Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hochreine lymphatische Endothelzellen zu isolieren, die die lymphatischen Gefäße menschlicher lymphatischer Malformationen und Vorhäute auskleiden, unter Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung. Dies wird zunächst erreicht, indem eine Gewebeprobe eines Patienten enzymatisch verdaut wird. Im zweiten Schritt wird die Einzelzell-Suspension kultiviert, um die Anzahl an lymphatischen Endothelzellen anzureichern.

In der Probe werden die Zellen anschließend mit Antikörpern gegen die gewünschten Zelloberflächenmarker markiert und mittels mehrparametrischer fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert. Letztendlich können die Zellen aus dem Penisvorhautgewebe und aus lymphatischen Missbildungen, lymphatische Endothelzellen, in der Zellkultur zur weiteren downstream-Analyse vermehrt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung Zellen mit einer Reinheit von über 99 % liefert und somit Probleme vermeidet, die durch den Verlust lymphatischer Endothelzellen aufgrund einer Überwucherung durch kontaminierende Zellen entstehen. Beginnen Sie damit, ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Medium, ergänzt durch eine antibiotisch-antimykotische Lösung, abzuwiegen. Überführen Sie anschließend die lymphatische Fehlbildung oder die vier Hautproben in das Röhrchen und wiegen Sie es erneut, um das Gewicht des Gewebes zu bestimmen.

Als Nächstes überführen Sie das Gewebe und das Medium unter Verwendung steriler Pinzette und steriler Schere in einem Sicherheitswerkbank der Klasse zwei in eine 100 Millimeter große Zellkulturschale. Zerkleinern Sie das Gewebe anschließend zu Stückchen mit einer Größe von je einem Kubikmillimeter. Überführen Sie danach die Stücke in ein 50 Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern frischem Antibiotikum-Antimykotikum-Medium.

Drehen Sie das Röhrchen mehrmals vorsichtig, um das Gewebe erneut in Suspension zu bringen, und zentrifugieren Sie die Probe anschließend. Nach dem Entfernen des Überstandes geben Sie je 100 Milligramm fein geschnittenen Gewebes ein Milliliter vorgewärmte Verdauungslösung hinzu und inkubieren das Gewebe in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator unter kontinuierlichem Schütteln bei 200 U/min, um eine erfolgreiche Anreicherung der lymphatischen Endothelzellen zu erreichen. Es ist entscheidend, den Zeitpunkt zu erkennen, zu dem die Zellen ausreichend mit der Kollagenase- und Dys-Space-Reaktion behandelt wurden, damit sie die Isolierung überleben.

Dies wird durch eine sorgfältige Überwachung des Gewebeverdauungsprozesses erreicht, wobei die Reaktion beendet wird, sobald der größte Teil des Gewebes in feine Fragmente zerlegt ist. Am Ende der Inkubation überprüfen, ob nahezu das gesamte Gewebe in kleine Fragmente verdaut wurde, und die Gewebesuspension durch ein 70-Mikron-Sieb in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen filtrieren. Anschließend den Kolben einer 3-Milliliter-Spritze mit Gummipumpe verwenden, um das verbleibende Gewebe zu zerkleinern, bis nur noch geringe Reste der extrazellulären Matrix sichtbar sind.

Waschen Sie dann den Zellfilter mit einem Volumen an Endothelzellmedium, das dem Volumen des Dissoziierungsenzyms entspricht, und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Suspendieren Sie das Pellet je nach Probengröße in bis zu 20 Milliliter Endothelzellmedium. Nach der Zellzählung werden dann zwei mal 10 hoch sechs Zellen in einer 150 Quadratzentimeter-Flasche ausgesät, die zuvor mit Fibronectin beschichtet wurde, in einem Endvolumen von 20 Milliliter Endothelzellmedium für eine Übernachtkultur.

Am nächsten Morgen spülen Sie die nicht gebundenen Zellen mit drei Spülgängen PBS, ergänzt mit einer antibiotisch-antimykotischen Lösung, weg. Anschließend fügen Sie frisches Endothelzellmedium hinzu, um die Anzahl der lymphatischen Endothelzellen zu vergrößern, und inkubieren die Kultur fünf bis sieben Tage lang, bis die Kultur etwa zu 80 % konfluent ist. Um die Zellen für die Sortierung mittels mehrparametrischer fluoreszenzaktivierter Zellsortierung anzufärben.

Entfernen Sie zuerst das Zellmedium und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Geben Sie dann nach einer fünf- bis siebenminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius sieben Milliliter Detachierungslösung hinzu. Sammeln Sie die dissoziierten Zellen, inaktivieren Sie die Enzyme mit dem Dreifachen des Volumens an endothelialem Zellmedium und überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reagenzglas.

Zentrifugieren Sie die Zellen dreimal und waschen Sie das Pellet bei der zweiten und dritten Zentrifugation mit je fünf Millilitern PBS nach der letzten Waschung. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem PBS und zählen Sie die Anzahl der vitalen Zellen mittels Trypanblau-Ausschluss. Nach der Zellzählung.

Überführen Sie die Zellen aseptisch in Durchflusszytometrie-Färbungsröhrchen und pelletieren Sie die Zellen, um unspezifische Bindungen zu blockieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 5%F-B-S-P-B-S und inkubieren Sie sie 20 Minuten auf Eis. Nach der Blockierungszentrifugation entfernen Sie das Überstand und resuspendieren die Zellen erneut.

Suspendieren Sie das Pellet in CD34-, CD31-Potanin- und VEGF-Rezeptor-3-Antikörpercocktail. Nach 20 Minuten auf Eis waschen Sie die Zellen dreimal mit je zwei Millilitern FBS-PBS, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, und resuspendieren Sie. Suspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern Propidiumiodid in FBS-PBS-Lösung auf Eis.

Schließlich sortieren Sie die gereinigten humanen lymphatischen Endothelzellen mittels eines mehrparametrigen fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräts. Anschließend zentrifugieren Sie die sortierten Zellen und resuspendieren die Pellets in dem geeigneten Medium zur Zellkulturansaat. Hier werden normale humane lymphatische Gefäße sowie lymphatische Gefäßfehlbildungen dargestellt, die mit einem Antikörper gegen Podoplanin markiert wurden; beachten Sie die deutliche Dilatation und die beträchtliche Variation der Lumengröße innerhalb der lymphatischen Gefäßfehlbildungen beim Menschen.

Tatsächlich enthalten die meisten lymphatischen Missbildungen sowohl kleine oder mikrozystische als auch große oder makrozystische abnorme zystische Strukturen, und zwar nach der initialen Gewebeverdauung und 24-stündiger Kultur in den unfractionierten Proben. Zusätzlich zu den fibroblastenähnlichen Zellen und glatten Muskelzellen können nach der Sortierung und weiteren 24 Stunden in Zellkultur deutliche endotheliale Zellkolonien beobachtet werden. Die CD34-, niedrigem CD31- und VEGF-Rezeptor-3-positive Podoplanin-positive Zellen heften sich jedoch an den Kulturgefäßboden an und zeigen die typische Pflasterstein-Morphologie, die auf diesen Bildern zu sehen ist.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung die lymphatischen endothelialen Zellen, die menschliche lymphatische Missbildungen und vollständige Hautlymphgefäße auskleiden, mit hoher Reinheit isolieren kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primärem menschlichem Gewebe gefährlich sein kann, da sie infektiöse Agenzien enthalten kann, die für die menschliche Gesundheit schädlich sind. Es sollten stets Standardvorkehrungen getroffen werden, wie das Tragen von Handschuhen, Schutzbrille und Laborkittel, während dieses Verfahren durchgeführt wird.