitung und auf Gebieten , die von der Gliederung (Abbildung 2E) umgeben berechnen. Nachdem die Fläche berechnet wird, wird die berechnete Fläche in separaten Popup-Fenster angezeigt. Hinweis: Wenn die Gele einander während der Bildgebung überlappen, Gele bewegen vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Das Protokoll in dieser Studie entwickelt umfasst zwei Schritte. Der erste Schritt wird durchgeführt, EMT zu induzieren, während der zweite Schritt ist die Gelkontraktion Assays. Da es wichtig ist, um zu bestätigen, dass die Zellen EMT unterzog, Stufe 2 bietet eine hervorragende Ergänzung zu den morphologischen und Veränderungen der Genexpression. Frühere Studien zeigten , dass EMT von A549 - Zellen durch TGF-β1 induzierten wurde nur 24; aber, wie wir vorher 10, TNF-α - Behandlung berichtet wurden ...

Fibrose ist in der Pathogenese verschiedener chronisch progressive Erkrankungen, wie interstitielle Lungenerkrankung, Herzfibrose, Leberzirrhose, terminalem Nierenversagen, systemischer Sklerose, Autoimmunerkrankung und 1 beteiligt. Unter interstitiellen Lungenerkrankungen, ist idiopathischer pulmonaler Fibrose (IPF) ist eine chronische progressive Krankheit und zeigt eine schlechte Prognose. Pathologisches Merkmal der IPF ist die Entwicklung von fibroblastischen Foci von aktivierten Fibroblasten und Myofibroblasten besteht, die mit der Prognose assoziiert sind. Die Ursprünge solcher Lungenfibroblasten vorgeschlagen von mehreren mesenchymalen Zellen abgeleitet werden, einschließlich ursprünglich resident Lungen Fibroblasten und Fibrozyten aus Knochenmark zirkuliert. Vor kurzem epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) wurde mit der Bildung von mesenchymalen Zellen 2, in Verbindung gebracht werden vorgeschlagen und zur Pathogenese von fibrotischen Erkrankungen beizutragen. Es wird vermutet, dass EMT spielt eine wichtige Rolle im Prozess der fötalen Entwicklung, Wundheilung, und das Fortschreiten von Krebs, einschließlich der Tumorinvasion und Metastasierung 3. Nach dem Prozess des EMT, erhalten Epithelzellen die Fähigkeit der mesenchymalen Zellen , die durch Verlust von epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und durch Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle actin (SMA) 4,5. Frühere Studien zeigten die Hinweise , dass EMT Verfahren hat sich mit der Entwicklung von Gewebefibrose in der Niere und der Lunge 6 7 verbunden. Darüber hinaus fördert die chronische Entzündung fibrotischen Erkrankung 8; Ferner, wie inflammatorische Zytokine wie Tumor - Nekrose - Faktor -Superfamilienmitglied 14 (TNFSF14; LIGHT), Tumor - Nekrose - Faktor (TNF) -α, und Interleukin-1β wurden EMT 9-12 gezeigt , zu verbessern. Collagen-Gel Kontraktion Assay, ein Kollagen-basierte Zellkontraktion Test, bei dem Fibroblasten in Typ I eingebettet sindKollagengel dreidimensional, ist ein ideales in vitro - Modell für die Bewertung der Kontraktilität. Kontraktionsfähigkeit ist eines der charakteristischen Funktionen von Fibroblasten und trägt zu einer normalen Wundheilung und Fibrose 13. In diesem Test wird angenommen, dass die Bindung von Fibroblasten Integrin-abhängige Mechanismen Kollagen durch sollen Typ I mechanische Spannung unter bestimmten Bedingungen zu erzeugen, und damit zur Gewebekontraktion führen. Hierbei wird die Entwicklung der Gelkontraktion Assays berichtet angepasst werden, um die Übernahme der kontraktilen Funktion in den Zellen zu bewerten, die EMT unterzog. Dieser Bericht zeigt, dass sich diese modifizierte Test zur Bewertung der Kontraktilität in mesenchymalen Zellen geeignet ist, die EMT unterzog.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>Für A549 Medium</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Transforming Growth Factor-&beta; 1, menschliche, rekombinante</td><td>Wako Laborchemikalien</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes TNF-&alpha;</td><td>Forschung & Forschung D systems</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie</td><td></td><td>#3195</td><td>1:3.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Vimentin (D21H3) Kaninchen-mAb-Zellsignaltechnologie</td><td></td><td>#5741</td><td>1:3.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Tubulin-Antikörper</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>1:10.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-Aktin, &alpha;-Antikörper für glatte Muskeln& nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-N-Cadherin Antikörper</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-Maus IgG, HRP-linked Whole Ab Sheep (sekundärer Antikörper)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-Kaninchen IgG, HRP-linked Whole Ab Donkey (sekundärer Antikörper)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% in TBS-T</td></tr><tr><td>6 Well Clear Flat Bottom TC-behandelte Multiwell-Zellkulturplatte, mit Deckel</td><td>Corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Zellkulturschale</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>Pulverlebensdauer Technologien</td><td>12100-046</td><td>Für 4&fach; DMEM</td></tr><tr><td>Typ 1 Kollagen Gel</td><td>Nitta Gelatine</td><td>Cellmatrix Typ I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Zellkulturplatte</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Gel Dokumentationssystem&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gel-Imager</td></tr><tr><td>Gel-Analysesoftware</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, Version 3.00</td><td>Analysesoftware im Bundle mit AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05 %), Phenolrot-Life-Technologien</td><td></td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten, unbehandelt</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung, 0,4 %</td><td>Life-Technologien</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Extraktionskit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Lebenstechnologien</td> für<td>reverse Transkriptase</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Echtzeit-PCR-System</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR grünes PCR-Kit</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail (100x)</td><td>life technologies</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>PVDF-Membran</td><td>ATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Protein-Assay-Kit</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamid-Gel</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Western-Blotting-Detektionsreagenz</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Kalte CCD-Kamera</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen (20)Sorbitan-Monolaurat</td><td>Wako Laborchemikalien</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylen (9)-octyiphenylether</td><td>Wako Laborchemikalien</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

entwicklung eines<em&gt; in vitro</em&gt; assay kontraktionsfunktion von mesenchymalen zellen, die unterzog epithelial-mesenchymale transition zur bewertung

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrose ist häufig an der Pathogenese verschiedener chronisch fortschreitender Krankheiten wie der interstitiellen Lungenerkrankung beteiligt. Pathologisches Kennzeichen ist die Bildung von fibroblastischen Herden, die mit der Schwere der Erkrankung verbunden ist. Es wird vorgeschlagen, dass mesenchymale Zellen, die aus den fibroblastischen Herden bestehen, aus mehreren Zellquellen stammen, einschließlich ursprünglich residenter intrapulmonaler Fibroblasten und zirkulierender Fibrozyten aus dem Knochenmark. In jüngster Zeit sollen auch mesenchymale Zellen, die eine epithelial-mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben, zur Pathogenese der Fibrose beitragen. Darüber hinaus kann EMT durch die Transformation des Wachstumsfaktors β induziert werden, und EMT kann durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor α verstärkt werden. Der Gelkontraktionsassay ist ein ideales in vitro Modell zur Beurteilung der Kontraktilität, die eine der charakteristischen Funktionen von Fibroblasten ist und zur Wundheilung und Fibrose beiträgt. In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Fähigkeit von mesenchymalen Zellen demonstriert, die einer EMT unterzogen wurden.

Während EMT, verlieren Epithelzellen epithelialen Marker, wie E-Cadherin, und gewinnen die Expression von mesenchymalen Marker, wie Vimentin und α-smooth muscle 4,5 Aktin. Inkubation von menschlichen A549 Lungenepithelzellen mit TGF-β1 und TNF-α induziert EMT. Das Erscheinungsbild der normalen A549 - Zellen sind Cobble Stein wie Form und Dreiecksform , die ein Merkmal von Epithelzellen (3A), aber nachdem sie mit TGF-β1 und TNF-α stimuliert, änderte sich das Au...

Hier beschreiben wir die Entwicklung und Anwendung eines Gelkontraktionsassays zur Bewertung der kontraktilen Funktion in mesenchymalen Zellen, die einen epithelial-mesenchymalen Übergang durchlaufen haben.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kontraktilität von mesenchymalen Zellen zu bewerten, die in vitro eine inflamatorische Zytokin-induzierte epitheliale mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben. Dieses Mesenchym ist eine Variation der grundlegenden Zellfunktion nach EMT, die durch entzündliche Immunreaktionen induziert wird, wie z. B. bei idiopathischer Lungenfibrose oder Atemwegsumbau bei schwerem Asthma. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie keine speziellen Geräte erfordert und dass sie einen hohen Gehalt aufweist. Demontiert wird das Verfahren von Hideyuki Takeshima und Kosuke Makita, Doktoranden aus meinem Labor.Beginnen Sie mit dem Waschen einer Kultur von A-549 menschlichen Lungenepithelzellen mit fünf bis zehn Milliletern PBS. Als nächstes lösen Sie die anhaftenden Zellen mit zwei Milliletern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid ab. Nach drei Minuten wird die Zellsuspension in konische Röhrchen mit Zellkulturmedium überführt und die Zellen in einer Zentrifuge geschleudert.Die Pellets werden in zwei Milliletern Zellkulturmedium resuspendiert und ein kleines Eloquat für die Zählung aufbewahrt. Dann säen Sie 0,5 bis 1 mal 10 bis 6. Zellen in zehn Millileter Medium pro zehn Zentimeter Polysterenschale aus und inkubieren Sie die Zellkulturen 24 Stunden lang. Für die EMT-Induktion behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag mit 10 Mikrolitern TGF beta 1 und TNF alpha und stellen Sie die Platten für weitere 48 Stunden in den Inkubator.Waschen Sie am vierten Tag die EMT-induzierten Kulturen mit fünf bis zehn Milliletern PBS und lösen Sie dann die Zellen mit Trypsin-EDTA ab, wie gerade gezeigt. Als nächstes werden die Zellsuspensionen in DMEM, ergänzt mit einem Tryspsin-Inhibitor, heruntergeschleudert und die Pellets in 500 Mikrolitern pbs resuspendiert. Zählen Sie dann die Zellen und fügen Sie frisch zubereitetes Gelellmedium mit einer Dichte von 3 mal 10 bis zu den 5. Zellen pro Vertiefung hinzu, wobei Sie die Lösung vor der Gelierung vorsichtig aber schnell mit einer Pipette mischen.Geben Sie sofort, aber vorsichtig, 0,5 Millileter Zellen in jede Vertiefung einer unbehandelten 24-Well-Platte in sauberer, zylindrischer Form. Legen Sie die Platte dann für 15 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator. Wenn das Gel vollständig erstarrt ist, bewegen Sie einen sterilisierten Spatel in einem Kreis um die Außenseite jedes Gels in eine Richtung, um die Gele von den Platten zu lösen, ohne zu brechen.Achten Sie beim Entfernen des Gels darauf, den Spatel nicht in der Vertiefung hin und her zu bewegen. Anschließend werden die Gele mit dem Spatel vorsichtig in einzelne 16-Millimeter-Gewebekulturschalen überführt, die fünf Millileter DMEM enthalten, ergänzt mit einem Prozent FBS, mit oder ohne TGF beta 1 und TNF alpha. Schütteln Sie abschließend die Schalen vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Gele auf dem Medium schwimmen, und geben Sie die Gele wieder in den Zellkultur-Inkubator.Unbehandelte a541-Zellen zeigen ein kopfsteinpflasterartiges und dreieckiges Aussehen, das für Epithelzellen charakteristisch ist. Nach ihrer Stimulation mit TGF beta 1 und TNF alpha zeigen die Zellen jedoch eine lange Spindelform, ähnlich wie bei mesynchemalen Zellen. Die QRTCPR der epithelialen und mesynchemalen Markerexpression vor und nach der EMT zeigt, dass A541-Zellen, die 48 Stunden lang mit inflammatorischen Zytokinen behandelt wurden, eine signifikant reduzierte Expression von CDH1 und eine signifikant erhöhte Expression von VIAM und ACTA2 aufweisen.Darüber hinaus schwächt die Stimulation mit diesen Zytokinen die E-Cadherin-Expression ab, wie sie durch westliche Blutanalyse bestimmt wird, während die Expression von Vimentin, N-Cadherin und Alpha-Aktin der glatten Muskulatur induziert wird. In einem Gelkontraktionsassay sind nach 48 Stunden die Gele, die mit TGF beta 1 und TNF alpha behandelte Zellen enthalten, kleiner als die kontrollierten Gele, die mit PBS behandelte Zellen enthalten. Tatsächlich ist nach 72 Stunden die Größe der Gele, die die mit Zytokinen behandelten Gele enthalten, im Vergleich zu den kontrollierten Gelen, die mit einem Gelanalysator gemessen wurden, signifikant reduziert.Wie bereits erwähnt, können die Schritte der Gelkontraktion in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, zu bestätigen, dass die EMT erfolgreich induziert wurde, bevor Sie den Gel-Contracting-Assay durchführen. Nach der Beobachtung bietet diese Technik die Möglichkeit, den EMT-Prozess während eines Entzündungszustands wie Fibrose oder Lungenumbau zu variieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen, die EMT haben, in eine Art Cuagenter emittiert und sie in Medium aufschäumt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Der kraniale Mesenchym erfährt dramatischen morphogene Bewegungen, die wahrscheinlich stellt eine Antriebskraft für die Elevation der...

Eine Explantation Assay zur Beurteilung Cellular Verhalten des Cranial Mesenchym

Ein einfaches Verfahren ist für die Induktion von epithelialen mesenchymale Transition (EMT) in einer Vielzahl von Zelltypen beschrieben. Methoden zur Analyse von Zellen in EMT-Staaten durch Immunzytochemie sind enthalten.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung primärer Maus-Epikardzellen durch einen Auswuchskultur-Assay und zur Bewertung der funktionellen Migration epikardialer Zellen (EPDC) unter Verwendung eines ex vivo Herzkultursystems. Diese Protokolle eignen sich zur Identifizierung genetischer und chemischer Modulatoren des epikardialen Epithel-zu-mesenchymalen Übergangs (EMT) und der Motilität.

Epikardiale Outgrowth Kulturtest und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Beurteilung von Epikardiale abgeleiteten Zellmigration

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

Wir präsentieren einen mit Silikonkautschuk (PDMS) hergestellten Assay mit hoher Durchsatz-Traktionskraft. Dieser neuartige Test eignet sich zur Untersuchung körperlicher Veränderungen der Zellkontraktilität während verschiedener biologischer und biomedizinischer Prozesse und Krankheiten. Wir demonstrieren den Nutzen dieser Methode, indem wir eine TGF--abhängige Erhöhung der Kontraktilität während des epitheliaal-mesenchymalen Übergangs messen.

Hochdurchsatz-Traktionskraftmikroskopie mit PDMS zeigt dosisabhängige Effekte transformierender Wachstumsfaktoren auf den epitheliaal-mesenchymalen Übergang

Wir beschreiben einen systematischen Workflow zur Untersuchung der TGF-β Signalisierung und tGF-β-induzierten EMT, indem wir die Protein- und Genexpression untersuchen, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Die Methoden umfassen Western Blotting, ein Luziferase Reporter Assay, qPCR, und Immunfluoreszenz Färbung.

Untersuchung von TGF-β Signalisierung und TGF-β-induzierten epitheliaal-mesenchymalen Übergang bei Brustkrebs und normalen Zellen

Wir beschreiben Methoden zur Untersuchung von TGF-β2-induzierter EndMT in Endothelzellen, indem wir Veränderungen der Zellmorphologie beobachten und die Expression EndMT-bedingte Markerveränderungen mittels Immunfluoreszenzfärbung untersuchen. CrispR/Cas9-Gen-Editing wurde beschrieben und verwendet, um das Gen zu erschöpfen, das für Snail kodiert, um seine Rolle bei TGF-β2-induzierter EndMT zu untersuchen.

TGF-β-vermittelter endothelialer zu mesenchymaler Übergang (EndMT) und die funktionelle Bewertung von EndMT-Effektoren mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing

Diese Arbeit präsentiert ein flexibles Protokoll für die Verwendung von FLECS-Technologie (fluoreszenzmarkierte elastomere kontrahierbare Oberflächen) im Mikrowellenformat zur vereinfachten, freihändigen Quantifizierung von einzelligen kontraktilen Kräften basierend auf visualisierten Verschiebungen fluoreszierender Proteinmikromuster.

Vereinfachte Hochdurchsatzanalyse der Einzelzellkontraktilität mit mikrostrukturierten Elastomeren

Dieses Protokoll stellt Methoden zur Erzeugung von 3D-konstruiertem Herz- und Skelettmuskelgewebe bereit und beschreibt deren Verwendung in präklinischen Arzneimittel-Screening-Modalitäten. Die beschriebenen Methoden verwenden ein magnetisches Sensorsystem, um die gleichzeitige Beurteilung von 24 Geweben parallel zu ermöglichen.

Präklinische Arzneimitteltests in skalierbaren 3D-Muskelgeweben

Erfahren Sie die Gel-Kontraktionsanalyse zur Bewertung der Kontraktilität mesenchymaler Zellen nach epithelial-mesenchymaler Transition. Diese zugängliche Methode erleichtert die Erforschung entzündlicher Erkrankungen wie idiopathische Lungenfibrose.

Entwicklung eines In Vitro Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung (Video) | JoVE Journal

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