Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität im Interlamellar Hippocampus CA1 durch elektrophysiologische Feldaufzeichnung
11. August 2019
Wir verwendeten Aufnahme- und Stimulationselektroden in Längs-Hippocampus-Gehirnscheiben und längs positionierten Aufnahme- und Stimulationselektroden im dorsalen Hippocampus in vivo, um extrazelluläre postsynaptische Potenziale zu evozieren und langfristige synaptische Plastizität entlang des Längsinterlamellars CA1.
Langfristige synaptische Plastizität, insbesondere Langzeitpotenzierung und Langzeitdepression wurden entlang der Querorientierung des Hippocampus umfassend untersucht. Es wurde auch entlang der Längsausrichtung betrachtet. Wenn es jedoch um die Längsausrichtung geht, wurde der Längsachse CA1 des Hippocampus in Bezug auf die synaptische Plastizität nur sehr wenig Aufmerksamkeit geschenkt.
Eine frühere Veröffentlichung aus unserem Labor hat gezeigt, dass die CA1-Pyramidenneuronen des Hippocampus Assoziationsverbindungen bilden, die synaptische Plastizität unterstützen könnten. Für ein weiteres Verständnis dieses Protokolls wird empfohlen, dass Sie sich auf die vorherige Veröffentlichung mit der unten angegebenen Referenz beziehen. Injizieren Sie Urethan, um die Maus zu anästhesieren.
Legen Sie die voll beeinte Maus auf ein Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Tragen Sie Augengel auf, um die Augen zu befeuchten. Fixieren Sie den Schädel der Maus fest mit der Augenklemme.
Die Augenklemme gibt dem Experimentator bei chirurgischen Eingriffen die Freiheit der Beweglichkeit. Und es kann besonders nützlich sein für Experimente mit dem auditiven Kortex, sowie. Es muss jedoch sehr darauf geachtet werden, die genauen stereotaxic-Koordinaten zu erhalten.
Trennen Sie das subkutane Gewebe und die Muskeln am Ende des interparietalen und okzipitalen Knochens der Maus mit dem Skalpell. Die Dura-Materie mit Wattestäbchen trocknen lassen. Dann punktieren Sie die Zisterne magna, um die Zerebrospinalflüssigkeit zu entleeren.
Befestigen Sie einen Wattestäbchen, um die Zerebrospinalflüssigkeit weiter zu entleeren. Schneiden und entfernen Sie die Haut auf der Kopfhaut und halten Sie die exponierte Region trocken. Markieren Sie die Punkte, die der Hippocampusregion entsprechen, mit Hilfe eines Veniyar-Sättels.
Machen Sie einen Schnitt im Schädel über der dorsalen Region des Hippocampus entlang der markierten Punkte mit einem Skalpell oder Hochgeschwindigkeitsbohrer während der Beobachtung unter dem Mikroskop. Halten Sie das exponierte Hirngewebe feucht, indem Sie physiologische Kochsalzung oder ein inertes Öl anwenden. Fixieren und positionieren Sie die Stimulations- und Aufnahmeelektroden fest im Stereotaxienhalter.
Passen Sie die Stimulations- und Aufzeichnungselektroden über dem ca1 dorsalen Hippocampus an. Verwenden Sie das Maushirn in stereotaxic-Koordinate als Leitfaden bei der Suche nach der Koordinate für dorsale Längs-CA1-Hippocampus-Region. Für Aufnahmen mit Mehrkanalelektroden lokalisieren Sie zuerst Ihre stereotaxic Koordinaten für die CA1 Hippocampusregion mit dem ersten Kanal.
Positionieren Sie die verbleibenden Elektroden so, dass der Stimulations- und Aufnahmewinkel im Bereich von 30 Grad bis 60 Grad im Verhältnis zur Mittellinie vom Bregmapunkt liegt. Dieser Winkel entspricht der Längsausrichtung der Hippocampusregion CA1. Schalten Sie das Aufzeichnungssystem ein.
Öffnen Sie die neuronale Software für die Aufzeichnung und Datenerfassung. Senken Sie die Aufnahme- und Stimulationselektroden langsam mit dem Mikromanipulator, bis er nur die Oberfläche des Gehirns berührt. Beobachten Sie eine Erhöhung der Impedanz, wenn die Elektrode die Gehirnoberfläche berührt.
Dies kann im roten Kanal auf dem Bildschirm beobachtet werden. Senken Sie die Elektroden langsam auf die ungefähre Tiefe, die den gewählten stereotaxic-Koordinaten für den CA1-Hippocampus entspricht. Geben Sie Stimulation, bis ein stabiles evoziertes exzitatorisches postsynaptisches Potenzial beobachtet wird.
Führen Sie eine Input-Output-Kurve aus, um die maximale Stimulusintensität zu erkennen. Verwenden Sie die Eingangs-Output-Kurve, um die Ausgangsintensität und die Stimulusintensität für die Evokierung von Hochfrequenzstimulation oder Niederfrequenzstimulation festzulegen. Zeichnen Sie das lokale volle Potenzial für eine Stunde nach Hochfrequenzstimulation oder Niederfrequenzstimulation auf.
Exportieren Sie Daten und analysieren Sie mit Software der Wahl. Schlechte 400 ml bereits vorbereitete Schneidlösung in einen separaten Kolben und Sauerstoffat für ca. 20 Minuten. Schlechte 200 ml der sauerstoffhaltigen Schneidlösung.
In Parafolie abdecken und ca. 20 Minuten in einen 80-Grad-Gefrierschrank transferieren, um einen Schlamm zu machen. Die restlichen 200 ml Schneidlösung in einer Hirnscheiben-Haltekammer arm und in Wasserbot von 32 Grad Celsius mit kontinuierlichem Sprudeln aufbewahren. Chili-Slicing-Lösung und schlecht ca. 50 ml in einem Becher.
Enthaupten Sie die anästhesierte Maus. Schneiden Sie die Haut, die den Schädel der Maus bedeckt und schneiden Sie das Schädelstück entlang der Mittellinie zum Okzipitalknochen. Öffnen Sie den Schädel mit stumpfer Zange.
Das Gehirn vorsichtig mit einem Spachtel aushöhlen und in die gekühlte Schneidlösung in den Becher legen. Trennen Sie die beiden Gehirnhälften entlang der Mittellinie mit einer Skalpellklinge. Isolieren Sie den Hippocampus, indem Sie ihn sanft mit einem Spachtel vom Kortex lösen.
Schneiden Sie das septale und zeitliche Ende des isolierten Hippocampus aus. Tragen Sie eine kleine Menge Kleber auf die Schneidplatte auf. Bei Längs-CA1-Hippocampus-Scheibe den CA3-Bereich des Hippocampus mit dem Kleber an der Schneidplatte befestigen.
Bei Querscheiben, die als Kontrolle dienen, befestigen Sie das ventrale Ende des Hippocampus an der Schneidplatte des Vibratome. Legen Sie es in die Schneidkammer. Legen Sie die Vibratome-Parameter fest.
Schneiden Sie den beigefügten Hippocampus mit dem Vibratome. Eine gute Längs-CA1-Hippocampus-Gehirnscheibe hat eine CA1-Schicht und zwei Schichten dentate Gyrus. Außerdem werden die Schichten oriens und die Schicht radiatum der CA1-Region vorhanden sein.
Alternativ wird eine transversale Hippocampus-Gehirnscheibe die Dentat-Gyrus-Regionen CA3 und CA1 im Takt haben. Übertragen Sie die Gehirnscheiben auf die Gehirnscheibe Haltekammer im Wasserbot. 20 Minuten bei einer Temperatur von 32 Grad Celsius inkubieren und zur Erholung auf Raumtemperatur bringen.
Den ACS-Serf mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute kontinuierlich in die Aufnahmekammer überziehen. Übertragen Sie die Gehirnscheibe in die Aufnahmekammer, passen Sie die Position der Gehirnscheibe mit stumpfer Zange an und halten Sie sie mit einem Hap an Ort und Stelle. Schalten Sie die Software für die Datenerfassung ein.
Längshirnscheibe. Positionieren Sie bei Längsschnitten die Stimulations- und Aufnahmeelektrode in den Schichten. Platzieren Sie die Stimulationselektrode entweder auf der septalen oder zeitlichen Seite der Gehirnscheibe mit Aufnahme aus derselben Schicht.
Alternativ positionieren Sie die Stimulations- und Aufnahmeelektrode im Stratum radiatum, platzieren Sie die Stimulationselektrode entweder in der septalen oder zeitlichen Seite der Hirnscheibe. Positionieren Sie bei Querscheiben als Steuerung die Stimulationselektrode auf dem CA3 Schaffer-Kollateralwegbereich und die Aufnahmeelektrode im CA1-Bereich. Schalten Sie den Isolator-Stimulusgenerator ein und geben Sie Stimulation.
Passen Sie die Aufnahmeelektrodentiefe an, bis ein stabiler evozitationsevoktiones postsynaptisch gefülltes Potential beobachtet wird. Führen Sie eine Input-Output-Kurve aus, um die maximale Stimulusintensität zu erkennen. Verwenden Sie die Eingangs-Ausgangs-Kurve, um die Stimulusintensität für die Basisaufzeichnung festzulegen, die eine hochfrequente Stimulation oder eine Niederfrequenzstimulation hervorruft.
Siehe die beigefügte PDF für Parameter bei der Induktion von einsamer Potenzierung oder Langzeitdepression. Evokiertes exzitatorisches postsynaptisches Potenzial erhöhte sich als Reaktion auf die Hochfrequenzstimulation in vivo. Dies zeigt, dass Längshippocampus CA1 eine langfristige Potenzierung unterstützt.
Bei Längs-Hippocampus-CA1-Gehirnscheiben wurde eine Zunahme der Reaktion auf hochfrequente Stimulation sowohl auf der septalen als auch auf der zeitlichen Seite von Stratum-Oriens und Stratum radiatum beobachtet. Dies zeigt, dass die synaptische Plastizität, die entlang der Längs-Hippocampus-CA1-Region induziert wird, nicht linear oder richtungsspezifisch ist. Mit bereits etablierten Protokollen für Langzeitdepressionen wurde keine Langzeitdepression sowohl in vivo als auch in vitro induziert.
Als Fazit haben wir Ihnen gezeigt, wie Sie die langfristige synaptische Plastizität in der Längshippocampus-Region CA1 sowohl in vivo als auch in vitro untersuchen können. Weitere Details zum Protokoll finden Sie in der PDF-Datei zu diesem Video, um Sie bei der Untersuchung der langfristigen synaptischen Plastizität entlang der Längs-Hippocampus-Region CA1 in Ihren eigenen Labors zu unterstützen.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die langfristige synaptische Plastizität entlang der Längsachse des CA1-Areals des Hippocampus unter Verwendung longitudinaler Gehirnschnitte und in-vivo-Ableitungen. Die Untersuchung konzentriert sich darauf, extrazelluläre postsynaptische Potentiale aufzuklären, um synaptische Veränderungen zu verstehen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Elektrophysiologie
- synaptische Plastizität
Hintergrund
- Langzeit-synaptische Plastizität ist entscheidend für Lernen und Gedächtnis.
- Bisherige Studien konzentrierten sich hauptsächlich auf die transversale Orientierung des Hippocampus.
- Begrenzte Forschung hat sich auf die longitudinale CA1-Synapsenplastizität konzentriert.
- Assoziative Verbindungen von CA1-Pyramidenneuronen könnten die Plastizität unterstützen.
Zweck der Studie
- Untersuchung der synaptischen Plastizität entlang der longitudinalen Achse der CA1-Region.
- Untersuchung der Auslösung extrazellulärer postsynaptischer Potentiale in vivo.
- Vertiefung des Verständnisses der Mechanismen, die synaptischen Veränderungen zugrunde liegen.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendete longitudinale hippocampale Hirnschnitte und In-vivo-Aufzeichnungen.
- Die Mäuse wurden mit Urethan für die experimentellen Verfahren anästhesiert.
- Die Elektroden wurden mithilfe stereotaktischer Koordinaten sorgfältig positioniert, um Daten zu erfassen.
- Es kamen Hoch- und Niedrigfrequenz-Stimulationsprotokolle für die Aufzeichnungen zum Einsatz.
- Die Daten wurden mit neuronaler Software zur Analyse von Wellenformen und Potentialen ausgewertet.
Hauptergebnisse
- Stabile evozierte exzitatorische postsynaptische Potentiale wurden registriert.
- Die Studie validierte Mechanismen langfristiger synaptischer Veränderungen entlang der longitudinalen CA1-Achse.
- Elektrophysiologische Ableitungen zeigen eine signifikante synaptische Aktivität während der Stimulation.
- Input-Output-Kurven demonstrierten die Fähigkeit variierender Reizintensitäten, verstärkte synaptische Antworten hervorzurufen.
Schlussfolgerungen
- Diese Forschung beleuchtet die bisher wenig erforschte longitudinale synaptische Plastizität von CA1-Neuronen.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf das Verständnis neuronaler Mechanismen beim Lernen und Gedächtnis.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Studien zur Untersuchung synaptischer Dynamik und Plastizität beeinflussen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der longitudinalen synaptischen Plastizität in hippocampalen CA1-Netzwerken liefert mechanistische Einblicke in die Funktion neuronaler Schaltkreise, die für die Validierung zentralnervöser Zielstrukturen relevant sind. Diese Arbeit schließt eine Lücke in querschnittlich ausgerichteten Modellen, indem sie die assoziative CA1-CA1-Konnektivität charakterisiert und damit zur Entschärfung von Hypothesen beiträgt, die hippocampusabhängige kognitive Prozesse betreffen. Der bidirektionale elektrophysiologische Ansatz ermöglicht die Beurteilung der Zielstrukturenbindung und der Pfadmodulation in krankheitsrelevanten Systemen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen, die langgestreckte Hippocampus-Schaltkreise und NMDA-Rezeptor-abhängige Plastizitätsmechanismen betreffen.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielstruktur-Validierung durch schicht- und richtungsspezifische elektrophysiologische Messungen in intakten Netzwerken.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem er LTP-fähige von LTD-defizienten Netzwerkzuständen in präklinischen Modellen unterscheidet.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte longitudinale Hippocampus-Schnitte für reproduzierbare extrazelluläre Feldpotenzialmessungen vor.
- Quantitative Ausgabe: Erzeugt stabile evozierte exzitatorische postsynaptische Potenziale, die für Dosis-Wirkungs- und Frequenzstimulationsprofile geeignet sind.
- Plattformnutzung: Standardisierte Schnittpräparation und Elektrodenplatzierung ermöglichen vergleichbare Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg und die longitudinale Datenauswertung.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Korreliert mit hippocampal-abhängigen kognitiven Bereichen in Modellen neuropsychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen.
- Mechanistische Kontinuität: Verbindet Plastizitätsassays in der Entdeckungsphase mit der präklinischen Validierung zielgerichteter synaptischer Effekte.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Das Fehlen einer LTD in interlamellarem CA1 leitet die Auswahl von Biomarkern und Go/No-Go-Kriterien für die Screening von Modulatoren ein.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein, indem sie elektrophysiologische Nachweise für synaptische Modulation in einem krankheitsrelevanten hippocampalen Subsystem liefert.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft Hypothesen zur longitudinalen Aktivierung der CA1-Pathway und zur Abhängigkeit von NMDA-Rezeptoren mithilfe von Input-Output-Kurven und LTP-Induktion.
- Screening: Erstellt standardisierte Feldpotential-Auslesungen, die den Vergleich von Substanzwirkungen entlang der septo-temporalen Achse ermöglichen.
- Analytik: Zu den Ergebnissen zählen die LTP-Größe, Stimulationsschwellen und das Fehlen von LTD – quantitative Metriken zur Beurteilung der Zielmodulation.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, da die mikrozirkuläre Organisation des CA1 und die Abhängigkeit von NMDA-Rezeptoren über verschiedene Spezies hinweg konserviert sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur longitudinalen Untersuchung des Hippocampus, die über die Anwendung in Einzelstudien hinausgeht.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unklarheiten in der longitudinalen Signalübertragung des Hippocampus aufgeklärt werden.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte und reproduzierbare Protokolle für in-vivo- und in-vitro-Feldaufnahmen mit definierten Kriterien für die Elektrodenplatzierung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem LTP-fähige Netzwerke identifiziert und falsch-negative Ergebnisse bei screeningspezifischen Untersuchungen zur Plastizität reduziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen basierend auf bidirektionalen Plastizitätsprofilen in krankheitsrelevanten Systemen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in stereotaktischer Chirurgie, hippocampaler Anatomie und Interpretation elektrophysiologischer Signale.
- Hängt von stabilen Aufzeichnungssystemen, Mikromanipulatoren und Software ab, die in der Lage ist, Input-Output-Kurven zu generieren und LTP/LTD zu induzieren.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg bezüglich der Schnittrichtung, Stimulationsparameter und Dauer der Basislinienaufzeichnung voraus.
- Die Übertragung auf andere Modelle erfordert die Validierung der longitudinalen Homologie des CA1-Bereichs und des Erhalts der assoziativen Konnektivität.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die technische Empfindlichkeit gegenüber dem Elektrodenwinkel (30–60 Grad zur Mittellinie) und der Abfluss von Zerebrospinalflüssigkeit während der in-vivo-Präparation.
