Entwicklung eines

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Kontraktilität von mesenchymalen Zellen zu bewerten, die in vitro eine inflamatorische Zytokin-induzierte epitheliale mesenchymale Transition (EMT) durchlaufen haben. Dieses Mesenchym ist eine Variation der grundlegenden Zellfunktion nach EMT, die durch entzündliche Immunreaktionen induziert wird, wie z. B. bei idiopathischer Lungenfibrose oder Atemwegsumbau bei schwerem Asthma. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie keine speziellen Geräte erfordert und dass sie einen hohen Gehalt aufweist. Demontiert wird das Verfahren von Hideyuki Takeshima und Kosuke Makita, Doktoranden aus meinem Labor.

Beginnen Sie mit dem Waschen einer Kultur von A-549 menschlichen Lungenepithelzellen mit fünf bis zehn Milliletern PBS. Als nächstes lösen Sie die anhaftenden Zellen mit zwei Milliletern Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent Kohlendioxid ab. Nach drei Minuten wird die Zellsuspension in konische Röhrchen mit Zellkulturmedium überführt und die Zellen in einer Zentrifuge geschleudert.

Die Pellets werden in zwei Milliletern Zellkulturmedium resuspendiert und ein kleines Eloquat für die Zählung aufbewahrt. Dann säen Sie 0,5 bis 1 mal 10 bis 6. Zellen in zehn Millileter Medium pro zehn Zentimeter Polysterenschale aus und inkubieren Sie die Zellkulturen 24 Stunden lang. Für die EMT-Induktion behandeln Sie die Zellen am nächsten Tag mit 10 Mikrolitern TGF beta 1 und TNF alpha und stellen Sie die Platten für weitere 48 Stunden in den Inkubator.

Waschen Sie am vierten Tag die EMT-induzierten Kulturen mit fünf bis zehn Milliletern PBS und lösen Sie dann die Zellen mit Trypsin-EDTA ab, wie gerade gezeigt. Als nächstes werden die Zellsuspensionen in DMEM, ergänzt mit einem Tryspsin-Inhibitor, heruntergeschleudert und die Pellets in 500 Mikrolitern pbs resuspendiert. Zählen Sie dann die Zellen und fügen Sie frisch zubereitetes Gelellmedium mit einer Dichte von 3 mal 10 bis zu den 5. Zellen pro Vertiefung hinzu, wobei Sie die Lösung vor der Gelierung vorsichtig aber schnell mit einer Pipette mischen.

Sie sofort, aber vorsichtig, 0,5 Millileter Zellen in jede Vertiefung einer unbehandelten 24-Well-Platte in sauberer, zylindrischer Form. Legen Sie die Platte dann für 15 Minuten in einen Zellkultur-Inkubator. Wenn das Gel vollständig erstarrt ist, bewegen Sie einen sterilisierten Spatel in einem Kreis um die Außenseite jedes Gels in eine Richtung, um die Gele von den Platten zu lösen, ohne zu brechen.

Achten Sie beim Entfernen des Gels darauf, den Spatel nicht in der Vertiefung hin und her zu bewegen. Anschließend werden die Gele mit dem Spatel vorsichtig in einzelne 16-Millimeter-Gewebekulturschalen überführt, die fünf Millileter DMEM enthalten, ergänzt mit einem Prozent FBS, mit oder ohne TGF beta 1 und TNF alpha. Schütteln Sie abschließend die Schalen vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Gele auf dem Medium schwimmen, und geben Sie die Gele wieder in den Zellkultur-Inkubator.

Unbehandelte a541-Zellen zeigen ein kopfsteinpflasterartiges und dreieckiges Aussehen, das für Epithelzellen charakteristisch ist. Nach ihrer Stimulation mit TGF beta 1 und TNF alpha zeigen die Zellen jedoch eine lange Spindelform, ähnlich wie bei mesynchemalen Zellen. Die QRTCPR der epithelialen und mesynchemalen Markerexpression vor und nach der EMT zeigt, dass A541-Zellen, die 48 Stunden lang mit inflammatorischen Zytokinen behandelt wurden, eine signifikant reduzierte Expression von CDH1 und eine signifikant erhöhte Expression von VIAM und ACTA2 aufweisen.

Darüber hinaus schwächt die Stimulation mit diesen Zytokinen die E-Cadherin-Expression ab, wie sie durch westliche Blutanalyse bestimmt wird, während die Expression von Vimentin, N-Cadherin und Alpha-Aktin der glatten Muskulatur induziert wird. In einem Gelkontraktionsassay sind nach 48 Stunden die Gele, die mit TGF beta 1 und TNF alpha behandelte Zellen enthalten, kleiner als die kontrollierten Gele, die mit PBS behandelte Zellen enthalten. Tatsächlich ist nach 72 Stunden die Größe der Gele, die die mit Zytokinen behandelten Gele enthalten, im Vergleich zu den kontrollierten Gelen, die mit einem Gelanalysator gemessen wurden, signifikant reduziert.

Wie bereits erwähnt, können die Schritte der Gelkontraktion in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, zu bestätigen, dass die EMT erfolgreich induziert wurde, bevor Sie den Gel-Contracting-Assay durchführen. Nach der Beobachtung bietet diese Technik die Möglichkeit, den EMT-Prozess während eines Entzündungszustands wie Fibrose oder Lungenumbau zu variieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen, die EMT haben, in eine Art Cuagenter emittiert und sie in Medium aufschäumt.