Isolation of Human Lymphatic Endothelzellen durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochreine lymphatische Endothelzellen zu isolieren, die die Lymphgefäße von menschlichen lymphatischen Malformationen und Vorhäuten auskleiden, und zwar durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Dies geschieht zunächst durch die enzymatische Verdauung einer Gewebeprobe des Patienten. Im zweiten Schritt wird die Einzelzellsuspension kultiviert, um die Anzahl der lymphatischen Endothelzellen anzureichern.

In der Stichprobe. Die Zellen werden dann mit Antikörpern gegen die interessierenden Zelloberflächenmarker markiert und mittels Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung sortiert. Letztendlich können die Vorhaut- und lymphatischen Malformationen, lymphatische Endothelzellen in Zellkultur für weitere nachgelagerte Analysen vermehrt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung einen Reinheitsgrad von mehr als 99 % ergibt, wodurch die Probleme vermieden werden, die mit dem Verlust von lymphatischen Endothelzellen aufgrund von Überwucherung durch kontaminierende Zellen verbunden sind. Beginnen Sie mit dem Wiegen eines 50-Milliliter-Röhrchens mit 10 Millilitern Medium, das mit einer antibiotischen Antimykotikum ergänzt wird. Übertragen Sie dann die lymphatische Malformation oder vier Hautproben in das Röhrchen und wiegen Sie das Röhrchen erneut, um das Gewicht des Gewebes zu bestimmen.

Als nächstes wird in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei das Gewebe und das Medium mit einer sterilen Zange mit einer sterilen Schere in eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale überführt. Zum Schluss das Gewebe in einen Kubikmillimeter große Stücke hacken. Dann geben Sie die Stücke in eine 50-Milliliter-Tube mit 10 Millilitern frischem Antibiotikum, Antimykotikum. Mittel.

Schwenken Sie das Röhrchen einige Male, um das Gewebe wieder zu suspendieren, und drehen Sie dann die Probe nach unten. Nach dem Entfernen des Überstands fügen Sie einen Milliliter vorwärmte Verdauungslösung pro 100 Milligramm gehacktem Gewebe hinzu und inkubieren Sie das Gewebe in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator unter ständigem Schütteln bei 200 U/min Für eine erfolgreiche Anreicherung der lymphatischen Endothelzellen. Es ist wichtig zu erkennen, wann die Zellen ausreichend der Kollagenase und der Dys-Space-Reaktion ausgesetzt waren, damit sie die Isolation überleben.

Dies wird durch eine sorgfältige Überwachung des Verdauungsprozesses des Gewebes und das Stoppen der Reaktion erreicht, wenn der größte Teil des Gewebes in feine Fragmente verdaut wurde. Am Ende der Inkubation bestätigen Sie, dass fast das gesamte Gewebe in kleine Fragmente verdaut wurde, und filtrieren Sie die Gewebeaufschlämmung durch ein 70-Mikron-Sieb in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie nun einen Drei-Milliliter-Spritzenkolben mit Gummikolben, um das restliche Gewebe zu zerkleinern, bis nur noch geringe Spuren der extrazellulären Matrix zu sehen sind.

Waschen Sie dann das Zellsieb mit einem Volumen Endothelzellmedium, das dem Volumen des dissoziierenden Enzymmediums entspricht, und schleudern Sie die Zellen reus herunter. Suspendieren Sie das Pellet je nach Probengröße in bis zu 20 Millilitern Endothelzellmedium. Dann, nach dem Zählen des Samens, zweimal 10 zu den sechs Zellen in einen 150 Quadratzentimeter großen Kolben, der mit Fibronektin vorcodiert ist, in einem endgültigen Volumen von 20 Millilitern Endothelzellmedium für die Übernachtkultur.

Waschen Sie am nächsten Morgen die ungebundenen Zellen mit drei Spülungen PBS ab, die mit einer antibiotischen Antimykotikum ergänzt sind. Um dann die Anzahl der lymphatischen Endothelzellen zu erhöhen, fügen Sie den Zellen frisches Endothelzellmedium hinzu und inkubieren Sie die Kultur fünf bis sieben Tage lang, bis die Kultur zu etwa 80 % konfluent ist. Zur Färbung der Zellen für die Sortierung durch Multiparameter-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung.

Entfernen Sie zuerst das Zellmedium und waschen Sie die Zellen dreimal in PBS. Fügen Sie dann nach einer fünf- bis siebenminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius sieben Milliliter Ablösungslösung hinzu. Ernten Sie die dissoziierten Zellen, inaktivieren Sie die Enzyme mit drei Volumina Endothelzellmedium und überführen Sie die Zellsuspension in ein steriles Röhrchen.

Zentrifugieren Sie die Zellen dreimal und waschen Sie das Pellet in fünf Millilitern PBS für die zweite und dritte Umdrehung nach der letzten Wäsche. Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern frischem PBS und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen durch Trianblau-Ausschluss. Nach der Zellzählung.

Übertragen Sie die Zellen aseptisch in Durchflusszytometrie-Färberöhrchen und schleudern Sie die Zellen herunter, um die unspezifische Bindung zu blockieren. Resuspendieren Sie die Zellen in 5%%F-B-S-P-B-S und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang auf Eis. Nach dem Blockieren der Zentrifuge entfernen die Zellen den Überstand und die Wiederbelebung.

Suspendieren Sie das Pellet in CD 34, CD 31 Potanin und VEGF-Rezeptor-Drei-Antikörper-Cocktail. Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten auf Eis dreimal in zwei Millilitern F-B-S-P-B-S, um ungebundene Antikörper und Reanimationen zu entfernen. Suspendieren Sie das Pellet in 300 Mikrolitern Propidiumiodid in F-B-S-P-B-S-Lösung auf Eis.

Sortieren Sie abschließend die gereinigten humanen lymphatischen Endothelzellen auf einem fluoreszenzaktivierten Multiparameter-Zellsortiergerät. Schleudern Sie dann die sortierten Zellen herunter und reanimieren Sie die Pellets in dem geeigneten Medium für die Aussaat der Zellkultur. Hier sind normale humane lymphatische und lymphatische Malformationsgefäße dargestellt, die mit Antikörpern gegen Pot-Deplane markiert sind, wobei die ausgeprägte Dilatation und die beträchtliche Variation der Lumengröße innerhalb der humanen lymphatischen Malformationsgefäße

In der Tat enthalten die meisten lymphatischen Malformationen sowohl kleine oder mikrozystische als auch große oder makrozystische abnormale zystische Strukturen nach der anfänglichen Gewebeverdauung und 24-stündiger Kultur in den unfraktionierten Proben. Neben den fibroblastenartigen Zellen und glatten Muskelzellen können nach der Sortierung und weiteren 24 Stunden in Zellkultur deutliche Endothelzellkolonien beobachtet werden. Der CD 34, ein niedriger CD 31-positiver VEGF-Rezeptor hat jedoch drei positive Podo-Ebenen- und positive Zellen, die an den Kulturbehälter gebunden sind, und weisen die typische Kopfsteinpflastermorphologie auf, die in diesen Bildern beobachtet wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die lymphatische Endothelzelle, die die lymphatische Malformation des Menschen und die vollen Lymphgefäße der Haut auskleidet, mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung mit hoher Reinheit isolieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primärem menschlichem Gewebe gefährlich sein kann, da es Infektionserreger enthalten kann, die für die menschliche Gesundheit schädlich sind. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Standardvorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Schutzbrillen und Laborkitteln getroffen werden.