Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung In Vivo Und In-vitro- Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Phänotyp-Kinetik der Entstehung und die Anzahl der T-Zellen zu analysieren, die von E 13 oder E 18 thymusansiedelnden Vorläuferzellen produziert werden. Dazu werden zunächst die Thymuslappen aus Mausembryonen E 13, E 14 und E 18 isoliert. Im zweiten Schritt werden die E 14 Thymuslappen bestrahlt und anschließend mit flusssortierten E 13 oder E 18 Zellen für 48 Stunden in einem hängenden Tropfen besiedelt.

Im letzten Schritt werden die besiedelten Lappen unter die Nierenkapsel von adulten Zöliakie-3-Knockout-Mäusen transplantiert. Letztendlich kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um das Vorhandensein der E 13 und E 18 thymusabsetzenden Vorläufer im Blut der chimären Tiere zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber unseren bestehenden Methoden, wie z.B. der in vitro T-Zellkultur auf Sinuszellen, besteht darin, dass diese Technik die Methoden kombiniert, die eine vollständige T-Zell-Reifung aus definierten Vorläuferzellen in einem dreidimensionalen Assay ermöglichen, mit der Transplantation von Organkulturen des Thymusorgans in intakten Empfängermäusen, was die Bewertung der Differenzierung und Funktion der Thymus-Vorläuferzellen und der Nachkommen ermöglicht.

Als Forschungsingenieur mit Expertise in der Nagetierchirurgie werde ich das Verfahren Zwei Tage vor dem Transplantationsexperiment in einer Laminar-Flow-Haube demonstrieren, wie der Bauch einer schwangeren weiblichen Maus mit 70%igem Ethanol versehen und an der Mittellinie einen Längsschnitt in die Haut gemacht, die Haut auseinandergezogen wird, um den Schnitt zu öffnen und dann mit Pinzette und Schere das Bauchfell zu öffnen, ohne den Verdauungstrakt zu berühren. Ziehen Sie als Nächstes die bifide Gebärmutter heraus und trennen Sie sie mit einer Schere von der Vagina. Legen Sie dann die Gebärmutter in eine 90 x 15 Millimeter große Petrischale, die 40 bis 50 Milliliter DPBS enthält, und schneiden Sie quer zwischen den Deziduen jedes Embryos.

Verwenden Sie eine feine Schere und eine feine Pinzette, um die Muskelmembran der Gebärmutter zu entfernen, und schneiden Sie zwischen der Plazenta und dem Dottersack ab, um jeden Embryo herauszunehmen. Entfernen Sie dann das Amnio, das die Embryonen zurückhält, und legen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale, die HBSS plus 1% FCS enthält. Um den Thymus zu isolieren, legen Sie die Embryonen nacheinander in Rückenlage unter eine binokulare Lupe.

Führen Sie dann eine Pinzette in Längsrichtung entlang des Knorpels des Brustbeins ein und kneifen und öffnen Sie das Brustgitter mit einer gebogenen Pinzette. Ziehe die Brustwand zur Seite, um die Thymuslappen auf jeder Seite der Luftröhre sichtbar zu machen. Kneifen Sie dann mit einer feinen Pinzette unter den Thymus, um jeden Lappen vorsichtig zu entfernen, und legen Sie sie in eine Petrischale, die einen Milliliter HBSS plus 1% FCS enthält.

Anschließend entfernen Sie mit zwei feinen Zangen das umgebende Bindegewebe, ohne die Lappen zu beschädigen. Waschen Sie dann die Lappen in drei Millilitern HBSS plus 1% FCS, um die roten Blutkörperchen zu eliminieren und mit der Bestrahlung der fetalen Thymusorgankultur zu beginnen. E 14 Thymuslappen, die aus CD 45.2-Embryonen isoliert wurden, wie gerade gezeigt.

Lassen Sie die Lappen etwa drei Stunden ruhen. Anschließend werden frisch sortierte E 13 oder E 18 Thymus-Vorläuferzellen zerkleinert. Das Pellet wird wieder in Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 500 Zellen pro 35 Mikroliter Medium suspendiert.

Geben Sie dann einen 35-Mikroliter-Tropfen Zellsuspension in jede zweite Vertiefung einer 60-Well-Terasaki-Platte und legen Sie einen bestrahlten Lappen auf die Oberfläche jedes Tropfens. Schließen Sie die Platte und drehen Sie sie auf den Kopf, damit die Zellen durch die Schwerkraft den apikalen Pol des Tropfens erreichen können, und schlagen Sie vorsichtig auf die Oberseite der umgekehrten Platte, um die Lappen zum apikalen Rand des Tropfens zu zwingen. Dann inkubieren Sie die umgekehrte Platte in einem befeuchteten Inkubator für 48 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Nachdem die Thymuslappen besiedelt wurden, überprüfen Sie den Grad der Anästhesie des Empfängertieres durch das Fehlen einer Reflexreaktion. Geben Sie dann einen Tropfen Augensalbe auf jedes Auge und platzieren Sie die Maus auf der rechten Seite unter einer Laminar-Flow-Haube. Rasieren Sie dann den Operationsbereich knapp über dem Gelenk des Hinterbeins.

Als nächstes ziehen Sie ein Paar sterile Handschuhe an und sterilisieren das Operationsfeld mit 70 % Ethanol und einer 10 % IOD DY DER-Lösung. Machen Sie mit einem Skalpell einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt durch das Hautgewebe, gefolgt von einem Schnitt durch das Muskelgewebe. Üben Sie nun einen leichten Druck auf beide Seiten des Schnitts aus, um die Niere aus der Bauchhöhle herauszudrücken und die Niere mit Kochsalzlösung feucht zu halten.

Halten Sie die Niere mit einem Wattestäbchen außerhalb der retroperitonealen Höhle und bohren Sie mit zwei feinen Zangen ein zwei bis drei Millimeter großes Loch in die Kapsel. Halten Sie dann die Wand der Kapsel offen, schieben Sie vorsichtig bis zu sechs Thymuslappentransplantate unter den Rand des Nierenpols und platzieren Sie die Niere wieder in der retroperitonealen Höhle. Naht des Muskels eine Neurose, gefolgt von Hautnaht mit einzelnen Chirurgenknoten.

Befeuchten Sie dann die Wunde mit 10%iger Jodid-Povidon-Lösung und legen Sie die Maus auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen, überwachen Sie das Tier und die chirurgische Wunde, bis beide vollständig genesen sind, um die beste Methode zur Erschöpfung endogener Thymozyten für die Entwicklung kolonisierender Vorläuferzellen zu bestimmen. In diesem Experiment wurden die Werte der T-Zell-Rekonstitution in einem kolonisierten Thymuslappen nach einer Bestrahlung oder einer fünftägigen Desoxyguine-Behandlung verglichen. Obwohl am neunten Tag der Kultur kein Unterschied in der Anzahl der kolonisierenden Lymphozyten erkennbar war, enthielten die bestrahlten Lappen mehr T-Zellen als diejenigen, die am Tag 12 mit Desoxyguinea behandelt wurden, was die Bestrahlung zur bevorzugten Behandlung zur Erleichterung der T-Zellentwicklung nach der Thymusbesiedlung machte, um das Entwicklungspotenzial von E 13 und E 18 thymusansiedelnden Vorläuferzellen hier zu untersuchen. E 14 bestrahlte Thymuslappen waren mit der gleichen Anzahl der beiden beobachteten Arten von Vorläuferzellen besiedelt, die E 13 thymusabsetzenden Vorläuferzellen führten zu weniger Thymozyten und doppelt positiven T-Zellen als die E 18 thymusabsetzenden Vorläuferzellen.

Die Häufigkeit von reifen Zöliakie-3-positiven Zellen war jedoch erhöht und die Produktion von dendritischen epithelialen T-Zellen wurde nur in den Nachkommen der E 13 thymus absetzenden Vorläuferzellen nachgewiesen, um das in vivo Potential von E 13 und E 18 thymus absetzenden Vorläuferzellen zu analysieren. Thymuslappen, die mit jedem Typ von Vorläuferzellen besiedelt waren, wurden unter die Nierenkapsel von CD 3 Knockout-Empfängern transplantiert. Wie gerade gezeigt, wie erwartet. Die E-13-Thymus-Ansiedlungs-Vorläufer führten schneller zu T-Zellen als die E-18-Vorläuferzellen, obwohl die Anzahl der zirkulierenden T-Zellen bei den E-13-Thymus-Siedler-Vorläufern insgesamt signifikant geringer war. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Entwicklungsimmunologie, um die Eigenschaften der T-Zell-Untergruppe zu erforschen. Einige von ihnen sind streng embryonalen Ursprungs in einem Säugetiermodell.

Nachdem Sie dieses Video gesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die differentiellen und funktionellen Wege von Timex verfolgen können, die Vorfahren und ihre Nachkommen in einer natürlichen Umgebung und unter wettbewerbsfähigen Bedingungen ansiedeln.