Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Isolierung von Skleractin-Zellpopulationen
31. Mai 2020
Korallen schaffen biodiverse Ökosysteme, die sowohl für Den Menschen als auch für Meeresorganismen wichtig sind. Allerdings verstehen wir immer noch nicht das volle Potenzial und die Funktion vieler Korallenzellen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung, Kennzeichnung und Trennung von Steinkorallenzellpopulationen vor.
Dieses Protokoll erleichtert die Identifizierung und Isolierung lebender Korallenzellpopulationen auf einer Beschreibungsebene, die bisher nicht möglich war. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Zugriff auf eine Ebene der Zellspezifität ermöglicht, die bisher meist unerreichbar war. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Shannon Saigh, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter der gemeinsam genutzten Ressource der Durchflusszytometrie am Sylvester Comprehensive Cancer Center.
Um das Durchflusszytometer für die Sortierung von lebenden Korallenzellen einzurichten, öffnen Sie eine neue Projektvorlage in der Durchflusszytometer-Software und wählen Sie die entsprechenden Laser für die Analyse im Laserpanel aus. Erstellen Sie dann ein Seitenstreuungs- oder Vorwärtsstreudiagramm in den entsprechenden Plots zum Einrichten der Gating- und Analysestrategie. Für die zytometrische Analyse und Sortierung der lebenden Korallenzellen laden Sie die Kontrollzelle unbefleckte Zellprobe in die Probenkammer des Zytometers und starten Sie den Lesevorgang.
Da Korallenzellen besonders zerbrechlich sind, halten Sie den Zytometerdruck niedrig, um eine Zelllyse zu verhindern. Passen Sie im Streudiagramm die Fotomultiplikatorspannung an, um die Punkte zu zentrieren, und beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Ereignisse. Erstellen Sie im nach vorne gegen seitlichen Streudiagramm ein Tor um die Zellen um die 10 bis 4. Markierung auf der vorwärts streuenden x-Achse.
Ersetzen Sie die Kontrollprobe durch die erste Probe von gebeizten Zellen, und zeichnen Sie vor dem Anhalten etwa 10 000 Zellen auf. Dann richten Sie die Ereignisse, die für die befleckte Probengruppe einzigartig sind. Um lebende Korallenzellen zu sortieren, legen Sie nach der Auswahl der Zellpopulation, die für die Durchflusszytometer-Software von Interesse ist, ein Mikrozentrifugenrohr mit 250 bis 500 Mikrolitern der entsprechenden Sammellösung in die Zytometer-Sammlungskammer für jede zu sortierende Population.
Sobald eine angemessene Zeit vergangen ist, um Schutt auszuspülen, beginnen Sie mit der Sortierung der gewünschten Population, um irgendwo von 10.000 bis mehrere Millionen Zellen zu sammeln. Jedes Mal, wenn ein neuer Fleck, eine neue Art oder ein Sortierer verwendet wird, sortieren Sie mindestens 20.000 von Interesse sindde Zellen in 500 Mikroliter Färbemedium, damit eine Reinheitsprüfung auf der Interessenpopulation durchgeführt werden kann, und analysieren Sie die sortierten Zellen neu, um zu bestätigen, dass die Ereignisse innerhalb des Für die anfängliche Sortierung verwendeten Tores gelesen werden. Für In-vitro-Studien lagern Sie die sortierten Zellen auf Eis, bis sie in einen Inkubator oder eine sterilisierte Umgebung übertragen werden.
Um andere nichtzelluläre Partikel einzubauen, die nicht die gleiche Form oder Granularität wie die Korallenzellen haben, können Sie aus der Analyse entfernt werden, indem eine Torauswahl auf einem vorwärts- und seitlichen Streudiagramm erstellt wird. Die abgestorbenen Zellen können ausgeschlossen werden, indem das DAPI-Signal der ungefärbten und gefärbten Zellsuspensionen mit einem Histogramm verglichen und die hohen DAPI-exemitten Zellen ausgegoben werden. Parallel dazu können Zellen, die Autofluoreszenzsymbiodenesie ausrichten, durch Gating gegen Zellen mit dem hohen Signal im weit roten Kanal entfernt werden.
Nach diesem iterativen Gating-Prozess stellen die verbleibenden Zellen die intakten lebenden Korallenzellpopulationen ohne Symbiodenasie dar. Diese Zellen können dann in verschiedene Zellsubpopulationen eingeteilt werden, indem Sie Merkmale wie die Aktivität reaktiver Sauerstoffspezies und/oder den Lysomgehalt färben. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass einige Zellen zerbrechlicher sind als andere, und diesen Prozess so sorgfältig wie möglich durchzuführen.
Sobald bestimmte Zellen isoliert wurden, können sie für x-vivo-Funktionstests wie das Aufstellen von Zellkulturen und das Erstellen von transkriptomischen Profilen verwendet werden.
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Übersicht
Diese Studie greift das Erfordernis auf, Korallenzellen besser zu verstehen, die für die Biodiversität in marinen Ökosystemen von entscheidender Bedeutung sind. Die Autoren stellen ein neuartiges Protokoll zur Isolierung und Markierung von Steinkorallen-Zellpopulationen vor, das einen bislang nicht erreichten Grad an Zellspezifität ermöglicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Forschungsbereich
- Korallenbiologie
- Techniken zur Zellisolierung
- Biodiversität von Ökosystemen
Hintergrund
- Korallen bilden essentielle Ökosysteme für das Meeresleben.
- Die derzeitigen Erkenntnisse über die Funktionen von Korallenzellen sind begrenzt.
- Die Isolierung spezifischer Korallenzellpopulationen ist für weitere Forschung unerlässlich.
Verwendete Methoden
- Durchflusszytometrie zur Sortierung lebender Zellen
- Steinkoralle als Modellorganismus
- Gating-Strategie zur Identifizierung und Isolierung spezifischer Zelltypen
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht die Identifizierung und Sortierung lebender Korallenzellpopulationen.
- Stellt die Reinheit und Vitalität der sortierten Zellen für zukünftige Assays sicher.
- Erleichtert die Untersuchung von Teilpopulationen und deren Funktionen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Korallenzellen vor und erweitert damit das Forschungspotenzial.
- Die Ergebnisse liefern wertvolle Einblicke in die Korallenbiologie und die Gesundheit von Ökosystemen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung spezifischer Zellpopulationen aus komplexen Geweben bleibt eine entscheidende Herausforderung bei der Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsstadien und der Absicherung hinsichtlich mechanistischer Risiken. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ermöglicht eine hochauflösende zelluläre Untersuchung und stützt die Vorhersagegenauigkeit bezüglich spezifischer Signalwegantworten. Diese Fähigkeit ist direkt auf Entdeckungsworkflows in der Biopharmaindustrie anwendbar, die präzise funktionelle Assays und die Transkriptomprofilierung seltener oder empfindlicher Zelltypen erfordern.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen mit Einzelzellauflösung, indem lebende Zellpopulationen für die funktionelle Validierung isoliert werden.
- Operativer Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem lebensfähige Zellsubpopulationen von Zelltrümmern, toten Zellen und Signalen assoziierter Symbionten getrennt werden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Priorisierung von Wirkstoffportfolios, indem gereinigte Probeneingaben für nachgeschaltete Assays bereitgestellt werden, die Zielinteraktion und Signalwegmodulation klären.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, vitale Zellsuspensionen, die für reproduzierbare Funktionsanalysen und Dosis-Wirkungs-Profiling geeignet sind.
- Operativer Wert: Etabliert Gating-Strategien, die die Bereitschaft für Analysen sicherstellen und die Variabilität zwischen Experimentdurchläufen minimieren.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Gewinnung ausreichender Zellzahlen (10.000 bis mehrere Millionen) für Multiplatten-Screenings und Omics-Anwendungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet Entdeckungs- und präklinische Phase, indem sie eine konsistente Isolierung krankheitsrelevanter Zellpopulationen für mechanistische Nachuntersuchungen ermöglicht.
- Biomarker-Abstimmung: Ermöglicht die Färbung für Stressreaktionsmarker (z. B. reaktive Sauerstoffspezies, Lysosomeninhalt), um zelluläre Phänotypen mit funktionellen Ergebnissen zu korrelieren.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Gereinigte Populationen verbessern die Datenzuverlässigkeit in präklinischen Modellen und verringern falsch-positive Ergebnisse durch heterogene Proben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die FACS integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Testung von Zielhypothesen über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung, indem sie präzise zelluläre Eingaben in jedem Stadium ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung lebender Korallen- (oder analoger säugetierischer) Zellpopulationen für die funktionelle Untersuchung spezifischer Signalwege.
- Screening: Stellt standardisierte, selektierte Zellpopulationen bereit, die die Reproduzierbarkeit von Assays und die Zuverlässigkeit quantitativer Messungen verbessern.
- Analytik: Erzeugt hochreine Proben, die eine genaue transkriptomische, proteomische oder metabolomische Profilierung zur Gegenüberstellung experimenteller Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die frühe Entdeckung mit der präklinischen Validierung durch die konsistente Herstellung lebensfähiger, stressreaktiver Zellsubpopulationen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Plattformfunktion über Projekte hinweg, die eine Auflösung auf subzellulärer Ebene erfordern, unabhängig vom Modellsystem.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem Störungen durch Nicht-Zielzellen reduziert und die mechanistische Absicherung von Zielstrukturen ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung durch reproduzierbare Gating-Strategien, Sortierung bei niedrigem Druck und Methoden zur Sammlung unter Erhalt der Vitalität.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung von Projekten, indem sauberere biologische Daten bereitgestellt werden, wodurch das Risiko spätzeitiger Fehlschläge aufgrund fehlerhafter Annahmen zu Zielstrukturen verringert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch zuverlässige, spezifische Daten zu Subpopulationen, die die Kriterien für die Weiterentwicklung beeinflussen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Einrichtung der Durchflusszytometrie, einschließlich der Auswahl der Laser, der Optimierung der Spannungen und der Gating-Strategie in Streudiagrammen für empfindliche Zellen.
- Setzt ein Gerät voraus, das in der Lage ist, bei niedrigem Druck zu sortieren und mehrere Parameter zu detektieren (vorwärts/rückwärts gestreutes Licht, Fluoreszenzkanäle).
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Färbeprotokolle, der Sammelmedien und der Gating-Schwellenwerte, um Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
- Muss die Variabilität der Zellfragilität zwischen Arten oder Bedingungen berücksichtigen, was eine schrittweise Optimierung von Scherkräften und Färbedauer erfordert.
- Wird durch die Qualität der Probenvorbereitung begrenzt; enzymatische oder mechanische Dissoziation muss die Epitopintegrität und Zellviabilität erhalten, um eine korrekte Sortierung zu gewährleisten.
