Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

Dieses Verfahren basiert auf Pflanzen, die GFP in spezifischen Zelltypen exprimieren, die anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS von den übrigen Pflanzenzellen isoliert werden können. Dieses Beispiel verwendet zwei Markerlinien, die in spezifischen Zelltypen von Arabidopsis exprimieren. Aliana-Wurzelsämlinge werden in Phyto-Schalen oder auf Agarplatten kultiviert.

Ihre Wurzeln werden geerntet und mit Enzymen zur Zellwandverdauung behandelt. Nach einer Stunde wird die Lösung filtriert, um grobe Rückstände zu entfernen. Anschließend wird die Lösung zentrifugiert und der Überstand abgenommen.

GFP-positive Protoplasten werden anschließend mittels FACS getrennt. Das sortierte Material kann für zelltypspezifische Analysen wie genomweite Transkriptionsprofile verwendet werden. Hallo, ich bin Basian Barman aus dem Labor von Ken Birnbaum am Department für Biologie der New York University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von Pflanzenprotoplasten. In diesem Beispiel werden wir zwei spezifische Zelltypen in der Arabidopsis-Wurzel sortieren. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zelltypspezifische transkriptionelle Profile zu untersuchen.

Beginnen wir also. Züchten Sie zunächst Wildtyp-Keimlinge sowie Keimlinge mit zelltypspezifischer Expression von GFP. Der Scarecrow-Promotor, der GFP antreibt, markiert die Wurzelendodermis und das quieszente Zentrum in einer Gruppe von Keimlingen.

Und in einer anderen Gruppe wird das ruhende Zentrum der Wurzel durch den Promotor von *walks five* gekennzeichnet, der GFP antreibt. Die Keimlinge werden hydroponisch gezüchtet und auf FIA-Schalen, die auf einem Nylonfilter liegen, sodass die Wurzeln durch den Filter hindurch in das Wachstumsmedium wachsen können. Alternativ können die Pflanzen auch auf einem Nylonnetz und vertikal angeordneten 1%-Agarplatten kultiviert werden.

Neben der Unterstützung bei der Wurzelgewinnung ermöglichen die Filter die Massenübertragung der Keimlinge in neue Phyto-Schalen oder Agarplatten, wo sie mit einem interessierenden Katalysator ergänzt werden können. Dies kann erfolgen, um transkriptionelle Antworten bestimmter Zelltypen auf Nährstoffe, Hormone oder Stressbehandlungen zu untersuchen. Überprüfen Sie am Fluoreszenzmikroskop, ob der fluoreszierende Marker wie erwartet exprimiert wird.

Stellen Sie sicher, dass das Expressionsmuster des Markers unter den angewendeten Behandlungsbedingungen konsistent ist, da es sich infolge der Behandlung verändern kann. Fahren Sie fort mit der Gewinnung und Vorbereitung von Protoplasten. Beginnen Sie mit der Herstellung der Protoplastenlösung.

Vermischen Sie 1,25 % Gewicht pro Volumen Cellulase, 0,3 % Gewicht pro Volumen Maserzyme, 0,4 molares D-Mannitol, 20 Millimolar MES und 20 Millimolar KCl in entmineralisiertem Wasser und stellen Sie den pH-Wert mit einmolarem Tris-HCl auf pH 5,7 ein. Diese Lösung wird leicht trüb sein. Erwärmen Sie anschließend die Lösung 10 Minuten lang auf 55 Grad Celsius.

Die Lösung wird klar; lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und geben Sie dann 0,1 % Gewicht pro Volumen BSA, 10 Millimolar Calciumchlorid und fünf Millimolar Beta-Mercaptoethanol hinzu. Gewinnen Sie einwöchige Keimlinge aus einem Phyto-Tablett. Im Fall der Scarecrow-GFP-Linie oder acht Platten vier Tage alter Wurzeln von 5G-FP-Keimlingen, kratzen Sie die Wurzeln mit einem Skalpell vom Nylonnetz ab und geben Sie sie anschließend in einen Behälter mit einer Protoplastenlösung.

Verwenden Sie etwa 10 Milliliter Protoplastenlösung pro 1500 Sämlinge. Schütteln Sie die Kolben vorsichtig bei 75 U/min bei Raumtemperatur für eine Stunde. Eine längere Inkubationszeit kann die Ausbeute an Protoplasten erhöhen, verstärkt jedoch auch den Einfluss der Protoplasten selbst auf die Genexpression.

Nachdem die Protoplasten freigesetzt wurden, verwenden Sie einen 40-Mikrometer-Zellfilter, um die Lösung zu filtrieren, und verteilen die Protoplastensuspension auf kegelförmige 15-ml-Röhrchen. Es ist wichtig, eine saubere Protoplastensuspension mit möglichst wenig Zelltrümmern zu erhalten, um Verstopfungen der FACS-Anlage zu vermeiden und die Zeit für die Zellsortierung zu minimieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen in einer Schwenkkorbzentrifuge bei 500 ×g zehn Minuten bei Raumtemperatur.

Beachten Sie, dass die Zentrifugationsgeschwindigkeit von der Beschaffenheit des Pflanzenteils abhängt, aus dem die Protoplasten gewonnen werden, sowie von der Menge an Zelltrümmern, die während der enzymatischen Behandlung entsteht. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den größten Teil des Überstandes und resuspendieren das Pellet, das die Protoplasten enthält, vorsichtig in einem kleinen Volumen der verbliebenen Protoplasten-Lösung. Zählen Sie abschließend die Protoplasten mit einem Hämozytometer, ermitteln Sie ihre Dichte, berechnen Sie die Ausbeute und legen Sie daraufhin die Parameter für die anschließenden Versuche fest.

Nach der Zählung die Protoplasten untersuchen. Überprüfen Sie deren Integrität, das Ausmaß der GFP-Expression sowie den Gehalt an kontaminierendem Zelltrümmern. Danach fortfahren zur Fax.

Wenn nicht direkt mit der Fax fortgefahren wird, können Protoplasten gewaschen, resuspendiert und in einer Inkubationslösung wie der Proto-Plating-Lösung ohne zugesetzte Enzyme oder in W5-Lösung aufbewahrt werden. Schalten Sie den Zellsortierer und den Arbeitsplatzrechner ein.

Hier verwenden wir einen von Becton Dixon and Company hergestellten Fria. Verwenden Sie ein XPBS als Umhüllungsflüssigkeit und führen Sie das Fluidik-Startverfahren durch. Installieren Sie eine 100-Mikrometer-Düse und stellen Sie einen Umhüllungsdruck von 20 PSI ein.

Richten Sie einen stabilen Strömungsstrom ein und kalibrieren Sie die Tropfenverzögerung. Beachten Sie, dass die Kalibrierung in diesem Verfahren nicht dargestellt ist. Protoplastensuspensionen mit einer Dichte von bis zu 10 Millionen Zellen pro Mil können erfolgreich sortiert werden.

Um eine Sedimentation der Protoplasten zu verhindern, verwenden Sie die Probenspülungsoption auf dem FACS. Wenn eine Verstopfung des FACS ein Problem darstellt, gibt es drei mögliche Schritte zur Beseitigung. Zunächst führen Sie eine Rückspülung der Probenleitung durch.

Zweitens verdünnen Sie die Protoplastensuspension, um die Dichte zu verringern. Drittens reinigen Sie die Protoplastenlösung, indem Sie den Filtrationsschritt nach der Zentrifugation und Resuspendierung wiederholen. Nur vier Parameter werden verwendet, um GFP-positive Protoplasten von GFP-negativen Protoplasten und Zelltrümmern nach Anregung durch einen 488-Nanometer-Laser zu unterscheiden: Der Forward Scatter ist ein Indikator für die Partikelgröße, der Side Scatter ein Indikator für die Partikelgranularität.

Die Emission bei 530 Nanometern als Maß für grüne Fluoreszenz und die Emission bei 610 Nanometern als Maß für Autofluoreszenz im roten Spektrum. Erstellen Sie zunächst ein Punktdiagramm für Forward Scatter gegen Side Scatter. Wenden Sie die Spannungseinstellung an, sodass die gemessenen Ereignisse im Diagramm zentriert sind.

Grünes Fluoreszenzprotein-positive PROTOPLASTEN können anhand ihres erhöhten Verhältnisses von grüner zu roter Emission im Vergleich zu Ereignissen mit Autofluoreszenz unterschieden werden. Erstellen Sie ausschließlich ein Punktdiagramm mit grüner Fluoreszenz gegen rote Spektral-Autofluoreszenz. Wählen Sie die Spannungseinstellungen so, dass die gemessenen Ereignisse im Diagramm eine einzige diagonale Population ergeben.

Bei Betrachtung einer Suspension von Wildtyp-Protoplasten sollten GFP-positive PROTOPLASTEN eine deutliche Population grün fluoreszierender Ereignisse erzeugen, die in Wildtyp-Proben niemals beobachtet wird. Stellen Sie Kompensationsparameter ein, um die spektrale Überlappung zwischen grüner Fluoreszenz und rotem Autofluoreszenzspektrum auszugleichen. Mithilfe einer GFP-positiven PROTOPLASTEN-Suspension ermöglichen korrekt eingestellte Kompensationsparameter eine bessere Trennung der GFP-positiven Protoplasten von den GFP-negativen Protoplasten und Trümmerteilchen, sodass ein Gate zur Identifizierung der GFP-positiven Ereignisse festgelegt werden kann.

Es empfiehlt sich, jedes Mal, wenn Sie ein Sortierexperiment vorbereiten, nicht fluoreszierende Protoplasten mitzuführen, um die Grenzen des Gates festlegen zu können. Legen Sie abschließend eine Schwellenwertabschaltung für den Vorwärtsstreulichtdetektor fest, um kleine Partikel aus der Analyse auszuschließen. Die Visualisierung der GFP-positiven Ereignisse im Vorwärtsstreu- versus Seitwärtsstreu-Diagramm hilft dabei, die geeignete Position der Schwelle zu bestimmen.

Die in diesem ersten FAKTS-Lauf eingerichteten Parameter können für zukünftige Sortierungen wiederverwendet werden. Für die tägliche Nutzung des FAKTS sind geringfügige Anpassungen erforderlich. Für die RNA-Extraktion bereiten Sie Sammelröhrchen mit RNA-Extraktionspuffer vor; verwenden Sie als Richtwert ein Sortiervolumen von maximal 100 µL auf 350 µL Extraktionspuffer.

20.000 Sortierereignisse ergeben ein Gesamtsortiervolumen von etwa 100 Mikrolitern. Nachdem nun die Fax-Parameter und Betriebsmodi eingestellt sind und die Sammelröhrchen bereitstehen, beginnen Sie mit der Sortierung der Protoplasten. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, mischen Sie die Sammelröhrchen des Probenmaterials, da sich die Zellsuspension an der Oberfläche sammeln kann. Bereits weniger als 500 sortierte Ereignisse können nach RNA-Extraktion und cDNA-Amplifikation für die Microarray-Analyse verwendet werden.

Hier verwenden wir das RNEZ-Mikro-Extraktionskit, das WT Ovation Pico RNA-Amplifikationssystem und das FL Ovation CDNA-Biotin-Modul V2. Hier sind typische FACS-Ergebnisse für Protoplasten, die aus nicht-GFP-Scarecrow-, GFP- und W5GFP-Keimlingen stammen. Jeweils 100.000 Ereignisse sind in jedem Punktediagramm dargestellt, wobei die grüne Fluoreszenz auf der X-Achse gegen die rote Fluoreszenz auf der Y-Achse aufgetragen ist. Die Ereignisse innerhalb des GFP-Sortiergatters sind grün hervorgehoben.

Hierbei handelt es sich um eine Zusammenfassung der typischen Protoplastenausbeute aus Keimlingen, die entweder Scarecrow-GFP exprimieren, das die Wurzelendodermis und die quieszente Zentrale markiert, oder walks 5G FP, das die quieszente Zentrale der Wurzel markiert. Es gibt weniger Zellen im quieszenten Zentrum der Wurzel im Vergleich zur Wurzelendodermis. Daher ist die Ausbeute an GFP-exprimierenden Zellen bei der walks 5G FP-Sortierung – trotz des Einsatzes einer größeren Anzahl an Protoplasten – geringer als bei der Scarecrow-GFP-Sortierung. Dargestellt sind hier typische Ergebnisse der RNA-Extraktion aus dreifachen Proben.

Jede Probe entspricht der aus 10.000 Ereignissen extrahierten RNA. Die extrahierte RNA wird auf einem Bioanalyzer analysiert, wobei die ribosomalen Peaks für die Scarecrow-GFP-Proben oben und die Walks-5G-FP-Proben unten dargestellt sind. Die extrahierte RNA kann anschließend für die Microarray-Analyse verwendet werden. Dieses Streudiagramm der Log2-Expressionswerte zeigt die Ähnlichkeit zwischen zwei Wiederholungen.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung von Pflanzenprotoplasten für die zelltypspezifische Analyse durchgeführt wird. Diese Technik ist auf viele verschiedene Pflanzengewebe und Arten anwendbar. Hohe Ausbeuten mit geringem Debrisgehalt und gesunden Protoplasten führen zu besseren Ergebnissen in nachgeschalteten transkriptionellen sowie anderen Analysen.

Beachten Sie außerdem, dass es wichtig ist, die Wachstumsbedingungen des Pflanzenmaterials für den Vergleich zwischen sortierten Proben identisch zu halten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.