Analyse der mitochondrialen Atmung Kette-komplexe in kultivierten menschlichen Zellen mit blauen Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting

Die blau native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermöglicht die Analyse von Tact-Komplexen des mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystems. Es ist eine bequeme und kostengünstige Technik, die verwendet werden kann, um die Montage ganzer Komplexe des mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystems zu überlagern. Um die mitochondrialen Lysate vorzubereiten, verwenden Sie zunächst eiskalte PBS-Lösung, um die Zellen einmal sanft zu waschen.

Die Zellen verschrotten und bei vier Grad Celsius bei 800 G 10 Minuten lang pellet. Dann waschen Sie das Zellpellet zweimal mit dem eiskalten PBS und Zentrifuge bei vier Grad Celsius bei 800 G für 10 Minuten. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter 100x Protease-Inhibitor zu 20 Milliliter PBS hinzu.

Setzen Sie die Zellen in der PBS-Protease-Inhibitor-Mischung auf eine endgültige Proteinkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter aus. Um 3,3 Millimolar-Digitonin in PBS mit Protease-Inhibitor vorzubereiten, lösen Sie vier Milligramm Digitonin in einem Milliliter PBS bei 100 Grad Celsius auf, bis kein Niederschlag sichtbar ist. Sofort auf Eis abkühlen und 10 Mikroliter 100-fachen Proteasehemmer zu einem Milliliter der Digitonin-Lösung hinzufügen.

Als nächstes fügen Sie die Digitonin-Protease-Inhibitor-Mischung in der Endkonzentration von 1,65 Millimolar zu den Zellen hinzu. Gut mischen und fünf Minuten auf Eis bebrüten. Fügen Sie dann die PBS-Protease-Inhibitor-Mischung in die Zellen ein, um das Endvolumen von 1,5 Millilitern zu erreichen.

Zentrifuge bei vier Grad Celsius bei 10.000 G für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das mitochondriale Pellet im mitochondrialen Puffer wieder aus. Bereiten Sie einen Milliliter frische 10%loreal in PBS-Hemmer-Lösung.

Fügen Sie 10% Loreal in die Mitochondrien bei der Endkonzentration von 1%Inkubation auf Eis für mindestens 15 Minuten. Zentrifuge bei vier Grad Celsius bei 20.000 G für 20 Minuten. Sammeln Sie den Überstand in eine neue Röhre und fügen Sie den Probenpuffer hinzu.

Um das Gradientengel für die blaue Mutterseite vorzubereiten, platzieren Sie zuerst den Gradientenmacher auf einer Rührplatte und verbinden Sie ihn mit einem flexiblen Schlauch an die peristaltische Pumpe. Befestigen Sie ein Infusionsset mit einer Nadel an den Schläuchen. Legen Sie einen Magnetrührer in die proximale Kammer des Gradientenmachers und waschen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser bei der maximalen Pumpendrehzahl für 10 Minuten.

Als nächstes leeren Sie den Schlauch und den Gradienten-Maker. Verwenden Sie eine Pipette, um übrig gebliebenes destilliertes Wasser im Kanal zwischen den Kammern des Gradientenherstellers zu entfernen. Schließen Sie den Kanal und den Schlauch mit dem Ventil.

Montieren Sie zwei Glasplatten im Halter und legen Sie sie auf den Ständer. Platzieren Sie die Nadel mit dem Loch auf der Unterseite des Gelhalters zwischen den Glasplatten. Um ein 8,3 mal 7,3 Zentimeter Gel herzustellen, bereiten Sie zunächst 6% und 15% Gellösungen vor und halten sie auf Eis.

Mischen Sie sie sanft, um Luftblasen zu vermeiden. Dann laden Sie das proximale Ende der Gradienten-Gelmischer-Schlauchkammer mit 2,6 Milliliter des 6%-Gels und das distale Ende mit 2,1 Milliliter des 15%Gels. Schalten Sie als Nächstes den Magnetrührer ein und öffnen Sie den Schlauch und den Kanal zwischen den Kammern des Gradientenherstellers.

Schalten Sie die Peristaltikpumpe sofort auf fünf Milliliter pro Minute ein. Füllen Sie die Glasplatten und entfernen Sie die Nadel, wenn sich kein Gel in den Schläuchen befindet. Das Gel vorsichtig mit destilliertem Wasser überlagern und das Gel mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur halten.

Waschen Sie die Schläuche sofort, indem Sie die Gradientenkammern mit destilliertem Wasser füllen und die Peristaltikpumpe mit der maximalen Geschwindigkeit verwenden. Fügen Sie sechs Milliliter des destillierten Wassers zu drei Millilitern des 3x Gelpuffers hinzu, um 1x Gelpuffer zu bilden. Mit einem Filterpapier das destillierte Wasser vorsichtig von der Oberfläche des Gels entfernen.

Waschen Sie die Oberfläche des Gels mit dem 1x Gelpuffer, und entfernen Sie den Puffer vorsichtig mit dem Filterpapier. Bereiten Sie 4%Stapelgel nach dem Manuskript vor. Mischen Sie sanft, um Luftblasen zu vermeiden.

Dann legen Sie den Kamm zwischen die Glasplatten und gießen Sie das Stapelgel unter den Kamm. Tauchen Sie den Kamm vollständig ein. Lassen Sie das Stapelgel mindestens 30 Minuten polymerisieren.

Dann entfernen Sie den Kamm und verwenden Sie eine Pipette, um die Brunnen mit 1x Gelpuffer zu waschen. Um die blaue native Gelelektrophorese durchzuführen, fügen Sie zunächst den blauen Kathodenpuffer zur Gelkassette hinzu. Verwenden Sie eine Pipette, um die Brunnen mit dem blauen Kathodenpuffer zu waschen und zu füllen.

Dann laden Sie fünf bis 30 Mikrogramm Proteinproben in die Brunnen. Füllen Sie die Gelkassette vorsichtig nach oben mit dem blauen Kathodenpuffer und den Tank mit dem Anodenpuffer. Führen Sie das Gel zunächst mit einer konstanten Spannung von 40 Volt für 15 Minuten aus.

Erhöhen Sie dann die Spannung auf 80 Volt. Führen Sie das Gel, bis der Farbstoff 2/3 der Gellänge erreicht. Ersetzen Sie den blauen Kathodenpuffer durch den Kathodenpuffer und setzen Sie die Elektrophorese fort, bis die Farbstofffront vom Gel abläuft.

Holen Sie die Glasplatten ab und übertragen Sie die Proteine durch halbtrockenes Blotting auf die PVDF-Membran. Verwenden Sie eine konstante Spannung von 25 Volt und einen Strom, der auf ein Ampere für 30 Minuten begrenzt ist. Die Montage der Kettenkomplexe der Atemwege in den menschlichen Neuroblastomzellen wurde bei der Chloramphenicol-Behandlung im Vergleich zu den Kontrollzellen ohne Behandlung gehemmt.

Im Gegensatz dazu wurden komplexe Komplexe, die von den Kerngenen kodiert wurden, hochreguliert. Der Abbau der oxidativen Phosphorylierungskomplexe wurde bei mehreren Gefrier-Tau-Zyklen beobachtet. Die Qualität des Gels könnte den Nachweis der oxidativen Phosphorylierungskomplexe beeinflussen.

Auch das Abisolieren der Membran senkte das Signal-Rausch-Verhältnis. Bei der Durchführung des Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, einfache Vorbereitung und Gelelektrophorese unter kalten Bedingungen durchzuführen, um in-taktige OXPHOS-Komplexe zu erhalten. Im Anschluss an die blaue Mutter-/Mutterseite kann eine SDS-Seite der zweiten Dimension angewendet werden, um die Proteinuntereinheiten von Atmungskettenkomplexen zu untersuchen.

Blaue Mutterseite ermöglicht es Forschern, die Montage von Komplexen und sogar Superkomplexen des oxidativen Phosphorylierungssystems zu untersuchen.