Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche pluripotente Stammzellen mit Hilfe moderner Genome-Editing-Technologie gentechnisch zu verändern. Obwohl dieses Verfahren Einblicke in die Stammzellbiologie geben kann, kann es auch angewendet werden, um die Modellierung menschlicher Krankheiten in einem genetisch definierten Umfeld zu erleichtern. Im Allgemeinen müssen Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, die Isolierung von Kolonien üben, bevor sie sie beherrschen.

visuelle Demonstration dieser Methode ist unerlässlich, da die Identifizierung und Auswahl von Kolonien schwierig sein kann. Beginnen Sie mit der Kultivierung humaner pluripotenter Stammzellen in hES-Medien auf einer Sechs-Well-Platte, die Mitomycin, C-inaktivierte embryonale Fibroblasten der Maus oder MEF-Feeder-Zellen enthält, die auf Gelatine gezüchtet wurden. Jeden folgenden Tag nach dem Plattieren, bis die hPS-Zellen eine Konfluenz von 50 % erreichen, verwenden Sie eine Glaspipette und vakuum, um das gesamte Medienvolumen zu entfernen.

Ersetzen Sie es durch drei Milliliter warmes hESC-Medium pro Vertiefung. Einen Tag vor dem Targeting entfernen Sie das hESC-Medium und fügen Sie frisches, vorgewärmtes hESC-Medium hinzu, das mit 10 Mikromolaren Y-27632 ergänzt wird. Bereiten Sie außerdem ein bis zwei Sechs-Well-Platten mit arzneimittelresistenten MEF-Feederzellen von DR4-Mäusen vor.

Bereiten Sie am Tag der Zielbestimmung die Transvektionslösungen vor, indem Sie fünf Mikrogramm Zinkfinger-Nuklease-Expressionsplasmid 1 und 2, TALON 1 und 2 Expressionsplasmid oder 15 Mikrogramm des CRISPR cas9 px330-kodierenden Plasmids in ein Ein-Punkt-Fünf-Milliliter-Röhrchen pipettieren. Fügen Sie 30 Mikrogramm des reparierten Spenderplasmids hinzu, gefolgt von ausreichend 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das Volumen auf 300 Mikroliter zu bringen. Untersuchen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um eine Konfluenz von 50 % sicherzustellen.

Verwenden Sie anschließend eine Glaspipette und ein Vakuum, um das Medium von der Platte mit hPFCs zu entfernen, und waschen Sie dann die Zellen mit 2 Millilitern warmem 1x PBS. Nach dem Aspirieren des PBS geben Sie null Komma fünf Milliter 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung direkt auf die Zellen. Stellen Sie die Dose für ca. 10 Minuten in den Gewebekultur-Inkubator oder bis sich die Feederschicht von der Platte zu heben beginnt.

Geben Sie nach der Inkubation zwei Milliliter warmes ES-Waschmedium in jede Vertiefung, um die Trypsin-Reaktion zu stoppen. Sammeln Sie die Zellen aus jeder Vertiefung und stellen Sie sicher, dass sich die Feeder-Zellen als Blatt lösen. Pipettieren Sie den Inhalt jeder Vertiefung in ein einzelnes konisches 50-Milliliter-Röhrchen, kombinieren Sie alle Vertiefungen und zerreiben Sie die Zellen mit einer serologischen 10-Milliliter-Pipette.

Fügen Sie ES-Waschmedien hinzu, um die Zellsuspension auf 40 Milliliter zu bringen. Warten Sie ein bis zwei Minuten, bis sich große Futterstückchen am Boden des Röhrchens absetzen können, entfernen Sie dann den Überstand mit einer serologischen Pipette und geben Sie ihn in ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem die Zellsuspension fünf Minuten lang bei 190 μg zentrifugiert wurde, wird der Überstand aspiriert, ohne die Zellpalette zu stören.

Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern 1x pbs. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen mit der zuvor hergestellten Plasmadurchtrennlösung. Pipettieren Sie die Zellen und die Transfektionsmischung in eine vier Millimeter große Elektroporationsküvette und legen Sie sie drei bis fünf Minuten lang auf Eis.

Stellen Sie die Parameter für das Exponentialprogramm am Elektroporationssystem auf 250 Volt, 500 Mikrofarad, unendlichen Widerstand und vier Millimeter Küvettengröße ein. Elektroporieren Sie die Zellen und legen Sie die Küvette dann wieder für drei Minuten auf Eis. Resuspendieren Sie die elektroporierten Zellen in 18 Millilitern warmem hESC-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren Y-27632.

Untersuchen Sie die DR4 MEFs unter dem Mikroskop. Drei Milliliter der Einzelzellsuspension werden in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit DR4-Feederzellen gegeben und in den Inkubator zurückgeführt. Ersetzen Sie am dritten Tag nach der Beschichtung das Medium auf dem hESC-Medium der Zellen ohne Y-27632.

Ersetzen Sie am vierten Tag die nicht supplementierten Medien durch Medien, die das entsprechende Auswahlantibiotikum enthalten. Hier kommt Puromycin zum Einsatz. Bereiten Sie am Tag vor der Kolonieentnahme eine 12-Well-Platte mit MEF-Feederzellen für jedes zu entnehmende Volk vor.

Untersuchen Sie die Platte am 12. Tag nach der Beschichtung unter einem Präpariermikroskop. Identifizieren Sie Kolonien mit einem Durchmesser von 800 bis 1.200 Mikrometern, die zur Pflücke bereit sind. Stellen Sie sicher, dass diese Kolonien keine Zellen enthalten, die sich zu differenzieren beginnen, wie die hier gezeigte.

Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zellen GFP exprimieren. Untersuchen Sie die MEFs am Tag der Ernte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie gesund sind. Entfernen Sie alle Medien von den MEF-Feeder-Zellplatten und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter hESC-Medien.

Wechseln Sie außerdem die hESC-Medien auf den Sechs-Well-hPSC-Platten, die entnommen werden sollen. Ziehen Sie als Nächstes Glaspipetten, um Kolonien zu entnehmen. Um Kolonien zu entnehmen, legen Sie zunächst die Platten-hPFCs auf den Tisch des Dissektionsmikroskops in der Gewebekulturhaube, bauen Sie die Entnahmevorrichtung zusammen, indem Sie das Glaspipettenende in den Saugkolben einsetzen.

Identifizieren Sie die zu pflückende Kolonie und legen Sie die Spitze der gezogenen Glaspipette über die Kolonie. Drücken Sie dann die Glühbirne des Pflückgeräts zusammen, um eine einzelne Kolonie vorsichtig herauszuschneiden und in 10 bis 20 gleich große Stücke zu schneiden. Ziehen Sie als Nächstes die herausgeschnittenen Koloniestücke in die Pipette, indem Sie die Glühbirne loslassen.

Versuchen Sie, während der Übertragung so wenig Medien wie möglich zu verwenden. Komprimieren Sie die Glühbirne, um die nun gebrochene Kolonie direkt in eine Vertiefung einer 12-Well-MEF-Feeder-Zellplatte zu übertragen. Beschriften Sie jede Vertiefung, um eine eindeutige Identifizierung von Klonen aus einzelnen Zellen zu ermöglichen.

Wechseln Sie die Glaspipette und wiederholen Sie den Vorgang für die nächste Kolonie. Stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator und schütteln Sie die Platten vorsichtig, um die Zellen in der Vertiefung zu verteilen. Entfernen Sie am nächsten Tag das gesamte Medienvolumen, und ersetzen Sie es durch einen Punkt fünf Milliliter warmes hESC-Medium.

Wiederholen Sie dies 10 bis 12 Tage lang, bis die Zellen zu 50 % zusammenfließen. Nach 10 bis 12 Tagen ist die hES-Zellen im Rahmen des Oszilloskops zu untersuchen. Entnehmen Sie ein bis zwei Kolonien aus jeder Vertiefung und übertragen Sie sie auf neue 12-Well-MEF-Feeder-Zellplatten, um eine Nachbildung der Platte zu erzeugen.

Extrahieren Sie DNA aus den verbleibenden Kolonien in jeder Vertiefung der Originalplatten für die Genotypisierung durch PCR oder Southern Blot. Weber: Drei humane embryonale Stammzellen wurden unter Verwendung von ortsspezifischen Nukleasen und einer Reparaturschablone auf den AAVS1-Locus ausgerichtet, um einen EFFP-Reporter und eine Puromycin-Resistenzkassette einzuführen. Diese repräsentativen Bilder zeigen Kolonien, die mit Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR/Cas9 editiert wurden.

Diese repräsentativen PCR-Genotypisierungsergebnisse zeigen ungezielte, heterozygote und homozygote Zielklone unter Verwendung von Zinkfingernukleasen, TALENs und CRISPR/Cas9 zusammen mit einer Wildtyp-Kontrolle. Diese Tabelle zeigt die PCR-verifizierten Integrationen am AAVS1-Locus für jede ortsspezifische Nuklease in diesem Experiment im Vergleich zu den durch Southern Blot verifizierten korrekten Einzelintegrationen in früheren Experimenten. CRISPR-Cas9 lieferte die meisten korrekt zielgerichteten Klone, während die TALEN-Plattform die meisten homozygot zielgerichteten Klone aufwies.

Sobald diese Technik gemeistert ist, dauert sie etwa drei bis fünf Stunden, und Sie können innerhalb von etwa drei Wochen nach Beginn der Experimente bearbeitete Zellen erhalten. Bei dieser Technik ist es sehr wichtig, sicher zu arbeiten und jederzeit eine sterile Technik zu verwenden. Nach der genetischen Manipulation können Sie sehen, wie sie sich auf andere Zelltypen auswirkt, indem Sie die Stammzelldifferenzierung in andere Zelltypen, wie z. B. Neuronen, verwenden.

Die Entwicklung dieses Protokolls ebnete den Weg für Forscher, Genome Editing in menschlichen pluripotenten Stammzellen zu nutzen, um In-vitro-Krankheitsmodelle zu erstellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Genome Editing in menschlichen pluripotenten Stammzellen durchführt.