Analyse der Expression und der Assemblierung der Komplexe der mitochondrialen Atmungskettenproteine in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Der Schwerpunkt unserer Forschung ist die Translation von mitochondrialen Proteinen, und wir versuchen, die Mechanismen aufzuklären, die die Translation und den Aufbau des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes beeinflussen. Unsere Forschung ergab, dass shy1 eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der regulären Funktion der Mitochondrien spielt, indem es an der Assemblierung von komplexen vier Infusionen beteiligt ist. Unser Labor wird den Mechanismus der M=Methotrexat-Infusion untersuchen.

[Erzähler] Messen Sie zunächst das Nassgewicht eines Zellpellets von Schizosaccharomyces pombe. Suspendieren Sie die Zellen erneut in acht Millilitern S-Puffer. Dithiothreitol bis zu einer Endkonzentration von 10 Millimolar und Phenylmethylsulfonylfluorid bis zu einem Millimolar zugeben, wobei darauf zu achten ist, dass beide Reagenzien frisch zubereitet werden. Fügen Sie der Zellsuspension lytische Enzyme hinzu, um die Zellwand von Schizosaccharomyces pombe zu verdauen. Drehen Sie das Röhrchen auf einem Shaker bei 30 Grad Celsius für die für das jeweilige lytische Enzym empfohlene Dauer. Verwenden Sie ein Mikroskop, um die Bildung von Sphäroplasten zu beobachten. Dann zentrifugieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei 1.000 g und 4 Grad Celsius, um die Sphäroplasten zu pelletieren. Suspendieren Sie das Pellet wieder in acht Millilitern eiskaltem S-Puffer. Nach zwei Wäschen werden die Sphäroplasten in acht Millilitern eiskaltem Homogenisierungspuffer mit Proteaseinhibitoren resuspendiert. Gib die Mischung in einen vorgekühlten Glas-Down-Homogenisator, der einen Stößel und ein Reagenzglas enthält. Homogenisieren Sie die Zellen mechanisch, indem Sie mit dem eng anliegenden Stößel ca. 15 Striche auf und ab ausführen. Untersuchen Sie dann die Sphäroplasten unter einem Mikroskop, um sie auf Membranbruch zu überprüfen. Übertragen Sie nun die homogenisierte Suspension in Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 1.000 g bei 4 Grad Celsius, um unbeschädigte Zellen und Ablagerungen zu pelletieren. Zentrifugieren Sie den resultierenden Überstand fünf Minuten lang bei 3.000 G bei 4 Grad Celsius, um die Kerne zu pelletieren. Übertragen Sie dann den Überstand in frische Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei 12.000 g bei 4 Grad Celsius, um die Mitochondrien und andere Organellen zu pelletieren, und suspendieren Sie das Pellet nach dem Dekantieren des Überstands wieder in einem Milliliter eiskaltem Sorbitol-EDTA-Mopppuffer. Dann erneut 15 Minuten bei 12.000 G bei 4 Grad Celsius zentrifugieren, um die Mitochondrien zu waschen. Suspendieren Sie das fertige Pellet wieder in einem Milliliter eiskaltem Sorbit EDTA Mopppuffer. Aliquotieren Sie dann die gereinigten Mitochondrien in Speicherröhrchen für zukünftige Experimente. Beim SDS Seitenladepuffer in 40 Mikroliter mitochondriales Gesamtprotein. Denaturieren Sie die Proteine, indem Sie die Mischung für die angegebene Zeit bei der entsprechenden Temperatur inkubieren. Laden Sie vor dem Immunblotting etwa 20 Mikrogramm oder vier Mikroliter mitochondrialer Proteine in ein 12%iges SDS-Seitengel. Um die Probe für die BN-Seite vorzubereiten, werden zunächst Mitochondrien aus früheren Aliquoten durch Zentrifugation granuliert. Suspendieren Sie die Mitochondrien in 200 Mikrolitern mit drei XBN-Seiten-Gelpuffern. Als nächstes pipettieren Sie zwei Mikroliter 100 X Phenylmethylsulfonylfluorid und einen Mikroliter eines molaren Magnesiumchlorids. Erneut 15 Minuten bei 12.000 g bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Suspendieren Sie das Mitochondrien-Pellet in 160 Mikrolitern mit 5 Gew.-% digitorum. 30 Minuten auf Eis inkubieren und alle 10 Minuten vorsichtig mischen. Zentrifugieren Sie die Suspension fünf Minuten lang bei 20.000 g bei 4 Grad Celsius. Übertragen Sie dann den Überstand in ein frisches Röhrchen. Geben Sie 80 Mikroliter Drei-XBN-Seiten-Probenpuffer in die mit digitorum behandelte Probe. Oder 32 Mikroliter auf die DDM-behandelte Probe. Montieren Sie nun die vorgefertigten nativen Bis-Tris-Gele mit einem Gefälle von 3 bis 12 %. Laden Sie die behandelten Proteinproben zusammen mit Proteinmarkern mit hohem Molekulargewicht für die native Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Lassen Sie das Gel 30 Minuten lang bei einer konstanten Spannung von 80 Volt und einem Strom von sechs Milliampere mit einem Kathodenpuffer mit 0,02 % Kumasi G250 laufen. Ersetzen Sie den Puffer durch einen Kathodenpuffer ohne Kumasi und lassen Sie ihn drei Stunden lang mit 10 Milliampere laufen, bis die Farbstofffront den Gelboden erreicht. Schneiden Sie die Gelbahn mit dem Proteinmarker ab. Färben Sie den Marker 15 Minuten lang mit Kumasi R250 Puffer. Anschließend entfärben, bis die Bänder sichtbar werden. Tauchen Sie den restlichen Teil des Gels 30 Minuten lang in BN Page Transfer Buffer, um ihn auszugleichen. Spülen Sie die 0,45-Mikrometer-PVDF-Blot-Membran mit Methanol und äquilibrieren Sie sie 10 Minuten lang in Transferpuffer. Übertragen Sie Proteine aus dem Gel mit einem konstanten Strom von 300 Milliampere für zwei Stunden auf die PVDF-Membran. Spülen Sie die PVDF-Membran mit Methanol, um den Kumasi-Farbstoff zu entfernen. Dann inkubieren Sie die Membran eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius in TBS-Blockierungspuffer mit 5 % Magermilch. Inkubieren Sie die PVDF-Membran mit den spezifizierten Primärantikörpern gegen mitochondriale Atmungskettenkomplexe von Schizosaccharomyces pombe. Nach einer Inkubation über Nacht bei vier Grad Celsius waschen Sie die Membran mit TBST-Puffer. Dann inkubieren Sie die Membran im Sekundärantikörper in einer Verdünnung von eins bis 10.000 für eine Stunde bei 25 Grad Celsius. Nachdem Sie die Membran mit TBST-Puffer gewaschen haben, belichten und scannen Sie die PVDF-Membran, um die Ergebnisse des Immunblots zu visualisieren. Die Deletion des shy1-Gens führte zu einer deutlichen Verringerung der Steady-State-Spiegel der mitochondrialen DNA-kodierten Atmungskettenproteine Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 und Atp6. Die Analyse der blauen nativen Seite zeigte, dass die Häufigkeit der DG-Solubilisierten Superkomplexe der Atmungskette 3242 und 324 in Delta-shy1-Zellen reduziert war. Während die Spiegel der Superkomplexe 32.= und 55N unbeeinflusst blieben. Der Gehalt an DDM-solubilisiertem diametralen Komplex 3 war im Delta shy1-Stamm unverändert.