Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen
May 31st, 2020
Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.
Dieses Protokoll erleichtert die Identifizierung und Isolierung lebender Korallenzellpopulationen auf einer Beschreibungsebene, die bisher nicht möglich war. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Zugriff auf eine Ebene der Zellspezifität ermöglicht, die bisher meist unerreichbar war. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Shannon Saigh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter der gemeinsam genutzten Ressource der Durchflusszytometrie am Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Um das Durchflusszytometer für die Sortierung von lebenden Korallenzellen einzurichten, öffnen Sie eine neue Projektvorlage in der Durchflusszytometer-Software und wählen Sie die entsprechenden Laser für die Analyse im Laserpanel aus. Erstellen Sie dann ein Seitenstreuungs- oder Vorwärtsstreudiagramm in den entsprechenden Plots zum Einrichten der Gating- und Analysestrategie. Für die zytometrische Analyse und Sortierung der lebenden Korallenzellen laden Sie die Kontrollzelle unbefleckte Zellprobe in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang.
Da Korallenzellen besonders zerbrechlich sind, halten Sie den Zytometerdruck niedrig, um eine Zelllyse zu verhindern. Passen Sie im Streudiagramm die Fotomultiplikatorspannung an, um die Punkte zu zentrieren, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Erstellen Sie im nach vorne gegen seitlichen Streudiagramm ein Tor um die Zellen um die 10 bis 4. Markierung auf der vorwärts streuenden x-Achse.
Ersetzen Sie die Kontrollprobe durch die erste Probe von gebeizten Zellen, und zeichnen Sie vor dem Anhalten etwa 10 000 Zellen auf. Dann richten Sie die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind. Um lebende Korallenzellen zu sortieren, legen Sie nach der Auswahl der Zellpopulation, die für die Durchflusszytometer-Software von Interesse ist, ein Mikrozentrifugenrohr mit 250 bis 500 Mikrolitern der entsprechenden Sammellösung in die Zytometer-Sammlungskammer für jede zu sortierende Population.
Sobald eine angemessene Zeit vergangen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Population, um irgendwo von 10.000 bis mehrere Millionen Zellen zu sammeln. Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, sortieren Sie mindestens 20.000 von Interesse sindde Zellen in 500 Mikroliter Färbemedium, damit eine Reinheitsprüfung auf der Interessenpopulation durchgeführt werden kann, und analysieren Sie die sortierten Zellen neu, um zu bestätigen, dass die Ereignisse innerhalb des Für die anfängliche Sortierung verwendeten Tores gelesen werden. Für In-vitro-Studien lagern Sie die sortierten Zellen auf Eis, bis sie in einen Inkubator oder eine sterilisierte Umgebung übertragen werden.
Um andere nichtzelluläre Partikel einzubauen, die nicht die gleiche Form oder Granularität wie die Korallenzellen haben, können Sie aus der Analyse entfernt werden, indem eine Torauswahl auf einem vorwärts- und seitlichen Streudiagramm erstellt wird. Die abgestorbenen Zellen können ausgeschlossen werden, indem das DAPI-Signal der ungefärbten und gefärbten Zellsuspensionen mit einem Histogramm verglichen und die hohen DAPI-exemitten Zellen ausgegoben werden. Parallel dazu können Zellen, die Autofluoreszenzsymbiodenesie ausrichten, durch Gating gegen Zellen mit dem hohen Signal im weit roten Kanal entfernt werden.
Nach diesem iterativen Gating-Prozess stellen die verbleibenden Zellen die intakten lebenden Korallenzellpopulationen ohne Symbiodenasie dar. Diese Zellen können dann in verschiedene Zellsubpopulationen eingeteilt werden, indem Sie Merkmale wie die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies und/oder den Lysomgehalt färben. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass einige Zellen zerbrechlicher sind als andere, und diesen Prozess so sorgfältig wie möglich durchzuführen.
Sobald bestimmte Zellen isoliert wurden, können sie für x-vivo-Funktionstests wie das Aufstellen von Zellkulturen und das Erstellen von transkriptomischen Profilen verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie befasst sich mit dem Bedarf an einem besseren Verständnis von Korallenzellen, die für die Biodiversität in marinen Ökosystemen entscheidend sind. Die Autoren präsentieren ein neuartiges Protokoll für die Isolierung und Markierung von Steinkorallen-Zellpopulationen und erreichen dabei ein beispielloses Maß an Zellspezifität.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Korallenbiologie
- Zellinisolierungstechniken
- Biodiversität des Ökosystems
Hintergrund
- Korallen bilden wesentliche Ökosysteme für das marine Leben.
- Das aktuelle Wissen über die Funktionen von Korallenzellen ist begrenzt.
- Die Isolierung spezifischer Korallenzellpopulationen ist für weitere Forschung von entscheidender Bedeutung.
Verwendete Methoden
- Durchflusszytometrie für die Sortierung lebender Zellen
- Steinkoralle als Modellorganismus
- Gating-Strategie zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zelltypen
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Sortierung lebender Korallenzellpopulationen.
- Sichert die Reinheit und Lebensfähigkeit sortierter Zellen für zukünftige Assays.
- Erleichtert die Untersuchung von Subpopulationen und deren Funktionen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie präsentiert eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Korallenzellen und verbessert das Forschungspotenzial.
- Die Erkenntnisse liefern wertvolle Einblicke in die Korallenbiologie und die Gesundheit der Ökosysteme.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from complex tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and mechanistic de-risking. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables high-resolution cellular interrogation, supporting predictive confidence in pathway-specific responses. This capability is directly applicable to biopharma discovery workflows requiring precise functional assays and transcriptomic profiling of rare or fragile cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses at single-cell resolution by isolating live populations for functional validation.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating viable cell subpopulations from debris, dead cells, and symbiont-associated signals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating purified inputs for downstream assays that clarify target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell suspensions suitable for reproducible functional assays and dose-response profiling.
- Operational Value: Establishes gating strategies that ensure assay readiness and minimize variability across experimental runs.
- Scalability: Allows collection of sufficient cell numbers (10,000 to several million) for multi-well screening and omics applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by enabling consistent isolation of disease-relevant cell populations for mechanistic follow-up.
- Biomarker Alignment: Facilitates staining for stress-response markers (e.g., reactive oxygen species, lysosome content) to correlate cellular phenotypes with functional outcomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Purified populations improve data reliability in preclinical models, reducing false positives from heterogeneous samples.
Pipeline & Workflow Integration
FACS integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by enabling precise cellular inputs at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating live coral (or analogous mammalian) cell populations for pathway-specific functional interrogation.
- Screening: Delivers standardized, gated cell populations that enhance assay reproducibility and quantitative readout reliability.
- Analytics: Generates high-purity samples enabling accurate transcriptomic, proteomic, or metabolic profiling to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation through consistent preparation of viable, stress-responsive cell subsets.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability across projects requiring subcellular resolution, independent of model system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing noise from non-target cells and enabling mechanistic de-risking of targets.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible gating, low-pressure sorting, and viability-preserving collection methods.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing cleaner biological data, reducing late-stage failure risk from flawed target assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through reliable subpopulation-specific data that informs advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry setup, including laser selection, voltage optimization, and scatter plot gating for fragile cells.
- Dependent on instrumentation capable of low-pressure sorting and multi-parameter detection (forward/side scatter, fluorescence channels).
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols, collection media, and gating thresholds to ensure reproducibility.
- Must account for variability in cell fragility across species or conditions, requiring iterative optimization of shear stress and staining duration.
- Limited by sample preparation quality; enzymatic or mechanical dissociation must preserve epitope integrity and cell viability for accurate sorting.
