Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die phänotypischen Kinetiken der Erzeugung und der Anzahl von T-Zellen zu analysieren, die von E13- oder E18-Thymuskolonisierenden Vorläuferzellen hervorgebracht werden. Dies wird erreicht, indem zunächst die Thymuslappen von E13-, E14- und E18-Mausembryonen isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die E14-Thymuslappen bestrahlt und anschließend 48 Stunden lang in einem hängenden Tropfen mit per Flusszytometrie sortierten E13- oder E18-Zellen besiedelt.

Im letzten Schritt werden die besiedelten Lappen unter die Nierenkapsel erwachsener CD-drei-Knockout-Mäuse transplantiert. Abschließend kann mittels Durchflusszytometrie die Anwesenheit der E-13- und E-18-Thymus-seedenden Vorläufer und ihrer Nachkommen im Blut der chimären Tiere überprüft werden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden, wie der in-vitro-T-Zell-Kultur auf Ine-So-Zellen, liegt darin, dass sie Verfahren kombiniert, die eine vollständige T-Zell-Maturierung aus definierten Vorläufern in einem dreidimensionalen Test sowie die Transplantation von Thymus-Organ-Kulturen in intakte Empfängertiere ermöglichen und somit die Beurteilung von Differenzierung und Funktion der Thymus-Scheibenvorläufer und ihrer Nachkommen erlauben.

Als Forschungsingenieur mit Expertise in der Chirurgie von Nagetieren werde ich das Verfahren demonstrieren: Zwei Tage vor dem Transplantationsversuch im laminarer Luftstromwerk, desinfizieren Sie den Bauch einer trächtigen weiblichen Maus mit 70 % Ethanol und führen einen Längsschnitt in der Haut entlang der Mittellinie durch. Ziehen Sie die Haut auseinander, um den Schnitt freizulegen, und öffnen Sie anschließend mit Pinzette und Schere die Bauchhöhle, ohne den Verdauungstrakt zu berühren. Danach ziehen Sie die gespaltene Gebärmutter heraus und trennen sie mit der Schere von der Vagina ab. Anschließend legen Sie die Gebärmutter in eine 90 mal 15 Millimeter große Petrischale, die 40 bis 50 Milliliter DPBS enthält, und schneiden quer zwischen den Deciduae jedes Embryos.

Verwenden Sie eine feine Schere und feine Pinzette, um die Muskelmembran des Uterus zu entfernen, indem Sie zwischen Plazenta und Dottersack schneiden, um jeden Embryo zu entnehmen. Entfernen Sie anschließend das Amnion, wobei die Embryonen erhalten bleiben, und geben Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit HBSS plus 1 % FCS. Um den Thymus zu isolieren, legen Sie die Embryonen einzeln in Rückenlage unter eine binokulare Vergrößerungslinse.

Danach eine Pinzette längs entlang des Knorpels des Brustbeins einführen und das Thoraxgitter mit einer gebogenen Pinzette zusammendrücken und öffnen. Die Thoraxwand zur Seite ziehen, um die Thymuslappen auf jeder Seite der Luftröhre sichtbar zu machen. Anschließend mit einer feinen Pinzette unterhalb des Thymus greifen, um jeden Lappen vorsichtig zu entfernen, und sie in eine Petrischale mit einem Milliliter HBSS plus 1 % FCS legen.

Als Nächstes verwenden Sie zwei feine Pinzetten, um das umgebende Bindegewebe zu entfernen, ohne die Lappen zu beschädigen. Anschließend waschen Sie die Lappen in drei Millilitern HBSS mit 1 % FCS, um die roten Blutkörperchen zu entfernen, um die fetale tymische Organkultur-Bestrahlung zu beginnen. E14-tymische Lappen, isoliert aus CD45.2-Embryonen, wie gerade gezeigt.

Lassen Sie die Lappen etwa drei Stunden ruhen. Anschließend frisch sortierte E 13- oder E 18-Thymus-Siedlungsprogenitoren abzentrifugieren. Den Pellet in Kulturmedium so resuspendieren, dass eine Endkonzentration von 500 Zellen pro 35 Mikroliter Medium vorliegt.

Platzieren Sie dann einen 35-Mikroliter-Tropfen der Zellsuspension in jeder zweiten Vertiefung einer 60-Vertiefungs-Terasaki-Platte und geben Sie einen bestrahlten Lappen auf die Oberfläche jedes Tropfens. Schließen Sie die Platte und drehen Sie sie um, damit die Zellen durch die Schwerkraft zum apikalen Pol des Tropfens gelangen; klopfen Sie dabei leicht auf die obere Seite der umgedrehten Platte, um die Lappen zum apikalen Rand des Tropfens zu bewegen. Anschließend inkubieren Sie die umgedrehte Platte 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator.

Nachdem die Thymuslappen besiedelt wurden, überprüfen Sie die Anästhesietiefe des Empfängertiers anhand des Fehlens einer Reflexantwort. Tragen Sie dann einen Tropfen Augensalbe auf jedes Auge auf und legen Sie die Maus unter einem laminaren Luftstromhauben auf die rechte Seite. Rasieren Sie anschließend den chirurgischen Bereich direkt oberhalb des Gelenks des Hinterbeins.

Als Nächstes ziehen Sie ein Paar sterile Handschuhe an und desinfizieren das Operationsfeld mit 70 % Ethanol und einer 10 %igen IOD DY DER-Lösung. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 1,5 cm langen Schnitt durch das kutane Gewebe und anschließend einen Schnitt durch das Muskelgewebe durchzuführen. Üben Sie nun leichtem Druck auf beide Seiten des Schnittes aus, um die Niere aus der Bauchhöhle herauszudrücken, und halten Sie die Niere mit Kochsalzlösung feucht.

Halten Sie die Niere mit einem Wattestäbchen außerhalb der retroperitonealen Kavität und verwenden Sie zwei feine Pinzetten, um ein zwei bis drei Millimeter großes Loch in die Kapsel zu machen. Halten Sie dann vorsichtig die Kapselwand geöffnet und schieben Sie bis zu sechs Thymuslappen-Transplantate unter die Kapsel bis zum Rand des Nierenpols. Legen Sie die Niere anschließend zurück in die retroperitoneale Kavität. Nähen Sie zunächst die Muskulatur mit einem Nervennahtverfahren und danach die Haut mit Einzelknoten des Chirurgen.

Be feuchten Sie die Wunde mit einer 10%igen Povidon-Jod-Lösung an, und legen Sie die Maus auf eine Heizplatte mit 37 Grad Celsius. Überwachen Sie das Tier und den Operationswundbereich, bis beide vollständig regeneriert sind, um die beste Methode zur Ausschaltung endogener Thymozyten für die Entwicklung kolonisierender Vorläuferzellen zu bestimmen. In diesem Experiment wurden die T-Zell-Rekonstitution in einem kolonisierten Thymuslappen nach Bestrahlung oder einer fünftägigen Desoxyguanin-Behandlung verglichen. Obwohl am neunten Kulturtag kein Unterschied in der Anzahl kolonisierender Lymphozyten erkennbar war, enthielten die bestrahlten Lappen am zwölften Tag mehr T-Zellen als die mit Desoxyguanin behandelten, weshalb die Bestrahlung als bevorzugte Behandlung zur Förderung der T-Zell-Entwicklung nach Thymuskolonisation gewählt wurde. Um das Entwicklungspotential der E 13- und E 18-Thymus-siedelnden Vorläuferzellen zu untersuchen, wurden hier E 14-bestrahlte Thymuslappen mit gleicher Anzahl beider Vorläuferzelltypen kolonisiert. Wie beobachtet wurde, gingen aus den E 13-Thymus-siedelnden Vorläuferzellen weniger Thymozyten und doppelt positive T-Zellen hervor als aus den E 18-Thymus-siedelnden Vorläuferzellen.

Die Häufigkeit reifer CD3-positiver Zellen war hingegen erhöht, und die Produktion dendritischer epidermaler T-Zellen wurde nur bei den Nachkommen der E13-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen nachgewiesen. Um das in-vivo-Potential der E13- und E18-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen zu analysieren, wurden Thymuslappen, die mit jeder Art von Vorläuferzellen besiedelt waren, unter die Nierenkapsel von CD3-Knockout-Empfängern transplantiert. Wie gerade gezeigt, war dies erwartungsgemäß der Fall. Die E13-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen bildeten T-Zellen schneller als die E18-Vorläuferzellen, obwohl die Anzahl zirkulierender T-Zellen bei den Tieren, die mit E13-Thymusbesiedelnden Vorläuferzellen besiedelt waren, insgesamt signifikant niedriger war. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Entwicklungsimmunologie den Weg, um die Eigenschaften von T-Zell-Subtypen zu untersuchen, von denen einige streng embryonalen Ursprungs sind, in einem Säugetiermodell.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die differenziellen und funktionellen Wege von Timex-siedelnden Vorläufern und ihrer Nachkommenschaft auch unter natürlichen und konkurrierenden Bedingungen verfolgen kann.