Name: Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung lebender Korallenzellen mit hoher Spezifität. Diese Methode ermöglicht präzise funktionelle Analysen und trägt zum Verständnis mariner Ökosysteme bei.

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NTK möchte die University of Miami Research Awards in Natural Sciences and Engineering für die Finanzierung dieser Forschung würdigen. Der BR dankt Alex und Ann Lauterbach für die Finanzierung des Comparative and Evolutionary Immunology Laboratory. Die Arbeit des BR wurde von der Israel Science Foundation (ISF) Unterstützt: 1416/19 und 2841/19, und HFSP Research Grant, RGY0085/2019. Wir danken Zhanna Kozhekbaeva und Mike Connelly für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei der University of Miami, der Flow Cytometry Shared Resource der Miller School of Medicine am Sylvester Comprehensive Cancer Center für den Zugang zum FACS-Zytometer und Shannon Saigh für technische Unterstützung bedanken.

1. Trennung von Geweben vom Korallenskelett über Airbrush und Kompressor
HINWEIS: Führen Sie Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.
<ol><li>Montieren Sie den Airbrush-Kit, indem Sie den Luftkompressor, den Schlauch und die Airbrush anschließen (Abbildung 2). Stellen Sie das Manometer zwischen 276-483 kPa ein. HINWEIS: Der empfohlene Kompressor und Luftschlauch, der für diese Studie verwendet wurde, wurde auf einen maximalen Druck von 393 kPa voreingestellt. Die Verwendung außerhalb dieses 276-483 kPa-Bereichs kann entweder zu einer unzureichenden Zellentfernung aus dem Skelett oder zu einem Bruch der Zellmembranen führen. Dieser Bereich kann für jede Art unterschiedlich sein und kann einen Durchführbarkeitstest erfordern. Ein Durchführbarkeitstest kann mit einer Teilmenge der Zellschlämme mit einem einfachen Hämozytometer und einem 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Farbstoff-Ausschluss-Assay durchgeführt werden, der auf einem zusammengesetzten Mikroskop visualisiert wird.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 ml Zellfärbemittel in einem autoklavierten, steriler Glasbehälter durch Zugabe von 33 ml 10x phosphatgepufferter Saline (PBS; ohne Calcium und Magnesium) zu einer Endkonzentration von 3,3x, 2 ml fetalem Kalbsserum (FCS; bei 56 °C für 30 min inaktivierte Wärme) bis 2% des Gesamtvolumens und 2 ml 1 M HEPES Puffer bis zu einer Endkonzentration von 20 mM. Dann auf 100 ml mit sterilem Wasser abtopieren. HINWEIS: Die 3,3-fache PBS-Konzentration wurde gewählt, um den Salzgehalt von Meerwasser nachzuahmen, wie in Rosental et al.18gezeigt. Diese Konzentration muss für Arten, die in anderen Umgebungen gefunden werden, angepasst werden, um ihren Salzgehalt nachzuahmen.</li>
	<li>10 ml Zellfärbemittel in eine Airbrushflasche (in Abbildung 2mit "F" ) übertragen und den Adapterdeckel für den Airbrush-Anschluss befestigen. HINWEIS: Größere Fragmente und Arten mit dickeren Gewebeschichten erfordern möglicherweise mehr Medien für eine angemessene Gewebeentfernung.</li>
	<li>Für die hier gezeigten verzweigten Korallenarten verwenden Sie einen Knochenschneider, um ein Korallenfragment mit einer Länge von etwa 3 x 5 cm oder einer Fläche von 4cm2 zu beschneiden oder zu schneiden. HINWEIS: Das Fragment muss frei von Makroalgen und anderen mehrzelligen Organismen sein, da diese nicht aus der nachgelagerten Probe entfernt werden dürfen und die Probe während der FACS-Analyse- und Sortierprozesse kontaminieren. Ein 1 cm großes Fragment von P. damicornis ergibt nach dem Filtern, Färben und Waschen ca. 2x10 x 106 Zellen.</li>
	<li>Legen Sie das Korallenfragment in eine Plastiksammeltasche und sprühen Sie mit der Airbrush die Zellfärbungsmedien auf die Koralle (Abbildung 2). Setzen Sie diesen Prozess fort, bis der größte Teil des Skeletts freigelegt ist. Entfernen Sie das restliche Skelett aus der Sammeltasche.</li>
</ol>2. Dissoziation von Zellen aus Korallengewebe
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen.
<ol><li>Filtern Sie die Zellschlämme durch ein 40 m langes Nylonzellsieb in ein 50 ml Zentrifugenrohr, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. HINWEIS: Verschiedene Zellsieb-Netzgrößen können für verschiedene Arten besser geeignet sein. Größere Größen können jedoch aufgrund von Schmutz und Zellklumpen zu einer unzureichenden Gewebedissoziation führen.<ol>
<li>Für Proben mit dickeren Schleimschichten verwenden Sie den sterilisierten Kolben einer 1 ml Kunststoffspritze und schleifen Sie ihn vorsichtig gegen den Filter, um Klumpen aufzubrechen und den Zellen zu helfen, das Sieb zu passieren. Spülen Sie bäuern und kolben mit Zellfärbemedien in das Zentrifugenrohr.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 450 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml Zellfärbungsmedien wieder auf.</li>
</ol>3. Zellfärbung
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis aus und schützen Sie die Hände mit Handschuhen. Flecken, die in diesem Protokoll enthalten sind, dienen der Darstellung. Alternative Flecken erfordern unterschiedliche Konzentrationen und Inkubationszeiten.
<ol><li>Übertragen Sie 500 l resuspendierte Zellen in ein 5 ml Rundbodenrohr und legen Sie sie als Kontrollprobe beiseite. Fügen Sie diesem Aliquot keinen Fleck hinzu.</li>
	<li>Zur verbleibenden Zellsuspension 0,42 l 12 mM DAPI-Lebensfähigkeitsfarbstoff (Materialtabelle), 1 L mit 5 M reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)(Materialtabelle)und 0,1 l mit 0,2 m Lysosom-Färbung(Materialtabelle)hinzufügen. Pipette gut zu mischen und inkubieren auf Eis für 30 min im Dunkeln, um Photobleichmittel zu verhindern. HINWEIS: DAPI wird in diesem Beispiel verwendet, um als DNA-Färbung und Lebensfähigkeitsfarbstoff für das Differentialgating abgestorbener Zellen auf der FACS-Maschine zu arbeiten. Dies setzt voraus, dass DAPI sterbende Zellen aufgrund der Membranintegrität durchdringt. Der ROS-Fleck strahlt Licht im Bereich von 520 nm (grün) aus, während der lysosomale Marker Licht bei ca. 668 nm (rot) aussendet.</li>
	<li>Pellet 500 l der gefärbten Zellen durch Zentrifugation bei 4 °C bei 450 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 l Zellfärbungsmedien wieder auf. Auf ein neues 5 ml Rundbodenrohr übertragen und auf Eis lagern.</li>
</ol>4. FACS-Start
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers aufgrund von Unterschieden in den Lasern und Kanälen variieren. Für dieses Protokoll wurde ein Zytometer mit 405, 488, 535 und 640 nm Wellenlängenlasern verwendet. Filter, die in diesem Protokoll enthalten sind, dienen der Darstellung. Alternative Zellflecken können einen anderen Satz von Filtern und Lasern erfordern.
<ol><li>Beginnen Sie mit dem Erstellen einer neuen Projektvorlage für die Sortiersoftware, und wählen Sie das Laserpanel aus. Wählen Sie für die dargestellte Kombination von Flecken und natürlicher Fluoreszenz alle vier Laser (405, 488, 535 und 640 nm) aus.</li>
	<li>Wählen Sie die entsprechenden Filter für jede erwartete Farbe aus, die im Experiment dargestellt wird.<ol>
<li>Um die DAPI-Emission zu erkennen und bei der Trennung von lebenden und abgestorbenen Zellen zu helfen, verwenden Sie einen Filter mit einem Bandpass (BP) von 450/50 (425-475 nm Bereich) wie z. B. einen DAPI-, Hoeschst- oder Pacific Blue-Filter.</li>
		<li>Verwenden Sie für die Detektion von Licht, das durch das grüne ROS-Signal emittiert wird, einen Filter mit einem BP von 530/30 (Wellenlängenbereich von 515-545 nm) wie z. B. einen Fluoresceinisothiocyanat(FITC) oder einen grünen Fluoreszenzproteinfilter (GFP). Dieser Filter misst die Konzentration von ROS in jeder Zelle.</li>
		<li>Fügen Sie einen zusätzlichen Filter mit einem BP von 670/30 (655-685 nm Bereich) wie einem Allophycocyanin (APC) Filter zur Detektion der lysosomalen Fleckenemission hinzu. HINWEIS: Der APC-Kanal ermöglicht die Messung der phagozytischen Aktivität. Dieser Kanal wird auch die Autofluoreszenz erkennen, die von den Korallensymbiotischen Algen aus der Familie Symbiodiniaceae erzeugt wird. Dieses Signal kann jedoch über einen zusätzlichen Kanal getrennt werden, der eine längere Wellenlänge als der APC-Filter hat.</li>
		<li>Schließen Sie einen Filter mit einem BP von 780/60 (750-810 nm Bereich) ein, wie z. B. den am häufigsten verwendeten Phycoerythrin, Cyaninfilter (APC-Cy7), der die Emission von weit-roter Autofluoreszenz von Symbiodiniaceae erkennt und bei der Isolierung von aposymbiotischen Zellen hilft.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACS-Gating-Setup
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und des Erfassungsprogramms in Verbindung mit dem Zytometer variieren.
<ol><li>Erstellen Sie auf dem Projekt-Experimentalbildschirm der Zytometrie-Software ein Streudiagramm und wählen Sie Vorwärtsstreuung (FORWARD Scatter, FCS) als Metrik für die X-Achse und die Seitenstreuung (SSC) für die Y-Achse aus. HINWEIS: FCS korreliert mit der Größe der Zelle und SSC korreliert mit Granularität. Dies ermöglicht die Entfernung der meisten Trümmer, da die meisten kleiner sein werden als intakte Zellen.</li>
	<li>Legen Sie die Achsen auf logarithmische oder biexponentielle Skalen fest, da Die Zellgröße und Die Granularität um mehrere Größenordnungen variieren können(Abbildung 3A), insbesondere bei Korallen.</li>
</ol>6. FACS-Analyse und Zellisolierung
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und dem gekoppelten Erfassungsprogramm variieren.
<ol><li>Legen Sie die Steuerung (d. h. die unbefleckte Zelluntermenge) in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang. Wenn der Computer beginnt, Daten von jeder Zelle oder jedem Ereignis zu empfangen, werden Punkte im Streudiagramm angezeigt. Um die in den Zytometerkammern von früheren Experimenten zurückgelassenen Trümmer zu beseitigen, lassen Sie etwa 30 s passieren, bevor Sie mit der Analyse beginnen.</li>
	<li>Passen Sie im Streudiagramm die Photomultiplier-Rohrspannung (PMT) an, um die Punkte zu zentrieren. HINWEIS: Die PMT-Spannung wird verwendet, um die Signalstärke der gemessenen Photonen zu verstärken; Wenn die PMT-Spannung zu schwach ist, werden weniger Zellen gelesen, und wenn die PMT-Spannung zu stark ist, werden Zellen in der Nähe des Maximalwerts gemessen und verschiedene Zelltypen sind nicht voneinander zu unterscheiden. Eine ausreichende PMT-Spannung stellt sicher, dass unabhängig voneinander unterscheidbare Ereignisse das Streudiagramm auffüllen. Die Ereignistrennung ist durch das Projizieren logarithmischer oder biexponentiver Skalen auf FSC- und SSC-Streudiagramme einfacher zu visualisieren.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Um das Beispiel zu erhalten, halten Sie die Datenerfassung an, nachdem etwa 15.000 Ereignisse gelesen wurden. In den meisten Fällen ist dies ausreichend, um die gesamten Zellpopulationsmuster zu visualisieren. Zeichnen Sie weitere Ereignisse auf, wenn kleine, spezialisierte Zellpopulationen analysiert und isoliert werden.</li>
	<li>Erstellen Sie im ersten Diagramm von FSC und SSC eine Auswahl oder ein Tor der Zellen um die 102-Markierung und höher auf der FSC-X-Achse. Alles, was unter dieser Schwelle liegt, ist wahrscheinlich zellulärer Schutt. Zeichnen Sie rechteckige Tore, was eine regelmäßige Option auf Durchflusszytometrie-Softwareprogramme und gut für klare, unterschiedliche Zellpopulationen ist. Verwenden Sie für Zellpopulationen, die eine unregelmäßigere Form in den Streudiagrammen annehmen, eine polygonale Gating-Option. HINWEIS: Eine minimale Abschaltung von 102 auf der vorderen Streuung sollte für die kleinsten Korallenzellen ausgewählt werden, kann aber eine Kontamination von Schmutz ermöglichen. Um dies zu ändern, erhöhen Sie die untere Grenze der Gating, um konservativer zu sein.</li>
	<li>Erstellen Sie ein neues Streudiagramm, das den DAPI-Filter auf der X-Achse und den APC-Cy7-Filter auf der Y-Achse ausdrückt. Wählen Sie dazu das Tor für intakte Zellen aus, die in Schritt 6.4 erstellt wurden, mit der rechten Maustaste, und wählen Sie die Option zum Erstellen eines neuen Streudiagramms aus. Passen Sie die Achsen entweder an logarithmische oder biexponentielle Skalen an. HINWEIS: Die Schritte, die zum Erstellen eines neuen Plots erforderlich sind, können je nach Softwareprogramm variieren.</li>
	<li>Entfernen Sie nun die Kontrollprobe aus der Zytometerkammer und ersetzen Sie sie durch die gebeizten Zellen. Lassen Sie 30 s passieren, bevor Sie mit der Analyse beginnen und die Daten aufzeichnen. Zeichnen Sie etwa 15.000 Zellen auf, bevor Sie anhalten. HINWEIS: Die unterschiedlichen Populationen am oberen Ende der APC-Cy7-Skala sind solche mit hoher roter Autofluoreszenz von Symbiodiniaceae. Es ist kein Fleck erforderlich, um diese Bevölkerungsbrüche zu visualisieren, und sie können auch auf der Kontrollstichprobenaufzeichnung angezeigt werden (Abbildung 3C). Wählen Sie für die Korallenpopulationen, die niedriger auf der Y-Achse, für eine weitere Differenzierung.</li>
	<li>Erstellen Sie ein neues Streudiagramm der aposymbiotischen Zellen, um die ROS-Konzentrationen (FITC-Filter) und die Zellen positiv auf Lysosomen (APC-Filter) zu visualisieren, wobei wiederum logarithmische oder biexponentielle Skalen verwendet werden. ANMERKUNG: Wenn es mehrere verschiedene Zellpopulationen gibt, die aposymbiotisch sind, kann jede in ihrem eigenen Streudiagramm weiter unterschieden werden (Abbildung 3C,D).</li>
	<li>Vergleichen Sie die gebeizte Stichprobengruppe mit der steuerelemente, nicht befleckte Teilmenge, indem Sie entweder die erste Aufzeichnung der Kontrollprobe verwenden oder die Kontrollgruppe erneut einfügen und erneut ausführen. Gate die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind.</li>
</ol>7. FACS Sortierung und Sammlung
HINWEIS: Die Schritte können je nach Herstellung und Modell des Zytometers und des Erfassungsprogramms in Verbindung mit dem Zytometer variieren.
<ol><li>Mit einer Auswahl von Zellen, die zum Sammeln ausgewählt wurden, legen Sie Mikrozentrifugenröhren (mit 250 bis 500 L Zellkulturmedien oder Lysepuffer basierend auf der Anzahl der gesammelten Zellen und der Methode der Lagerung) in die Zytometer-Sammlungskammer. HINWEIS: Das dargestellte Durchflusszytometer ist in der Lage, vier verschiedene Populationen gleichzeitig zu sortieren, und die Maschine kann so konfiguriert werden, dass sie eine Vielzahl von Sammelgeräten, einschließlich verschiedener Zentrifugenrohre und 96 Brunnenplatten, aufnehmen kann.</li>
	<li>Sobald das Zytometer beginnt, die Probe zu lesen und eine angemessene Zeit verstrichen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Populationen und sammeln sie überall von 20.000 Zellen bis zu mehreren Millionen.<ol>
<li>Passen Sie bei mehr als 500.000 Zellen die Lautstärke der Zellkulturmedien oder des Lysepuffers und die Lautstärke des Sammelgeräts an.</li>
		<li>Für In-vitro-Studien speichern Sie Zellen auf Eis, bis sie in einem Inkubator oder einer sterilisierten Umgebung platziert werden.</li>
		<li>Für molekulare Studien beginnen Sie entweder sofort den DNA/RNA/Protein-Isolationsprozess oder blitzen sie ein und lagern bei -80 °C bis zur Extraktion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, führen Sie eine Reinheitsprüfung der Interessenpopulation durch, indem sie mindestens 20.000 von Interesse bewarbige Zellen in 500 l Färbemedien sortieren, dann die sortierten Zellen erneut analysieren und bestätigen, dass die Zellen innerhalb des Tores gelesen werden, das zum ersten Sortieren verwendet wurde (Abbildung 4).</li>
</ol>

<ol><li>Bellwood, D. R., Hughes, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional-scale+assembly+rules+and+biodiversity+of+coral+reefs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regional-scale assembly rules and biodiversity of coral reefs.</a> Science. 292 (5521), 1532-1535 (2001).</li>
<li>Ferrario, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effectiveness+of+coral+reefs+for+coastal+hazard+risk+reduction+and+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The effectiveness of coral reefs for coastal hazard risk reduction and adaptation.</a> Nature Communications. 5 (3794), 1-9 (2014).</li>
<li>Wegley, L., Edwards, R., Rodriguez-Brito, B., Liu, H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+analysis+of+the+microbial+community+associated+with+the+coral+Porites+astreoides%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metagenomic analysis of the microbial community associated with the coral Porites astreoides.</a> Environmental Microbiology. 9 (11), 2707-2719 (2007).</li>
<li>Gates, R. D., Bahdasarian, G., Muscatine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+stress+causes+host+cell+detachment+in+symbiotic+cnidarians%3A+implications+for+coral+bleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Temperature stress causes host cell detachment in symbiotic cnidarians: implications for coral bleaching.</a> Biological Bulletin. 182 (3), 324-332 (1992).</li>
<li>Lesser, M. P., Bythell, J. C., Gates, R. D., Johnstone, R. W., Hoegh-Guldberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+infectious+diseases+really+killing+corals%3F+Alternative+interpretations+of+the+experimental+and+ecological+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+Biology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Are infectious diseases really killing corals? Alternative interpretations of the experimental and ecological data.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 346 (1), 36-44 (2007).</li>
<li>Miller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+disease+following+massive+bleaching+in+2005+causes+60%25+decline+in+coral+cover+on+reefs+in+the+US+Virgin+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Coral disease following massive bleaching in 2005 causes 60% decline in coral cover on reefs in the US Virgin Islands.</a> Coral Reefs. 28 (4), 925-937 (2009).</li>
<li>Hoegh-Guldberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+reefs+under+rapid+climate+change+and+ocean+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coral reefs under rapid climate change and ocean acidification.</a> Science. 318 (5857), 1737-1742 (2007).</li>
<li>Berkelmans, R., Van Oppen, M. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+zooxanthellae+in+the+thermal+tolerance+of+corals%3A+A+%22nugget+of+hope%22+for+coral+reefs+in+an+era+of+climate+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: A "nugget of hope" for coral reefs in an era of climate change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1599), 2305-2312 (2006).</li>
<li>Cunning, R., Silverstein, R. N., Baker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+causes+and+consequences+of+symbiont+shuffling+in+a+multi-partner+reef+coral+symbiosis+under+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Investigating the causes and consequences of symbiont shuffling in a multi-partner reef coral symbiosis under environmental change.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1809), 1-8 (2015).</li>
<li>Peters, E. C. Anatomy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+EC+%22Diseases+of+Coral%22">Diseases of Coral</a>. Woodley, C. M., et al. , Wiley Blackwell. Boston, MA. 85-107 (2015).</li>
<li>Allemand, D., Tambutté, É, Zoccola, D., Tambutté, S. Coral calcification, cells to reefs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllemand%2C+D+%22Coral+Reefs%3A+An+Ecosystem+in+Transition%22">Coral Reefs: An Ecosystem in Transition</a>. Dubinsky, Z., Stambler, N. , Springer Netherlands. Dordrecht, Netherlands. 119-150 (2011).</li>
<li>Rinkevich, B., Loya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Reproduction+of+the+Red+Sea+Coral+Stylophora+pistillata.+I.+Gonads+and+Planulae%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Ecology+Progress+Series%22%5BJournal%5D)">The Reproduction of the Red Sea Coral Stylophora pistillata. I. Gonads and Planulae.</a> Marine Ecology Progress Series. 1 (2), 133-144 (2007).</li>
<li>Palmer, C. V., Traylor-Knowles, N. G., Willis, B. L., Bythell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corals+use+similar+immune+cells+and+wound-healing+processes+as+those+of+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Corals use similar immune cells and wound-healing processes as those of higher organisms.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23992(2011).</li>
<li>Hayes, R. L., Bush, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+observations+of+recovery+in+the+reef-building+scleractinian+coral%2C+Montastrea+annularis%2C+after+bleaching+on+a+Cayman+reef%5BTitle%5D)+AND+%22Coral+Reefs%22%5BJournal%5D)">Microscopic observations of recovery in the reef-building scleractinian coral, Montastrea annularis, after bleaching on a Cayman reef.</a> Coral Reefs. 8 (4), 203-209 (1990).</li>
<li>Chapman, D. M. Cnidarian Histology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChapman%2C+DM+%22Coelenterate+Biology%22">Coelenterate Biology</a>. Muscatine, L., Lenhoff, H. M. , Academic Press. New York, NY. 1-43 (1974).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Rose, N. H., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+specificity+of+gene+expression+in+the+response+to+heat+stress+in+corals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell specificity of gene expression in the response to heat stress in corals.</a> The Journal of Experimental Biology. 220 (10), 1837-1845 (2017).</li>
<li>Traylor-Knowles, N., Palumbi, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+environmental+biology%3A+Cell+biology+informing+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Translational environmental biology: Cell biology informing conservation.</a> Trends in Cell Biology. 24 (5), 265-267 (2014).</li>
<li>Rosental, B., Kozhekbaeva, Z., Fernhoff, N., Tsai, J. M., Traylor-Knowles, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coral+cell+separation+and+isolation+by+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coral cell separation and isolation by fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> BMC Cell Biology. 18 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Rosental, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+mammalian-like+haematopoietic+system+found+in+a+colonial+chordate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex mammalian-like haematopoietic system found in a colonial chordate.</a> Nature. 564 (7736), 425-429 (2018).</li>
<li>Silva-Lima, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Symbiodinium+Strains+Are+Hosted+by+the+Brazilian+Endemic+Corals+Mussismilia+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Multiple Symbiodinium Strains Are Hosted by the Brazilian Endemic Corals Mussismilia spp.</a> Microbial Ecology. 70 (2), 301-310 (2015).</li>
<li>Yvan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+enumeration+of+bacterial+in+the+coral+surface+mucus+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric enumeration of bacterial in the coral surface mucus layer.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 16-19 (2016).</li>
<li>Lee, C. S., Wilson Yeo, Y. S., Sin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching+response+of+Symbiodinium+%28zooxanthellae%29%3A+Determination+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bleaching response of Symbiodinium (zooxanthellae): Determination by flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (10), 888-895 (2012).</li>
<li>Baumgarten, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+Aiptasia%2C+a+sea+anemone+model+for+coral+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (38), 11893-11898 (2015).</li>
<li>Voolstra, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+genomes+of+Stylophora+pistillata+and+Acropora+digitifera+provides+evidence+for+extensive+differences+between+species+of+corals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the genomes of Stylophora pistillata and Acropora digitifera provides evidence for extensive differences between species of corals.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Pavlov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+control+of+tuna+fins%3A+A+role+for+the+lymphatic+system+in+vertebrate+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hydraulic control of tuna fins: A role for the lymphatic system in vertebrate locomotion.</a> Science. 357 (6348), 310-314 (2017).</li>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Dieses Protokoll wurde von Rosental et al.18 adaptiert und zur Identifizierung und Isolierung von P. damicornis Zellen entwickelt. Die Methodik konzentriert sich auf den Prozess der Filterung von Proben, um Trümmer, nicht lebensfähige Zellen und Symbiodiniaceae-gehostete Zellen durch die Untersuchung von zellinintrinen Faktoren, einschließlich der relativen Zellgröße, der relativen Zellgranularität, der Zellautofluoreszenz und des Vorhandenseins intakter Zellmembranen, zu entfernen. Diese...

Korallenriffe sind eines der wichtigsten Ökosysteme der Erde. Sie erleichtern die biologische Vielfalt, indem sie kritische Lebensräume für Fische und wirbellose Tiere schaffen, und sind von entscheidender Bedeutung für die Erhaltung anthropogener Gemeinschaften durch die Bereitstellung von Nahrungsmitteln und wirtschaftlicher Existenzgrundlage durch Den Tourismus1. Als wichtiger Erbauer von Korallenriffen unterstützt das Korallentier (Phylum: Cnidaria) auch Küstengemeinden, indem es große Kalziumkarbonatgerüste schafft, die Wellen- und Sturmschäden mildern2.
Korallen als Erwachsene sind sessile Tiere, die eine breite Palette von endosymbiotischen Partnern beherbergen, einschließlich Viren, Archaeen, Bakterien, Protisten, Pilze, und vor allem, Mitglieder der Algendinoflagellate Familie Symbiodiniaceae3. Veränderungen in der Umwelt können zu Ungleichgewichten in dieser Gemeinschaft führen, die oft zu Krankheitsausbrüchen und Korallenbleiche führen, bei denen die symbiotischen Symbiodiniaceae aus der Korallenkolonie vertrieben werden, wodurch die Hauptnahrungsquelle für die Korallen beseitigt wird. Beide Szenarien führen oft zum Tod des Korallenwirts4,5,6. Die Auswirkungen anthropogen-induzierter Stressoren, wie der schnelle Klimawandel, beschleunigen die Massensterben von Korallen, was zu einem globalen Rückgang der Korallenriffe führt7.
In jüngster Zeit wurden viele verschiedene Methoden entwickelt, um den Verlust von Korallenriffen zu mildern. Diese Methoden umfassen die Auspflanzung von Korallen auf bestehenden Riffen, genetische Kreuzung enthäute Genotypen und zelluläre Manipulation der mikrobiellen und symbiotischen Gemeinschaften, die innerhalb derKorallen8,9gehostet werden. Trotz dieser Bemühungen, viel bleibt unbekannt über Korallenzellvielfalt und Zellfunktion10,11,12,13. Ein gründliches Verständnis der Vielfalt und Zellfunktion von Korallenzellen ist notwendig, um zu verstehen, wie sich der Korallenorganismus unter normativen und stressigen Bedingungen verhält. Die Bemühungen, die Wiederherstellungs- und Konservierungseffizienz zu maximieren, werden von einem verbesserten Verständnis der Kopplung von Zellvielfalt und Genfunktion profitieren.
Frühere Arbeiten über Zellvielfalt und Funktion konzentrierten sich in erster Linie auf histologische Studien und Ganzgewebe-RNA-Sampling14,15,16,17. Um mehr Details über die spezifische Zelltypfunktion in Korallen zu erhalten, muss es Methoden für die Isolierung bestimmter Populationen lebender Korallenzellen geben. Dies wurde bei nichtklassischen Modellorganismen mit Hilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortiertechnologie (FACS) erfolgreich durchgeführt18. FACS verwendet eine Kombination von Lasern, die auf unterschiedliche Wellenlängen abgestimmt sind, um verschiedene endogene zelluläre Eigenschaften auf Einzelzellebene zu messen, wie z. B. relative Zellgröße, Zellgranularität und Autofluoreszenz. Zusätzlich können die Zellen durch fluoreszierend markierte Verbindungen gekennzeichnet werden, um spezifische, gewünschte Eigenschaften18,19zu messen.
Bisher war die Anwendung der Durchflusszytometrie auf Korallenzellen hauptsächlich für die Analyse symbiotischer Symbiodiniaceae und anderer Bakterienpopulationen unter Verwendung ihrer starken, natürlichen Autofluoreszenz20,21,22. FACS wurde auch verwendet, um die Größe des Korallengenoms zu schätzen, indem das fluoreszierende DNA-Markersignal im Vergleich zu den Zellen des Referenzmodellorganismus23,24verwendet wurde. Die effiziente Anwendung von FACS bietet drei verschiedene Werkzeuge, die für zellbiologische Studien nützlich sind: 1) morphologische und funktionelle Beschreibung einzelner Zellen; 2) Identifizierung, Trennung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen für nachgelagerte Studien; und 3) die Analyse von funktionellen Assays auf Einzelzellebene.
Die Entwicklung und Anwendung verschiedener exogener Fluoreszenzmarker für die Untersuchung von Korallenzellen bleibt nahezu unerforscht. Solche Marker können markierte Proteine, markierte Substrate für Enzyme oder fluoreszierende Reaktionen auf andere Verbindungen umfassen. Diese Marker können verwendet werden, um Zelltypen zu identifizieren, die eindeutige Eigenschaften aufweisen, z. B. das Hervorheben von Zellen, die unterschiedliche Mengen eines bestimmten Zellkompartiment-Features erzeugen, z. B. Lysosomen. Ein weiteres Beispiel ist die Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten Perlen zur funktionellen Identifizierung von Zellen, die für die Phagozytose zuständig sind, oder die Verschleierung eines gezielten Erregers25. Populationen von Zellen, die in Immunitätsreaktionen aktiv sind, können von FACS leicht identifiziert werden, nachdem diese exogen aufgetragenen Perlen verschlungen wurden. Während traditionelle histologische Methoden konserviertes Gewebe und viele Stunden benötigen, um den Prozentsatz der Zellen, die positiv für die Perlenverschlangen sind, anzunähern, kann ein FACS-basierter funktioneller Test für die Pathogeneinschließung relativ schnell an isolierten lebenden Zellen durchgeführt werden. Neben der Untersuchung zellspezifischer Reaktionen auf Stress hat diese Technologie das Potenzial, die genspezifische Expression zu klären und die Evolutions- und Entwicklungsgeschichte von Zelltypen zu beleuchten, die für Cnidarier völlig einzigartig sind, wie Calicoblasten und Cnidozyten.
Kürzlich führten wir ein intensives Screening von über 30 zellulären Markern durch, das zur Identifizierung von 24, die Korallenzellen kennzeichnen können, führte, von denen 16 nützlich sind, um einzigartige Populationen18zu unterscheiden, was sie zu Differenzierungsclustern (CD) macht. Hier beschreiben wir den Prozess der Korallenzellisolierung in Pocillopora damicornis von der Entfernung von Zellen aus dem Calciumcarbonat-Skelett bis zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zellpopulationen mit FACS (Abbildung 1).

<table><tbody><tr><td>Airbrush Set & Kompressor</td><td>TCP Global</td><td>ABD KIT-H-SET</td><td>Paasche H-Serie Single-Action Siphon Feed Airbrush Kit mit Master TC-20 Kompressor & Luftschlauch</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Knochenschneider</td><td>Bulk Reef Supply</td><td>205357</td><td>Oceans Wonders Coral Stony Bone Cutter</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>40 um; BD Falke; einzeln verpackt; keimfrei; Nylon</td></tr><tr><td>CellRox Green</td><td>Life Technologies</td><td>C10444</td><td>2,5 mM in DMSO; Anregung/Emission: 485/520 nm</td></tr><tr><td>Auffangbeutel</td><td>Grainger</td><td>38UV35</td><td>Reloc Zippit 6"L x 4"W Standard Wiederverschließbarer Polybeutel mit Reißverschluss, transparent; 2 mil Dicke</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>10mg in H2O; Anregung/Emission: 358/461 nm</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-100ML</td><td>Hitzeinaktiviert bei 57 &de; C für 30 Minuten</td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line Hämazytometer</td></tr><tr><td>HEPES Puffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Life Technologies</td><td>L12492</td><td>1mM in DMSO; Absorption/Emission: 647/668 nm</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>1,7 mL</td></tr><tr><td>Phophat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>pH 7,4; 10X</td></tr><tr><td>Röhrchen mit rundem Boden</td><td>VWR</td><td>352063</td><td>5 mL Polypropylen-Rundboden-Röhrchenspritze</td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 mL BD Luer-Lok Spritze steril, Einweg-Polycarbonat</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz-aktivierte zellsortierung zur isolierung von skleractin-zellpopulationen

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Korallenriffe sind durch anthropogene Stressoren bedroht. Die biologische Reaktion der Korallen auf diese Stressoren kann auf zellulärer Ebene auftreten, aber die Mechanismen sind nicht gut verstanden. Um die Reaktion von Korallen auf Stressoren zu untersuchen, benötigen wir Werkzeuge zur Analyse zellulärer Reaktionen. Insbesondere brauchen wir Werkzeuge, die die Anwendung von funktionellen Assays erleichtern, um besser zu verstehen, wie Zellpopulationen auf Stress reagieren. In der aktuellen Studie verwenden wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um verschiedene Zellpopulationen in Steinkorallen zu isolieren und zu trennen. Dieses Protokoll umfasst: (1) die Trennung von Korallengeweben vom Skelett, (2) die Schaffung einer Einzelzellsuspension, (3) die Kennzeichnung der Korallenzellen mit verschiedenen Markern für die Durchflusszytometrie sowie (4) Gating- und Zellsortierstrategien. Diese Methode wird es Forschern ermöglichen, auf zellulärer Ebene an Korallen für Analysen, funktionelle Assays und Genexpressionsstudien verschiedener Zellpopulationen zu arbeiten.

Insgesamt ist dieses Protokoll nützlich, da es die Identifizierung und Sammlung von lebenden Korallenzellpopulationen erleichtert, die für funktionelle Analysen verwendet werden können. Der Arbeitsablauf begann mit der mechanischen Trennung von Korallengeweben vom darunter liegenden Calciumcarbonatskelett (Abbildung 1). Dies ist einer der wichtigsten ersten Schritte, da unsachgemäße Technik zu einer hohen Zellsterblichkeit führt und große Mengen an Schutt ver...

Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...

Dieses Protokoll erleichtert die Identifizierung und Isolierung lebender Korallenzellpopulationen auf einer Beschreibungsebene, die bisher nicht möglich war. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Zugriff auf eine Ebene der Zellspezifität ermöglicht, die bisher meist unerreichbar war. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Shannon Saigh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter der gemeinsam genutzten Ressource der Durchflusszytometrie am Sylvester Comprehensive Cancer Center.Um das Durchflusszytometer für die Sortierung von lebenden Korallenzellen einzurichten, öffnen Sie eine neue Projektvorlage in der Durchflusszytometer-Software und wählen Sie die entsprechenden Laser für die Analyse im Laserpanel aus. Erstellen Sie dann ein Seitenstreuungs- oder Vorwärtsstreudiagramm in den entsprechenden Plots zum Einrichten der Gating- und Analysestrategie. Für die zytometrische Analyse und Sortierung der lebenden Korallenzellen laden Sie die Kontrollzelle unbefleckte Zellprobe in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang.Da Korallenzellen besonders zerbrechlich sind, halten Sie den Zytometerdruck niedrig, um eine Zelllyse zu verhindern. Passen Sie im Streudiagramm die Fotomultiplikatorspannung an, um die Punkte zu zentrieren, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Erstellen Sie im nach vorne gegen seitlichen Streudiagramm ein Tor um die Zellen um die 10 bis 4. Markierung auf der vorwärts streuenden x-Achse.Ersetzen Sie die Kontrollprobe durch die erste Probe von gebeizten Zellen, und zeichnen Sie vor dem Anhalten etwa 10 000 Zellen auf. Dann richten Sie die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind. Um lebende Korallenzellen zu sortieren, legen Sie nach der Auswahl der Zellpopulation, die für die Durchflusszytometer-Software von Interesse ist, ein Mikrozentrifugenrohr mit 250 bis 500 Mikrolitern der entsprechenden Sammellösung in die Zytometer-Sammlungskammer für jede zu sortierende Population.Sobald eine angemessene Zeit vergangen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Population, um irgendwo von 10.000 bis mehrere Millionen Zellen zu sammeln. Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, sortieren Sie mindestens 20.000 von Interesse sindde Zellen in 500 Mikroliter Färbemedium, damit eine Reinheitsprüfung auf der Interessenpopulation durchgeführt werden kann, und analysieren Sie die sortierten Zellen neu, um zu bestätigen, dass die Ereignisse innerhalb des Für die anfängliche Sortierung verwendeten Tores gelesen werden. Für In-vitro-Studien lagern Sie die sortierten Zellen auf Eis, bis sie in einen Inkubator oder eine sterilisierte Umgebung übertragen werden.Um andere nichtzelluläre Partikel einzubauen, die nicht die gleiche Form oder Granularität wie die Korallenzellen haben, können Sie aus der Analyse entfernt werden, indem eine Torauswahl auf einem vorwärts- und seitlichen Streudiagramm erstellt wird. Die abgestorbenen Zellen können ausgeschlossen werden, indem das DAPI-Signal der ungefärbten und gefärbten Zellsuspensionen mit einem Histogramm verglichen und die hohen DAPI-exemitten Zellen ausgegoben werden. Parallel dazu können Zellen, die Autofluoreszenzsymbiodenesie ausrichten, durch Gating gegen Zellen mit dem hohen Signal im weit roten Kanal entfernt werden.Nach diesem iterativen Gating-Prozess stellen die verbleibenden Zellen die intakten lebenden Korallenzellpopulationen ohne Symbiodenasie dar. Diese Zellen können dann in verschiedene Zellsubpopulationen eingeteilt werden, indem Sie Merkmale wie die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies und/oder den Lysomgehalt färben. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass einige Zellen zerbrechlicher sind als andere, und diesen Prozess so sorgfältig wie möglich durchzuführen.Sobald bestimmte Zellen isoliert wurden, können sie für x-vivo-Funktionstests wie das Aufstellen von Zellkulturen und das Erstellen von transkriptomischen Profilen verwendet werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein Verfahren zur Isolierung von spezifischen Zelltypen aus pflanzlichem Material nachgewiesen ist. Diese Technik bedient sich transgene Marker exprimieren fluoreszierenden Proteinen in bestimmten Zelltypen, Zell-Dissoziation und Fluorescence Activated Cell Sorting. Zusätzlich wird ein Wachstum Setup hier erleichtert Behandlung von...

Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Das Ziel des Protokolls ist es, lymphatische Endothelzellen menschlicher Lymphmissbildung zystenartige Gefäße und Vorhaut mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden. Anschließende Zellkultur und Expansion dieser Zellen ermöglicht eine neue Stufe der experimentellen Raffinesse für genetische, Proteomik, funktionale und Zelldifferenzierung Studien.

Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung einzelner Zellen aus Zebrafischembryonen, zur Anreicherung von Zellen von Interesse, zum Einfangen von Zebrafischzellen in mikrofluidisch basierten Einzelzell-Multiplexsystemen und zur Bewertung der Genexpression von einzelnen Zellen.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Dieses Protokoll beschreibt die anpassbare Oberflächenfunktionalisierung des Desthiobiotin-, Streptavidin- und APTES-Systems, um bestimmte Zelltypen von Interesse zu isolieren. Darüber hinaus behandelt dieses Manuskript die Anwendungen, die Optimierung und die Verifizierung dieses Prozesses.

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Die genaue Identifizierung von fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) und Muskelstammzellen (MuSCs) ist entscheidend für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Dieses Protokoll enthält Richtlinien für die Isolierung, Reinigung und Kultur von FAPs und MuSCs aus erwachsenen Mausmuskeln.

FACS-Isolierung und Kultur von fibro-adipogene Vorläuferzellen und Muskelstammzellen aus ungestörten und verletzten Maus-Skelettmuskeln

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Dieses Protokoll bietet eine standardisierte Methode zur Isolierung und Anreicherung primärer Myoblasten aus adulten und neonatalen Mausskelettmuskeln durch Gewebedissoziation, sequentielle Filtration, Präplattierung und definierte Kulturbedingungen, wodurch die Etablierung und Pflege von satellitenzellbasierten Myoblastkulturen für nachgelagerte experimentelle Anwendungen ermöglicht wird.

Isolierung von Skelettmuskel-Satellitenzellen für In-vitro-Myogenese-Studien

Erfahren Sie die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung lebender Korallenzellen mit hoher Spezifität. Diese Methode ermöglicht präzise funktionelle Analysen und trägt zum Verständnis mariner Ökosysteme bei.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen

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