Name: Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Lernen Sie die Visualisierung von Germinosomen in Bacillus subtilis-Sporen mit Super-Resolution-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisierung von Keimungsrezeptorclustern und Membrandomänen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Christiaan Zeelenberg für seine Unterstützung während der SIM-Bildgebung. JW anerkennt der China Scholarship Council für ein Promotionsstipendium und Dank Irene Stellingwerf für ihre Hilfe in der primären Phase der Bildgebung.

1. B. Subtillis Sporenbildung (Timing: 7 Tage vor der mikroskopischen Beobachtung)
<ol><li>
Tag1
	<ol>
<li>Eine Bakterienkultur auf ein Luria-Bertani Brühe (LB) Agar-Platte (1 % Tryptone, Hefeextrakt 0,5 %, 1 % NaCl, 1 % Agar)13 Streifen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, einzelne Kolonien zu erhalten. Verwenden der B. Subtilis -KGB80 (PS4150 GerKA GerKC GerKB-mCherry Katze, GerD-Gfp kan) Stamm und seinen Hintergrund Elternstamm B. Subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) bereits7beschrieben. Hinweis: Der Einsatz von Sporen mit ΔcotEΔgerE Hintergrund ist in Germinosome Visualisierung, um die Autofluoreszenz des Spore Mantel Schichten7zu minimieren.</li>
		<li>Sterilisieren Sie alle Medien, Rohre, Mehrkanalpipette und andere Kultur-Materialien mit geeigneten Methoden verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tag2
	<ol>
<li>Impfen Sie eine einzige Kolonie in 5 mL LB-Medium in den frühen Morgenstunden zu und inkubieren Sie die Kultur unter ständige Unruhe in einem Schraubverschluss Rohr bei 200 u/min/min und 37 ° C, bis die OD600 0,3-0,4 (ca. 7 h) erreicht.</li>
		<li>500 mL MOPS Medium (pH 7,5) zu machen, enthält 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O 0,276 mM K2SO4, 0,01 mM FeSO4·7H2O 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-Glukose-Monohydrat und 10 mM NH4Cl.</li>
		<li>Schraubverschluss Röhren 10-1- 10-7 Verdünnungsreihen der LB-Kultur in 5 mL MOPS Medium vorbereiten und die Kulturen über Nacht unter ständigen Unruhe bei 200 u/min/min und 37 ° c inkubieren Hinweis: Die serielle Verdünnungen hier wollen eine Verdünnung in frühen exponentielle Phase am nächsten Morgen zu gewinnen. Diesen und den nächsten Schritt sind erforderlich, damit die Zellen zur Anpassung an den MOPS gepufferten Wachstumsmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tag3
	<ol>
<li>Wählen Sie eines der MOPS Verdünnungen mit einem OD-600 von 0,3 bis 0,4. Impfen Sie 0,2 mL der Kultur auf vorgewärmten (37 ° C) 20 mL MOPS Medium in eine konische 250 mL Flasche zu und inkubieren Sie unter ständigen Unruhe bis OD600 0,3-0,4 (~ 7 h) erreicht.</li>
		<li>Beimpfen der MOPS basierend Sporenbildung Medium (250 mL) mit 1 % (V/V) Vorkultur ab Schritt 1.3.1 und inkubieren Sie für 3 Tage bei 37 ° C in einem konischen Liter Kolben unter ständige Unruhe. FM4-64 Färbung von PS4150 Sporen, fügen Sie 2 µg/mL FM4-64 Sonde (siehe Tabelle der Materialien), die Sporenbildung Medium 1 oder 2 h nach dem Gipfel OD600 Wert des vegetativen Wachstums (in der Regel etwa 2) und ermöglichen die Kultur zu Anschließend sporulate während es schützt vor Licht5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
7. Tag: Ernte von Sporen
	<ol>
<li>Bestimmen Sie die Sporenbildung Ausbeute (Sporen Vs vegetativen Zellen) mit Phasenkontrastmikroskopie bei 100 X Vergrößerung, um die Phase hellen Sporen aus Phase dunklen Zellen und evtl. reifen Sporen zu unterscheiden. Eine 90 % Phase hell Spore Ausbeute wird erwartet.</li>
		<li>Pellet-die Sporen bei 4.270 X g für 15 min bei 4 ° C im Rundboden Zentrifuge Röhren. Waschen Sie die Spore Pellet 2-3 Mal mit 40 mL sterilem hochreine Typ1 demineralisiertes Wasser in 50 mL konische Zentrifuge Röhren (siehe Tabelle der Materialien). Spin-Down bei jedem Waschgang 4.270 x g für 15 min (4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tag 7: Spore-Reinigung
	<ol>
<li>Spore Reinigung: Spore Pellet in 750 µL 20 % nichtionische Dichte Gradienten Medium aussetzen (siehe Tabelle der Materialien) und laden auf 800 µL 50 % nichtionische Dichte Gradienten Medium in sterilisierten Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 60 min bei 21.500 X g. Das Pellet erhalten enthält die kostenlose Sporen. Aussetzen der Spore Pellet in 200 µL 20 % nichtionische Dichte Gradienten Medium und laden auf 1 mL 50 % nichtionische Dichte Gradienten Medium in einem Microcentrifuge Schlauch und Zentrifuge für 15 min bei 21.500 X g.</li>
		<li>Waschen Sie die endgültige Spore Zubereitung und Lagerung: das Pellet erhalten enthält gereinigten Sporen. Waschen das Spore-Pellet 2-3 Mal mit 1,5 mL sterile Reinstwasser Typ1 (siehe Tabelle der Materialien) und Spin-Down zwischen 9.560 x g für 15 min bei 4 ° c Zu guter Letzt das Pellet in sterilen Typ1 Reinstwasser auf eine endgültige OD600 von rund 30 aussetzen. Aliquote der Sporen können bei-80 ° C für 8 Wochen14gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Entschichten
<ol><li>PS4150 Sporen zu behandeln mit 0,1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) / 0,1 M Dithiothreitol (DTT) bei 70 ° C für 1 h waschen die Sporen 10 Mal mit sterilisierten Reinstwasser Typ1 Wasser15,16. Auf diese Weise einer FM4-64-Sonde in der Spore äußeren Membran adsorbiert und äußere Schichten entfernt werden.</li>
</ol>3. Deckglas und Vorbereitung der Folie11 (Timing: 1 H vor Beobachtung)
<ol><li>Pre-clean hochpräzise Deckgläsern (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 M HCl für 30 min im Wasserbad vorsichtig schütteln. Waschen der Deckgläsern zweimal in Reinstwasser Typ1, und speichern sie in 100 % (Vol/Vol) EtOH. Lassen Sie sie trocknen und ihre Klarheit vor der Verwendung zu überprüfen. Pre-reinigen Sie den Objektträger in 70 % EtOH. Lassen Sie sie trocknen und ihre Klarheit vor der Verwendung zu überprüfen.</li>
</ol>(4) Sampling fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen in der gen-Rahmen Folie10 (Timing-15 Min)
<ol><li>Vorwärmen zwei 70 % EtOH gereinigt und Luft getrockneten Objektträger (siehe Tabelle der Materialien) für einige Sekunden auf einem Heizblock 70 ° C, 65 μL der sterilisierten 2 % Agarose statt bei 70 ° C auf einem Objektträger fallen und legen Sie die anderen Glas-Folie an der Spitze die Agarose-b zu verbreiten Wischen der Folien. Die Agarose-Patch wird in ca. 5 min trocknen.</li>
	<li>Schneiden den Agarose-Patch in einem 1 x 1cm-Abschnitt nach dem Entfernen der Glas-Folien 0.4 μl der Probe (fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen von ~ 10-8-/mL), und den Patch auf die hohe Präzision Deckglas zu übertragen, indem man das Deckglas auf den Patch und Abrutschen.</li>
	<li>Befestigen Sie einen Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 µL) auf die getrocknete Folie, die das Deckglas schließen alle Ecken des Rahmens aufgesetzt ist, womit sich die Folie für den Einsatz in der Mikroskopie.</li>
</ol>(5) Imaging11,17(Timing: 1 H)
<ol><li>Erfassen die Übertragungs- und Fluoreszenz Bilder von Sporen sowie eine Mischung aus rot und gelb-grün Carboxylat-modifizierte fluoreszierende Mikrosphären auf eine strukturierte Beleuchtung-Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien) ausgestattet mit 100 x Objektiv (Öl) Numerische Apertur = 1.49), eine CCD-Kamera und Bild-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Alle Bilder bei Raumtemperatur ohne die Störung des Umgebungslichts zu generieren. Achten Sie darauf, immer das 100 x Objektiv und die Folie mit 75 % Ethanol vor Bildgebung zu reinigen.</li>
	<li>Fokus auf 100 nm (Durchmesser) fluoreszierenden Mikrosphären und optimieren Sie die Point-spread-Funktion (Psf) durch die Anpassung des Korrektur-Ring auf das 100 X Objektiv, bis eine symmetrische Psf minimiert Unschärfe des Bildes erreicht ist. Die Psf ist die Impulsantwort oder die Reaktion ein bildgebendes System auf eine Punktquelle oder Point-Objekt.</li>
	<li>Wählen Sie eine Sichtfeld mit ca. 10 Runden fluoreszierenden Mikrosphären. Wenden Sie ein Gitter Fokuseinstellung für beide 561 nm und 488 nm Erregung Wellenlängen als Leitfaden für die Bildanalyse-Software.</li>
	<li>Konzentrieren Sie sich die Sporen mit dem Getriebe-Licht und erfassen Sie eine Übertragung Lichtbild in die 16 × durchschnittliche Modus mit 200 ms Belichtungen für jedes Bild zu.</li>
	<li>3D-SIM fluoreszierende Rohbilder der Sporen mit Beleuchtung-Modus "3D-SIM", die Kamera-Einstellungen Auslesen Modus Elektron Multiplikation (EM) Gain 10MHz bei 14-Bit- und EM-Gewinn bei 175 zu erfassen. Begeistern Sie die FM4-64-Sonde in PS4150 Sporen mit 561 nm Laserlicht an 20 % Laserleistung und eine Leuchtdauer von 400 ms.</li>
	<li>GerKB-mCherry zu begeistern und GerD-GFP in KGB80 Sporen mit, bzw. 561 nm Laserlicht bei 30 % Laserleistung für 1 s und 488 nm Laserlicht an 60 % Leistung laser für 3 S. Z-Stapel-Einstellungen sind in der von oben nach unten Modus, 0,2 µm / Schritt, 7 Schritte und 20 Schritten für Germinosome und IM Analyse, beziehungsweise. Hinweis: Diese Laserparameter wurden angewandt, um einen maximalen Helligkeitswert im Histogramm-Fenster von rund 4.000 zu gewährleisten.</li>
</ol>6. rekonstruieren Sie 3D-SIM Raw-Bilder von FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen
<ol><li>Durchführen Sie die N-SIM Scheibe Rekonstruktion für den FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen raw-Daten. Klicken Sie auf Param für Rekonstruieren Slice auf der N-SIM Pad Registerblatt, N-SIM Scheibe Wiederaufbau-Fenster zu öffnen.</li>
	<li>Legen Sie die Wiederaufbau-Parameter im Fenster N-SIM Scheibe Wiederaufbau . Um perfekte rekonstruierten Bilder, folgen Sie den Vorschlag der N-SIM Anweisungen und klicken Sie auf die entsprechenden Steuerelemente im Fenster N-SIM Scheibe Rekonstruktion der Beleuchtung Modulation Kontrast (IMC) auf Auto, hoch eingestellt Auflösung Noise Suppression (HRNS) 1.00 und Aus dem Fokus verwischen Unterdrückung (OFBS) auf 0,05 als Ausgangspunkte.</li>
	<li>Klicken Sie auf Scheibe zu rekonstruieren , im Fenster N-SIM Scheibe Wiederaufbau , das Bild zu rekonstruieren. Bewerten Sie die Qualität der rekonstruierten Bilder durch die schnelle Fourier umgewandelt (FFT) Bilder und Wiederaufbau-Score, der nach der Rekonstruktion12angezeigt.</li>
	<li>Passen Sie die HRNS von 0,10 bis 5.00 und OFBS von 0,01 bis 0,50 durch Klick auf die entsprechenden Steuerelemente im Fenster " N-SIM Scheibe Rekonstruktion ", bis die besten Parametereinstellungen abgerufen werden.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche im Fenster N-SIM Scheibe Bildinventars , geänderte Parameter anzuwenden . Klicken Sie auf die Schaltfläche Schließen , um das Fenster zu schließen.</li>
	<li>Machen Sie eine FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen raw-Bild aktiv und klicken Sie Rekonstruieren Slice auf der N-SIM Pad Registerblatt Slice Rekonstruktionausführen. Speichern Sie das rekonstruierte Bild.</li>
</ol>7. die Bildanalyse
<ol><li>
Konvertieren Sie Pseudo-Weitfeld-Bilder von der KGB80 germinosome
	<ol>
<li>Umwandeln Sie 3D-SIM raw-Bilder von KGB80 durch die Aktivierung mit einem Linksklick ImageJ Plugins SIMcheck Dienstprogramm Raw Daten SI zu Pseudo-Weitfeld12in Pseudo-Weitfeld-Bilder. Pseudo-Weitfeld Bilder aus SIM-Rohdaten im Durchschnitt und montiert, zum Vergleich ein Bild konventionellen Weitfeld Beleuchtung12entspricht. ImageJ selbst finden Sie unter https://imagej.net/Welcome. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie aus ~ 25 Sporen in jedem Bild invertierte Übertragung für eine spätere Analyse der Germinosome in den fluoreszierenden Pseudo-Weitfeld-Bildern.</li>
		<li>Wählen Sie aus insgesamt rund 350 (in diesem Beispiel, 346) KGB80 Sporen in 14 Sichtfelder aus zwei Folien. Die GerD-GFP und GerKB-mCherry fluoreszierende Herde Zahlen in ausgewählten KGB80 Sporen sollte unabhängig von den beiden Forschern gezählt werden. Die Forscher kann auf die 3D-SIM-raw-Bilder wann immer im Zweifel an die Anwesenheit von separaten fluoreszierende Germinosome Brennpunkte in Sporen zurückgreifen.</li>
		<li>Bewerten Sie die maximalen Intensitäten der jeder GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkt und die integrierte Intensität der einzelnen KGB80 Spore 3D-Bild mit ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analysieren Sie Pseudo-Weitfeld-Bilder von der KGB80 germinosome
	<ol>
<li>Verwenden Sie die mittlere integrierte Intensitätswert 7 Stacks als die integrierte Signalintensität KGB80 Spore. Bestimmen Sie Hintergrund-Intensitäten von imaging-Hintergrund-Stamm PS4150 mit identischen Einstellungen. Betrachten Sie fluoreszierende Flecken in einzelnen KGB80 Sporen als Germinosome Herde wenn sie aus dem Hintergrund deutlich unterscheidbar sind.</li>
		<li>One-Way ANOVA-Tests zur Bestimmung der Bedeutung mit Software Origin 9.0 anwenden. in Anbetracht der P-Werte < 0,05 als statistisch signifikante. Verwenden der Spearman Rank Korrelationskoeffizient18 , die Korrelation von GerD-GFP und GerKB-mCherry Schwerpunkte-Reihe und die Messungen der integrierten Signalintensität zu bewerten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).</li>
<li>Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+the+orders+Bacillales+and+Clostridiales%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales.</a> Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).</li>
<li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+nutrient+germinant+receptors+and+SpoVA+proteins+of+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores.</a> FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Summer+meeting+2013%E2%80%93when+the+sleepers+wake%3A+the+germination+of+spores+of+Bacillus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).</li>
<li>Cowan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+in+the+inner+membrane+of+dormant+spores+of+Bacillus+species+are+largely+immobile%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).</li>
<li>Loison, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+investigation+of+viscosity+of+an+atypical+inner+membrane+of+Bacillus+spores%3A+a+molecular+rotor%2FFLIM+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).</li>
<li>Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+proteins+in+the+inner+membrane+of+dormant+Bacillus+subtilis+spores+colocalize+in+a+discrete+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster.</a> Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).</li>
<li>Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+dynamics+of+a+Bacillus+subtilis+spore+germination+protein+complex+during+spore+germination+and+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth.</a> Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).</li>
<li>Wegel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cellular+structures+in+super-resolution+with+SIM%2C+STED+and+Localisation+Microscopy%3A+A+practical+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison.</a> Scientific Reports. 6, 27290(2016).</li>
<li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+germination+and+outgrowth+of+individual+Bacillus+subtilis+spores%3B+the+effect+of+heat+stress+quantitatively+analyzed+with+SporeTracker%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker.</a> PloS One. 8 (3), e58972(2013).</li>
<li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15915(2015).</li>
<li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STUDIES+ON+LYSOGENESIS+I.%3A+The+Mode+of+Phage+Liberation+by+Lysogenic+Escherichia+coli1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1.</a> Journal of Bacteriology. 62 (3), 293(1951).</li>
<li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+effect+of+specific+tea+compounds+on+germination+and+outgrowth+of+Bacillus+subtilis+spores+at+single+cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution.</a> Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+subtilis+spore+inner+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Bacillus subtilis spore inner membrane proteome.</a> Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).</li>
<li>Vepachedu, V. R., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+SpoVAD+to+the+inner+membrane+of+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).</li>
<li>Schouten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dendritic+spines+of+rat+primary+hippocampal+neurons+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Mukaka, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+appropriate+use+of+correlation+coefficient+in+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Malawi+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research.</a> Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).</li>
<li>Stewart, K. A., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numbers+of+individual+nutrient+germinant+receptors+and+other+germination+proteins+in+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).</li>
<li>Laflamme, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+germinating+Bacillus+spores%2C+using+membrane+potential+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye.</a> Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).</li>
<li>Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dye+binding+by+and+membrane+potential+in+spores+of+Bacillus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species.</a> Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).</li>
<li>Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levels+of+germination+proteins+in+dormant+and+superdormant+spores+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis.</a> Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).</li>
<li>Abhyankar, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+sporulation+conditions+on+the+spore+coat+protein+composition+of+Bacillus+subtilis+Spores%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores.</a> Frontiers in microbiology. 7, 1636(2016).</li>
<li>Rose, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+properties+of+Bacillus+subtilis+spores+made+in+liquid+or+on+agar+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates.</a> Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).</li>
<li>Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+protein+levels+and+rates+of+germination+of+spores+of+Bacillus+subtilis+with+overexpressed+or+deleted+genes+encoding+germination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins.</a> J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).</li>
<li>Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sporulation+conditions+on+the+germination+and+germination+protein+levels+of+Bacillus+subtilis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores.</a> Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).</li>
<li>Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+membranes+of+bacterial+endospores+are+reservoirs+for+spore+core+membrane+expansion+during+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination.</a> Scientific Reports. 8, 11388(2018).</li>
<li>Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+homologue+MreB+organizes+the+bacterial+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane.</a> Nature Communications. 5, (2014).</li>
<li>Strahl, H., Hamoen, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+is+important+for+bacterial+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Membrane potential is important for bacterial cell division.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).</li>
<li>Swarge, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22One-Pot%22+sample+processing+methodfor+proteome-wide+analysis+of+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">"One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores.</a> Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169(2018).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Das Protokoll präsentiert enthält ein standard-3D-SIM-Verfahren zur Analyse von FM4-64 gebeizt B. Subtilis Sporen, die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und bildgebende Verfahren enthält. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll eine modifizierte SIMcheck (ImageJ)-unterstützt 3D imaging-Prozess für die SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Spore Germinosomes beschriftet mit fluoreszierenden Reportern. Die letztere Vorgehensweise konnten wir diese dim Unterkonstruktion mit verbesserten Kontrast zu beobachten. D...

Sporen der Aufträge Bacillales und Clostridiales sind metabolisch ruhenden und außerordentlich widerstandsfähig gegen raue Dekontamination Regime, aber es sei denn, sie Keimen, können nicht dazu führen, dass schädliche Auswirkungen im Menschen1. In nährstoffreichen germinant ausgelöste Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) ist die Einleitung Veranstaltung germinant Bindung an germinant Rezeptoren (GRs) befindet sich in der Spore innere Membran (IM). Anschließend transduzieren die GRs Signale an den SpoVA-Kanal-Protein befindet sich auch in der IM. Dies führt bei der Entstehung des Austauschs von Spore Kern Pyridin-2,6-dicarboxylic Säure (Dipicolinic Säure; DPA; bestehend aus 20 % der Spore Kern trocken wt) für Wasser über den SpoVA Kanal. Anschließend die DSG-Version löst die Aktivierung der Hirnrinde Peptidoglycan Hydrolyse und zusätzliche Wasseraufnahme folgt2,3,4. Diese Ereignisse führen zu mechanischen Belastungen auf die Schichten, seine spätere Ruptur, Beginn der Auswuchs und schließlich vegetative Wachstum. Die genauen molekularen Details der Keimungsprozess werden jedoch noch weit von aufgelöst.
Eine wichtige Frage zu Spore Keimung betrifft die biophysikalischen Eigenschaften der Lipide IM Keimung Proteine sowie die IM SpoVA-Kanal-Proteine. Diese weitgehend unbeweglich IM Lipid Bilayer ist die wichtigste Permeabilitätsbarriere für viele kleine Moleküle, einschließlich giftige chemische Konservierungsmittel, von die einige ihr Handeln in die Spore Kern oder vegetativen Zelle Zytoplasma5,6ausüben. IM Lipid Bilayer dürfte in einem Gel-Zustand gibt es zwar ein erheblicher Anteil der mobilen Lipide in der IM5. Die Spore IM hat auch das Potenzial für signifikante Erweiterung5. Somit erhöht sich die Fläche der IM 1,6-fache bei der Keimung ohne zusätzliche Membran Synthese und geht einher mit dem Verlust dieser Membran charakteristische niedrige Permeabilität und Lipid Unbeweglichkeit5,6.
Während die molekularen Details der Aktivierung von Proteinen, Keimung und Organisation IM Lipide in Sporen sind attraktive Themen für das Studium, Herausforderung die geringe Größe von B. Subtilis Sporen und die relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, eine mikroskopische Analysen. Griffiths Et Al. zwingende Beweise dafür Epifluoreszenz Mikroskop, mit fluoreszierenden Reporter verschmolzen zu Keimung Proteine, legt nahe, dass das Gerüst Protein GerD B. Subtilis Sporen drei GR-Untereinheiten (A, B und C) für GerA, B und K GRs organisiert, in einer Cluster-7. Sie prägte den Begriff "Germinosome" für diesen Cluster der Keimung Proteine und die Strukturen als ~ 300 nm großen IM Protein Brennpunkte8beschrieben. Bei der Initiation der Spore Keimung, fluoreszierende Germinosome Brennpunkte letztlich verwandeln sich in größeren disperse fluoreszierende Muster mit > 75 % der Spore Bevölkerungen Anzeigen dieses Muster in Sporen gekeimt für 1 h mit L-Valin-8. Beachten Sie, dass das Papier oben verwendeten genannten Bilder aus Dutzenden von aufeinander folgenden fluoreszierenden Bilder gemittelt, um statistische Aussagekraft gewinnen und die Hürde niedrig fluoreszierende Signale beobachtet während der Bildgebung. Diese Visualisierung dieser Strukturen in Bakteriensporen war am Rande des technisch mit klassischen mikroskopischen Tools und weder eine Bewertung der Höhe der Herde in einem einzigen Spore Machbaren auch ihre ausführlichere subzelluläre Lokalisation mit diesem Ansatz möglich.
Hier zeigen wir den Einsatz von strukturierten Beleuchtung Mikroskopie (SIM), eine detaillierte Visualisierung zu erhalten und Quantifizierung der Germinosome(s) in Sporen von B. Subtilissowie ihre IM Lipid Domänen9. Das Protokoll enthält auch Anleitungen für die Sporenbildung, Folie Vorbereitung und Bildanalyse von SIMcheck (v1. 0, eine ImageJ-Plugin) sowie ImageJ10,11,12.

<table><tbody><tr><td>Luftgetrocknete Glasobjektträger</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>630-2870</td><td></td></tr><tr><td>APO TIRF N20R8 100&faches Ölobjektiv (NA=1.49)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B. subtilis PS4150 (PS832 &Delta; gerE::spc, &Delta; cotE::tet)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben 1 L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z567868</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben 250 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z723088</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres carboxylatmodifizierte Mikrosphären</td><td>Invitrogen, 0,1 &mu; m</td><td>F8803</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F34653</td><td></td></tr><tr><td>Histodenz nichtionischer Dichtegradient mittel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXON3 DU-897 X-6515 CCD-Kamera</td><td>Andor Technology</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofuge-Röhrchen 1,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3451PK</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop-Bildgebungssoftware</td><td>Nikon, Japan</td><td>NIS-Element AR 4.51.01</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Ultrapure deminerilziertes</td><td>Wasser Millipore Milli-Q</td><td>IQ 7003</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen Schraubverschlussflasche 180 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003800</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Deckgläser</td><td>Paul Marienfeld</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchen mit rundem Boden 15 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr><tr><td>Röhrchen mit Schraubverschluss 50 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Nunc TM</td></tr></tbody></table>

visualisierung von germinosomes und die innere membran in bacillus subtilis sporen

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Die geringe Größe der Sporen und der relativ geringen Fülle der Keimung Proteine, Schwierigkeiten in ihrer mikroskopischen Analysen mittels Epifluoreszenz Mikroskopie. Höchstauflösung dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) ist ein viel versprechendes Instrument, diese Hürde zu überwinden und die molekularen Details den Prozess der Keimung der Sporen von Bacillus Subtilis (B. Subtilis) zeigen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer modifizierten SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging-Prozess und fluoreszierende Reporter Proteine für SIM-Mikroskopie von B. Subtilis Sporen Germinosomes, Transaktionskonflikten der Keimung Proteine. Außerdem präsentieren wir ein (standard) 3D-SIM bildgebendes Verfahren für FM4-64 Färbung von B. Subtilis Sporen Membranen. Mithilfe dieser Verfahren wir unübertroffene Auflösung für die Lokalisierung der Germinosome erhalten und zeigen, dass > 80 % der B. Subtilis KGB80 Sporen nach der Sporenbildung auf definierten minimalen MOPS Medium erhalten haben, ein oder zwei GerD-GFP und GerKB-mCherry Brennpunkte. Helle Herde waren auch bei FM4-64 gefärbten Sporen 3D-SIM Bilder darauf hindeutet, dass innere Membran Lipid Domänen wahrscheinlich unterschiedliche Flüssigkeit vorhanden sein. Sind weitere Studien, mit denen doppelte Kennzeichnung Verfahren mit Membran Farbstoffe und Germinosome Reporter Proteine Co Lokalisierung zu bewerten und erhalten so einen optimalen Überblick über die Organisation des Bacillus Keimung Proteine in der inneren Spore-Membran möglich.

Das aktuelle Protokoll stellt ein SIM-Mikroskop bildgebendes Verfahren für bakterielle Sporen. Die Sporenbildung und Folie Vorbereitung Verfahren wurden durchgeführt, wie in Abbildung 1 gezeigt, vor der Bildgebung. Später wurden die Bildverarbeitung und Analyse Verfahren angewandt sowohl für dim (fluoreszierendes Protein mit der Bezeichnung Keimung Proteine) und hell (lipophile Sonde IM gebeizt) Spore zu Proben, wie im folgenden Text dargestellt.
<p class...

Germinant Rezeptor-Proteine-Cluster in "Germinosomes" in der inneren Membran der Bacillus Subtilis Sporen. Wir beschreiben ein Protokoll mit Superresolution Mikroskopie und Leuchtstoffröhren Reporter Proteine, um Germinosomes zu visualisieren. Das Protokoll zeigt auch Spore innere Membrandomänen, die bevorzugt mit dem Membran-Farbstoff FM4-64 gefärbt sind.

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Die superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie 3D-SIM ist eine innovative Technik zur Visualisierung fluoreszierender Reporterproteine von Keimrezeptorclustern in Sporenmembranen. Mit diesen Verfahren, unübertroffene Auflösung der germinosome Lokalisation und Sporen innere Membran Lipid Domänen erreicht werden können. Die Technik wird von Doktorand Juan Wen und Master of Science Student Raymond Pasman von unserem Labor demonstriert werden.Reinigen Sie vor Beginn des Verfahrens hochpräzise Abdeckungen mit ein-molaren Salzsäure für 30 Minuten in einem sanft schüttelnden Wasserbad, gefolgt von zwei, fünfminütigen Wärern in reinem Typ 1 Wasser. Nach der zweiten Wäsche die Deckellipsen etwa drei Minuten in 100%Ethanol geben, bevor Sie die Deckellipsen trocknen und ihre Klarheit überprüfen. Anschließend gleitet das Glasmikroskop eine Minute lang mit 70% Ethanol, bevor die Dias trocknen und deren Klarheit überprüft wird.Für die fluoreszierende Mikrosphäre und Sporenbildgebung werden zunächst zwei Dias auf einem 70-Grad-Celsius-Heizblock für einige Sekunden vorwärmen, bevor ein 70-Grad-Celsius-, 65-Mikroliter-Tröpfchen sterilisierter 2%Agarose auf einen der Dias hinzugefügt wird. Platzieren Sie die andere Folie oben, um die Agarose zwischen den Folien zu verteilen. Nach fünf Minuten eines der Dias entfernen und die getrocknete Agarose in einen Ein-mal-Ein-Zentimeter-Abschnitt schneiden.Fügen Sie der Agarose ein mal 10 zu den achten fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen in 0,4 Mikroliter nsterilem, ultrareinem Typ-1-Wasser hinzu, und legen Sie einen hochpräzisen Deckelaufschlag auf den Patch, indem Sie den Deckelrutsch verwenden, um den Patch von der Rutsche auf die Deckslip-Oberfläche zu schieben. Fixieren Sie dann einen 65-Mikroliter, 1,5 mal 1,6-Zentimeter-Genrahmen auf einem getrockneten Schlitten, und legen Sie den Deckelrutsch auf den Rahmen, indem Sie alle Ecken des Rahmens schließen. Legen Sie den Dia für die Bildgebung der Proben auf ein strukturiertes Beleuchtungsmikroskop, das mit einem 100-fachen Ölobjektiv ausgestattet ist, und konzentrieren Sie sich auf die 100-Nanometer-Fluoreszenzmikrosphären.Passen Sie den Korrekturring am 100x-Objektiv an, bis eine symmetrische Punktstreufunktion erhalten ist, um die Unschärfe der Bilder zu minimieren, und wählen Sie ein Sichtfeld mit ca. 10 runden fluoreszierenden Mikrosphären aus. Wenden Sie eine Gitterfokuseinstellung für die angegebenen Anregungswellenlängen, in diesem Fall 561 und 488 Nanometer, als Richtschnur für die Bildanalysesoftware an, bevor Sie sich mit dem Transmissionslicht auf die Sporen konzentrieren. Erfassen Sie ein Übertragungslichtbild im 16-fachen Durchschnittsmodus mit 20-Millisekunden-Belichtungen für jedes Bild.Erfassen Sie dann mit dem 3D-SIM-Beleuchtungsmodus rohfluoreszierende Bilder der Sporen mit 3D-strukturiertem Beleuchtungsmikroskop. Für die Slice-Rekonstruktion klicken Sie auf Param auf dem Registerkartenblatt für strukturierte Beleuchtungspads, um das Fenster N-SIM Slice Reconstruction zu öffnen. Befolgen Sie die vorgeschlagenen Anweisungen, und klicken Sie auf die entsprechenden Steuerelemente, um den Kontrast zur Beleuchtungsmodulation auf Auto, die hochauflösende Rauschunterdrückung auf eine und die Ausblendungsunterdrückung auf 0,05 als Ausgangspunkt festzulegen.Klicken Sie dann auf Slice rekonstruieren, um das Bild zu rekonstruieren und die Qualität der rekonstruierten Bilder anhand der schnellen Fourier-transformierten Bilder und der Rekonstruktionspartitur zu bewerten, die nach der Rekonstruktion angezeigt werden. Passen Sie das hochauflösende Rauschen von 0,1 bis fünf und die Ausblendungsunterdrückung von 0,01 bis 0,5 an, bis die besten Parametereinstellungen erreicht sind. Klicken Sie dann auf Anwenden, um die Änderungen anzuwenden.Klicken Sie auf Schließen, um das Fenster zu schließen. Öffnen Sie ein FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen Rohbild. Klicken Sie dann auf Slice rekonstruieren, um die Slice-Rekonstruktion auszuführen, und speichern Sie das rekonstruierte Bild.Um die 3D-SIM-Rohbilder des KGB80-Geminosomes in Pseudo-Weitfeldbilder umzuwandeln, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das ImageJ SIMcheck Plugin und wählen Raw Data SI und Pseudo Widefield aus. Wählen Sie zufällig etwa 25 Sporen in jedem invertierten Übertragungsbild für eine spätere Germinosomenanalyse in den fluoreszierenden Pseudo-Weitfeldbildern aus, bis etwa 350 Sporen ausgewählt wurden. Verwenden Sie dann ImageJ, um die maximale Intensität für jedes fluoreszierende Signal, das von jeder Gruppe von Sporen ausgedrückt wird, und die integrierte Intensität jedes 3D-Sporenbildes zu bewerten.Um die Pseudo-Weitfeldbilder des KGB80 Germinosom zu analysieren, verwenden Sie den mittleren integrierten Intensitätswert von sieben Stapeln als integrierte Signalintensität der KGB80 Sporen. Bestimmen Sie dann die Hintergrundintensitäten, indem Sie die PS4150-Hintergrunddehnung mit identischen Einstellungen abbilden, und betrachten Sie die fluoreszierenden Flecken in einzelnen KGB80-Sporen als germinosome-Foci, wenn sie sich deutlich vom Hintergrund unterscheiden. In diesem repräsentativen Experiment traten zwei Brennpunkte der GerD-GFP-Fluoreszensporen in verschiedenen Stapeln auf, wobei im kompositiven Z3-Stack insgesamt drei GerD-GFP-Schwerpunkte beobachtet wurden.Hier wurde eine Sporenmitenmit nur einem GerD-GFP-Schwerpunkt im Sporen beobachtet. Insgesamt hatten etwa 40 bis 50% der Sporen zwei bzw. einen GerD-GFP- bzw. GerKB-mCherry-Cluster. Während die integrierte Intensität des GerD-GFP Gerüstproteins zwischen verschiedenen Populationen unterschiedlich war, war die integrierte Intensität von GerKB-mCherry in verschiedenen Populationen ungefähr gleich.Wenn die Sporen mehrere Brennpunkte hatten, verringerte sich die maximale Fluoreszenzintensität von GerD-GFP und GerKB-mCherry-Brennpunkten, und die maximale Fluoreszenz aller hellen Flecken, die als germinosome-foci angesehen wurden, war höher als die maximale Autofluoreszenz der PS4150-Sporen. Bemerkenswert ist, hellerFM4-64 Flecken ähnlich germinosome foci erscheinen sowohl in intakten und decoated PS4150 Sporen, was darauf hindeutet, dass diese helleren FM4-64 Flecken in der Clustering von Germinosomen Proteinen in der inneren Membran beteiligt sein könnte. Das Hinzufügen von Sporen zur Agarose und das Platzieren von Agarose in den Rahmen erfordert eine kontinuierliche und sorgfältige Flüssigkeitsbewegung für diese Minis-Materialien.Die Umwandlung von 3D-SIM-Rohbildern des KGB80-Germinosomen in Pseudo-Weitfeldbilder und deren Interpretation erfordert Expertenwissen über Sporenbiologie. Unser strukturiertes Beleuchtungsmikroskopieverfahren kann auf die Bildgebung von schwach endizierten Proteinen oder dim Fluoreszenz-Reportern in verschiedenen Bakterien oder anderen Bandmaterialien angewendet werden. Die Organisation des Germinosom kann nun mit Doppeletikettierungsverfahren untersucht werden, um die Kolokalisierung von Bacillus-Keimproteinen und spezifischen Membrandomänen zu bewerten.

visualization-germinosomes-inner-membrane-bacillus-subtilis

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um einzelne Zelle Verhalten verschiedener Bakterien in der Zeit mit Hilfe automatisierter Fluoreszenz-Zeitraffer-Mikroskopie zu überwachen. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien, wie die Mikroskopie-Aufnahmen zu analysieren.

Live Cell Imaging von Bacillus subtilis Und Streptococcus pneumoniae Verwendung von Automated Zeitraffer-Mikroskopie

Quelle: Figueroa, D. M., et al. Herstellung und Visualisierung von bakteriellen Sphäroplasten und Protoplasten zur Charakterisierung der antimikrobiellen Peptidlokalisierung. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Erzeugung von Protoplasten aus dem grampositiven Bakterium Bacillus megaterium.

Erzeugung von Protoplasten aus dem grampositiven Bakterium Bacillus megaterium

Quelle: Wen, J., Pasman, et. al., Visualisierung von Germinosomen und der inneren Membran in Bacillus subtilis-Sporen . J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Verwendung von strukturierter Beleuchtungsmikroskopie, um dreidimensionale Fluoreszenzbilder zu erhalten, die die Organisation von Keimproteinen innerhalb der Bakterienspore zeigen.

Visualisierung von Keimproteinen in der inneren Membran von Bakteriensporen

Hierin beschreiben wir einen kolorimetrischen Assay zum Nachweis des Vorhandenseins von reduzierenden Zuckern während der Keimung von Bakteriensporen.

Erkennen Cortex Fragmente während der bakteriellen Sporenauskeimung

Dieses Protokoll zeigt die wichtigen aufeinander folgenden Schritte erforderlich, um die Relevanz der Überwachung Vitalität Parameter und DNA-Reparaturprozesse in Bacillus Subtilis Sporen nach der Behandlung mit Niederdruckplasma Wiederbelebung durch tracking Fluoreszenz-markierten DNA-Reparatur Proteine über zeitaufgelösten konfokalen Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie.

Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie

Wir präsentieren Ihnen eine Methode zur Analyse von einzelnen Bakterienzelle Linien mit Bacillus Subtilis als Beispiel mikrofluidischen. Die Methode überwindet Mängel der traditionellen analytischen Methoden in der Mikrobiologie durch Beobachtung von Hunderten von Generationen der Zelle unter eng kontrollierbar und einheitliche Wachstumsbedingungen ermöglicht.

Einzellige mikrofluidischen Analyse von Bacillus subtilis

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Die Infektion von Caenorhabditis elegans durch den mikrosporidianen Parasiten Nematocida parisii ermöglicht es den Würmern, Nachkommen zu produzieren, die gegen denselben Erreger sehr resistent sind. Dies ist ein Beispiel für vererbte Immunität, ein wenig verstandenes epigenetisches Phänomen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Untersuchung der vererbten Immunität in einem genetisch handhabbaren Wurmmodell.

Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und Zählperlen zur Quantifizierung von Bakteriensporen, die mit Ethidiumbromid markiert sind. Die Methode ist auch effizient, um die kovalente Kopplung von Proteinen auf der Oberfläche intakter Sporen zu analysieren.

Verbesserung der Bacillus subtilis-Sporenzählung und Markierungsanalyse in der Durchflusszytometrie

Dieses Papier beschreibt die Präparation Verfahren, Instrumental-Setup, und experimentellen Bedingungen bei der optischen Abbildung von Transmembranpotential (Vm) und intrazellulären Calcium-Transienten (CAT) in intakten isolierten Langendorff perfundierten Maus Herzen.

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

Lernen Sie die Visualisierung von Germinosomen in Bacillus subtilis-Sporen mit Super-Resolution-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die präzise Lokalisierung von Keimungsrezeptorclustern und Membrandomänen.

Visualisierung von Germinosomes und die innere Membran in Bacillus Subtilis Sporen

Weitere Videos entdecken