Charakterisierung von Proteinen durch Größen-Ausschluss-Chromatographie gekoppelt an Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

SEC-MALS ist eine quantitative Methode zur Bestimmung des Molekulargewichts, der Größe und der Konformation von Makromolekülen in Lösung. Es kann Oligomere und Komplexe identifizieren und schwierige Proben wie Glykoproteine und Membranproteine charakterisieren. SEC-MALS ist eine absolute Methode.

Es beruht auf der grundlagenden Physik und hängt nicht von der Zusammenarbeit mit molekularen Standards, der Konformation des Moleküls oder der Art und Weise ab, wie wir mit dem Trennmedium interagieren. SEC-MALS kann auf viele Systeme angewendet werden, die durch Sekunden getrennt sind. Von Peptiden und kleinen Polymeren bis hin zu Proteinen, Nukleocapsideden, Polysacchariden, synthetischen Polymeren, virusähnlichen Partikeln und kleinen Viren.

Es ist wichtig zu überprüfen, ob Ihr System und Ihre Puffer die Empfehlungen des Anbieters für einen niedrigen Partikelgehalt verfehlen. Wenden Sie sich an den technischen Support-Mitarbeiter des Herstellers, um sicher zu sein. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des SEC-MALS-Systems, wie im Textprotokoll beschrieben.

Mit jedem SPS-Reagenzien einen Liter Phosphat-gepufferte Saline mit 50 bis 100 Millimolar-Natriumchlorid zubereiten. Filtern Sie den Puffer auf 0,1 Mikron mit einem abgefüllten Polyether-Zellschaumfilter oder ähnlichem. Filtern Sie die ersten 50 bis 100 Milliliter Puffer in eine Abfallflasche, um die Partikel aus den Trockenfiltern zu entfernen.

Filtern Sie dann den Rest in eine saubere, sterile Flasche, die zuvor mit gefiltertem, entionisiertem Wasser gewaschen und aufbewahrt wurde, um das Eindringen von Staub zu verhindern. Spülen Sie die Säule über Nacht mit einer Durchflussrate von 0,5 Milliliterpro Minute, um die Spalte im Puffer auszudemt und Partikel zu entfernen. Verwenden Sie den kontinuierlichen Durchflussmodus des FPLC und stellen Sie sicher, dass der Durchfluss erst beendet wird, wenn alle SEC-MALS-Läufe abgeschlossen sind.

Platzieren Sie die DRI-Durchflusszelle während der Nachtspülung im Spülmodus. Wenn Sie die Spülung beginnen, fahren Sie nach und nach die Durchflussrate an, um zu verhindern, dass die Spalte abwirft, verursacht durch eine plötzliche Druckänderung in der Säule. Deaktivieren Sie die Bereinigung, bevor Sie mit dem Beispiellauf beginnen.

Überprüfen Sie die Sauberkeit des Systems, indem Sie leicht auf die Schläuche nach der Säule tippen, um akkumulierte Partikel freizusetzen. Beobachten Sie das Signal im 90-Grad-Detektor auf der Frontplatte des MALS-Instruments. Stellen Sie sicher, dass das Peak-to-Peak-Rauschen nicht mehr als 50-100 Mikrovolt beträgt.

Stellen Sie außerdem sicher, dass der Brechungsindex oder das RI-Signal stabil auf weniger als 1 mal zehn bis die minus sieben Brechungsindexeinheiten stabil ist. Führen Sie eine LeereInjektion durch, um zu überprüfen, ob der Injektor von Partikeln gereinigt ist. Ein Rohling ist einfach der Laufpuffer, der in einer frischen, sterilen Durchstechflasche zubereitet wird.

Wenn der Partikelspitzenwert nicht mehr als einen Milliliter Volumen und nicht mehr als fünf Millivolt über der Ausgangsbasis liegt, ist das System für Proben bereit. Andernfalls führen Sie zusätzliche Leerinjektionen bis zur Reinigung durch oder führen Sie Wartungsarbeiten durch, um den Injektor zu reinigen. Bereiten Sie nun mindestens 200 Mikroliter BSA bei ein bis zwei Milligramm pro Milliliter im SCC-Puffer vor.

Filtern Sie das Protein mit einem Spritzenspitzenfilter auf 02 Mikrometer. Entsorgen Sie die ersten Tropfen Filtrat, um Partikel aus den Trockenen filtern zu entfernen. Alternativ zentrifugieren Sie die Probe 10.000 mal G für fünfzehn Minuten, um die Ausfällung von nicht löslichen Aggregaten und anderen großen Partikeln zu ermöglichen.

Dann 100 Mikroliter der BSA-Lösung in die Schleife injizieren. Öffnen Sie neue Experimente von der Methode im MALS-Softwaremenü. Wählen Sie dann die Online-Methode aus dem Ordner "Light Scattering System Methods" aus.

Wenn ein DLS-Detektor vorhanden ist, wählen Sie die Online-Methode aus der Lichtstreuung mit dem QELS-Ordner aus. Legen Sie die Parameter des Beispiels und der mobilen Phase im Konfigurationsabschnitt fest. Legen Sie in der generischen Pumpenansicht den Durchfluss auf den im FPLC verwendeten Kurs fest.

Navigieren Sie dann zur generischen Pumpenansicht, zum Lösungsmittelzweig, zum Namensfeld, und wählen Sie PBS aus. Geben Sie in der Injektoransicht den Namen als BSA ein. Legen Sie dn/dc auf 0,185, A2 auf 0 und den UV-Aussterbekoeffizienten auf 0,667 Milliliter pro Milligramm Zentimeter fest.

Wählen Sie im Abschnitt Prozeduren, der grundlegenden Auflistungsansicht, das Kontrollkästchentrigger bei der automatischen Injektion aus. Legen Sie die Dauer des Durchlaufs auf 70 Minuten fest, sodass Daten für die gesamte Anspielung gesammelt werden, bis das gesamte Permeationsvolumen der SEC-Spalte erreicht ist. Starten Sie das Experiment in der MALS-Software, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken.

Es beginnt, die Daten zu lesen, nachdem es das Impulssignal vom FPLC-Instrument über den MALS-Detektor empfangen hat. Null das DRI-Signal, indem Sie auf die Auto-Null-Taste auf der Vorderseite des Instruments klicken. Arbeiten Sie in der FPLC-Software, navigieren Sie zu manuellen Anweisungen, führen Sie manuelle Anweisungen aus, setzen Sie markierung, und fügen Sie den Namen des Proteins und den Lauf ein.

Schalten Sie das Einspritzventil von der manuellen Last auf injizieren, unter Strömungsweg, Einspritzventil. Fügen Sie ein Impulssignal ein, indem Sie einen 0,5-Sekunden-Impuls unter dem IO-Box-Impuls digital aussetzen. Dadurch wird die Datenerfassung in der MALS-Software ausgelöst.

Injizieren Sie nun die Probe in die Schleife. Klicken Sie in der FPLC-Software auf Ausführen, um den Experimentlauf zu starten. Führen Sie die Analyse Schritt für Schritt im Abschnitt Prozeduren in der MALS-Software durch.

Stellen Sie sicher, dass Spitzen in UV, MALS und RI bei ungefähr demselben Anspielungsvolumen angezeigt werden, indem Sie die grundlegende Auflistungsansicht überprüfen. Definieren Sie in der Basisansicht die Basislinie für alle Signale. Definieren Sie in der Spitzenansicht die zu analysierenden Spitzen, indem Sie mit der Maus klicken und ziehen.

Wählen Sie die zentralen 50 % jedes Peaks aus. Wählen Sie zuerst die Monomerspitze und dann die Dimer-Spitze aus. Überprüfen Sie unter jedem Peak die korrekten Werte von dn/dc und den Aussterbekoeffizienten bei 280 Nanometern für BSA.

Wählen Sie in den Prozeduren Ausrichtungsansicht den zentralen Bereich der Spitzen aus, indem Sie auf die Maus klicken und sie ziehen. Klicken Sie auf Signale ausrichten, und dann in Ordnung. Wählen Sie in den Prozeduren, Bandbreitenerweiterungsansicht, die zentrale 50% der Monomerspitze.

Stellen Sie sicher, dass der Brechungsindexdetektor als Referenzinstrument angegeben ist. Klicken Sie dann auf Passform durchführen, und wenden Sie die Sendesignale für UV und Licht an das Brechungsindexsignal an. Zoomen Sie in die Spitzen, um zu überprüfen, ob sie sich sehr eng innerhalb der zentralen 50 bis 70% überlappen, und klicken Sie dann auf "Okay".

Wählen Sie in den Prozeduren, der Normalisierungsansicht, Peak 1 aus. Geben Sie 3,0 Nanometer als RG-Wert ein, klicken Sie auf Normalisieren, und klicken Sie dann auf "OKAY". Zeigen Sie das Diagramm der Ergebnisse in der EASI-Diagrammansicht an.

Wählen Sie die Molmasse aus der Anzeige-Drop-down am oberen Rand des Fensters. Verwenden Sie Steuerelement, Klicken und Ziehen, um in den Spitzenbereich zu zoomen. Um die endgültigen tabellarischen molaren Massenergebnisse für die Monomer- und Dimerspitzen anzuzeigen, navigieren Sie zu Spitzenergebnissen, Molarenmassenmomenten, MW, und wählen Sie die Ergebnisse aus, berichten Sie zu einer Zusammenfassung.

Reinheit wird unter Spitzenergebnissen, Massenfraktion berichtet. Wählen Sie im Dateimenü speichern als Methode aus, und speichern Sie die analysierten BSA-Daten als Standardmethode für zukünftige Messungen aller Proteinarten. Die für BSA ermittelten Normalisierungs- und Banderweiterungsparameter werden in der Analyse übernommen.

Hier sind SEC-MALS-Analysen von BSA mit einer 200 Angstrom Porengrößenausschlussspalte dargestellt. Chromatogrammspuren werden bis zur Monomerspitze normalisiert und aus Gründen der Übersichtlichkeit versetzt. Es werden häufige Artefakte, die ignoriert werden können, wie ein Partikelspitzen in der Nähe des Anfangs des Lichtstreusignals, sowie Salz- und gelöste Luftspitzen in der Nähe des gesamten Permeationsvolumens im Brechungsindexsignal hervorgehoben.

Das Chromatogramm weist eine hervorragende Monomer-Dimer-Trimer-Trennung auf, und das Lichtstreusignal weist ein hohes Rauschensignal auf. Die monomeren und dimer Gewichts-Durchschnitts-Molarenmassenwerte weisen eine hohe Homogenität auf. Hier sind Beispiele für minderwertige SEC-MALS-Analysen.

In diesem Beispiel führt eine unzureichende Trennung an einer 75 Angstrom Porengrößenausschlussspalte zu einem Partikelspitzen zwischen acht und neun Minuten, der nicht gut von den Proteinen getrennt ist. Hier gibt es ein unzureichendes Signal-Rausch-Verhältnis, und umfangreiche Partikel neben den Proteinen sind im Lichtstreusignal sichtbar. Die Schlüssel zu guten SEC-MALS-Ergebnissen sind die Auswahl einer geeigneten Spalte, um sicherzustellen, dass das System mit geringem Lichtstreuungsrauschen kalibriert wird, und vorfiltern oder zentrifugieren der Proben, um Partikel zu entfernen.

Nach SEC-MALS können Proteinproben weiter auf Bindungsaffinität, Bioliza, Oberflächenplasmonresonanz, isothermale Titrationskalorimetrie, Biolerid-Phorometrie, mikroskalige Thermophorese oder Kompositionsgradient, Mehrwinkel-Lichtstreuung analysiert werden. Die Proteinstruktur kann durch Röntgenkristallographie, Kryo-Elektronen-Miscroskopie oder NMR bestimmt werden.