Fluorescence Activated Cell Sorting von Pflanzenprotoplasten

Ein Verfahren zur Isolierung von spezifischen Zelltypen aus pflanzlichem Material nachgewiesen ist. Diese Technik bedient sich transgene Marker exprimieren fluoreszierenden Proteinen in bestimmten Zelltypen, Zell-Dissoziation und Fluorescence Activated Cell Sorting. Zusätzlich wird ein Wachstum Setup hier erleichtert Behandlung von etablierten

Dieses Verfahren beruht darauf, dass Pflanzen GFP in bestimmten Zelltypen exprimieren, die dann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Fakten vom Rest der Pflanzenzellen isoliert werden können. In diesem Beispiel werden zwei Markierungslinien verwendet, die in bestimmten Zelltypen der Arabidopsis exprimiert werden. Aliana-Wurzelkeimlinge werden in Phytoschalen oder auf Agarplatten gezüchtet.

Ihre Wurzeln werden geerntet und mit zellwandverdauenden Enzymen behandelt. Nach einer Stunde wird die Lösung filtriert, um große Ablagerungen zu entfernen. Anschließend wird die Lösung zentrifugiert und der Überstand entfernt.

GFP-positive Protoplasten werden anschließend per Fax getrennt. Das sortierte Material kann für zelltypspezifische Analysen, wie z. B. genomweite Transkriptionsprofile, verwendet werden. Hallo, ich bin Basian Barman aus dem Labor von Ken Birnbaum am Department of Biology der New York University.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von pflanzlichen Protoplasten. In diesem Beispiel sortieren wir zwei bestimmte Zelltypen in der Arabidopsis-Route. Dieses Verfahren verwenden wir in unserem Labor, um zelltypspezifische Transkriptionsprofile zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie sowohl Wildtyp-Sämlinge als auch Sämlinge, die eine zelltypspezifische Expression von GFP aufweisen. Der Vogelscheuchen-Promotor, der GFP antreibt, markiert die Wurzelendodermis und das Ruhezentrum in einer Gruppe von Sämlingen.

Und in einer anderen Gruppe wird das Ruhezentrum der Wurzel durch die Spaziergänge fünf Promotor GFP markiert. Die Sämlinge werden hydroponisch und in FIA-Schalen auf einem Nylonfilter gezüchtet, der die Wurzeln in das Wachstumsmedium durchwachsen lässt. Alternativ können die Pflanzen auf einem Nylonnetz und vertikal positionierten 1%-Agar-Platten angebaut werden.

Die Filter helfen nicht nur bei der Ernte der Wurzeln, sondern ermöglichen es auch, die Sämlinge in großen Mengen in neue Phytoschalen oder Agarplatten zu überführen, wo sie mit einem interessanten Katalysator ergänzt werden können. Dies kann geschehen, um zelltypspezifische Transkriptionsreaktionen auf Nährstoffe, Hormone oder Stressbehandlungen zu untersuchen. Überprüfen Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop, ob der Fluoreszenzmarker wie erwartet exprimiert wird.

Stellen Sie sicher, dass das Expressionsmuster des Markers unter den angewendeten Behandlungsbedingungen konsistent ist, da es sich infolge der Behandlung ändern kann. Fahren Sie mit der Ernte fort und bereiten Sie Protoplasten vor. Beginnen Sie mit der Zubereitung der Protoplastenlösung.

Kombinieren Sie 1,25 % Gewicht pro Volumen, Cellulase 0,3 % Gewicht pro Volumen, Maser Zyme 0,4 molare D, Mannitol 20 Millimolar, MES und 20 Millimolar KCL in demineralisiertem Wasser und stellen Sie den pH-Wert auf 5,7 mit einem molaren Tris HCL bei pH 7,5 ein. Diese Lösung wird leicht trüb sein. Dann erhitzen Sie die Lösung 10 Minuten lang auf 55 Grad Celsius.

Die Lösung wird klar, lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen und fügen Sie dann 0,1 % Gewicht pro Volumen BSA 10 Millimolar Calciumchlorid hinzu und fünf Millimolare Beta Me Capto Ethanol ernten Sie eine Woche alte Sämlinge aus einer Phytoschale. Im Falle der Vogelscheuche GFP-Linie oder acht Teller mit vier Tage alten Spaziergängen 5G FP-Sämlingen. Kratzen Sie die Wurzeln mit einem Skalpell vom Nylonnetz ab und geben Sie sie dann in einen Behälter mit einer Protoplastenlösung.

Verwenden Sie etwa 10 Milliliter Protoplastenlösung pro 1500 Sämlinge. Schütteln Sie die Kolben eine Stunde lang vorsichtig bei 75 U/min bei Raumtemperatur. Eine längere Inkubationszeit kann die Protoplastenausbeute erhöhen, trägt aber auch zur Wirkung der Protoplasten selbst auf die Genexpression bei.

Nachdem die Protoplasten freigesetzt wurden, verwenden Sie ein 40-Mikrometer-Zellensieb, um die Lösung zu filtrieren, und teilen Sie die Protoplastensuspension auf konische 15-mil-Röhrchen auf. Es ist wichtig, eine saubere Protoplastensuspension ohne zu viel Schmutz zu erzeugen, um ein Verstopfen der Fakten zu verhindern und die für die Sortierung der Zellen benötigte Zeit zu minimieren. Die Röhrchen werden in einer Schwenkschaufelzentrifuge bei 500 g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Beachten Sie, dass die Zentrifugationsgeschwindigkeit von der Konstitution des Pflanzenabschnitts, der die Protoplasten liefert, und der Menge an Zelltrümmern abhängt, die während der enzymatischen Behandlung produziert werden. Nach der Zentrifugation wird der größte Teil des Überstands entfernt und das Pellet mit den Protoplasten in dem kleinen Volumen der verbleibenden Protoplastenlösung vorsichtig wieder suspendiert. Zählen Sie abschließend die Protoplasten mit einem Hämozytometer und bestimmen Sie ihre Dichte, um die Ausbeute zu berechnen und die Parameter des Faktenlaufs festzulegen.

Untersuchen Sie nach dem Zählen die Protoplasten. Überprüfen Sie ihre Unversehrtheit, den Grad der GFP-Expression und den Gehalt an kontaminierenden Zelltrümmern. Fahren Sie anschließend mit dem Faxen fort.

Wenn nicht, fahren Sie direkt mit dem Fax fort. Protoplasten können gewaschen, resuspendiert und in einer Inkubationslösung wie Proto-Plattierungslösung ohne Zusatz von Enzymen oder W-Fünf-Lösung gelagert werden. Schalten Sie den Zellensortierer und den Workstation-Computer ein.

Hier verwenden wir eine Fria, die von Becton Dixon and Company hergestellt wird. Verwenden Sie ein XPBS als Mantelflüssigkeit und führen Sie den Fluidic-Startvorgang aus. Installieren Sie eine 100-Mikrometer-Düse und stellen Sie einen Manteldruck von 20 PSI ein.

Richten Sie einen stabilen Durchfluss ein und kalibrieren Sie die Tropfenverzögerung. Beachten Sie, dass die Kalibrierung in diesem Verfahren nicht angezeigt wird. Protoplasten-Suspensionen mit einer Dichte von bis zu 10 Millionen Zellen pro mill können erfolgreich sortiert werden.

Um eine Sedimentation der Protoplasten zu verhindern, verwenden Sie die Option Probenrührung auf den Fakten. Wenn das Verstopfen der Fakten ein Problem ist, gibt es drei mögliche Schießschritte. Führen Sie zunächst eine Beispiel-Line-Backflush durch.

Zweitens, verdünnen Sie Ihre Protoplastensuspension, um die Dichte zu verringern. Drittens, reinigen Sie die Protoplastenlösung, indem Sie den Filtrationsschritt nach der Zentrifugation und der Wiederbelebungssuspension wiederholen. Nur vier Parameter werden verwendet, um GFP-positive Protoplasten von GFP-negativen Protoplasten und Zelltrümmern nach Anregung durch einen 488-Nanometer-Laser zu unterscheiden: Vorwärtsstreuung ist ein Indikator für die Partikelgröße, Seitenstreuung ist ein Indikator für die Partikelgranularität.

Emission bei 530 Nanometern als Maß für die grüne Fluoreszenz und Emission bei 610 Nanometern als Maß für die Autofluoreszenz des roten Spektrums. Beginnen Sie mit dem Einrichten eines Punktdiagramms für Vorwärts- und Seitenstreuung. Wenden Sie die Spannungseinstellung so an, dass die gemessenen Ereignisse im Diagramm zentriert werden.

GFP-positive PROTOPLASTEN zeichnen sich durch ein erhöhtes Verhältnis von grüner zu roter Emission im Vergleich zu Ereignissen mit Autofluoreszenz aus. Richten Sie nur ein Punktdiagramm mit grüner Fluoreszenz im Vergleich zu Autofluoreszenz mit rotem Spektrum ein. Wenden Sie die Spannungseinstellungen so an, dass die gemessenen Ereignisse zu einer einzigen diagonalen Grundgesamtheit im Diagramm führen.

Bei der Betrachtung einer Wildtyp-Protoplasten-Suspension sollten GFP-positive PROTOPLASTEN eine klare Population von grün fluoreszierenden Ereignissen erzeugen, die in Wildtyp-Proben noch nie beobachtet wurden. Legen Sie Kompensationsbeschränkungen fest, um die spektrale Überlappung zwischen grüner Fluoreszenz und roter Spektrum-Autofluoreszenz auszugleichen. Bei Verwendung einer GFP-positiven PROTOPLASTEN-Suspension ermöglichen die richtigen Einstellungen für die Kompensationsbeschränkungen eine bessere Trennung der GFP-positiven Protoplasten von den Nicht-GFP-Protoplasten, und Trümmer richten ein Tor ein, um GFP-positive Ereignisse zu identifizieren.

Es ist ratsam, bei jeder Vorbereitung eines Sortierexperiments Nicht-GFP-PROTOPLASTEN mitzunehmen, um die Torgrenzen zu definieren. Legen Sie abschließend einen Schwellenwert für die Streuung nach vorne fest, um kleine Ablagerungen aus der Analyse auszuschließen. Die Visualisierung positiver GFP-Ereignisse im Forward-Scatter- und Side-Scatter-Diagramm hilft bei der Bestimmung, wo der Schwellenwert festgelegt werden sollte.

Die Parameter, die in diesem ersten Faktenlauf eingerichtet wurden, können für zukünftige Sortierungen wiederverwendet werden. Für die tägliche Anwendung der Fakten sind geringfügige Anpassungen erforderlich. Bereiten Sie für die RNA-Extraktion Entnahmeröhrchen mit einem RNA-Extraktionspuffer vor, wobei Sie höchstens ein Sortiervolumen von 100 Mikrolitern bis 350 Mikroliter Extraktionspuffer als Richtlinie verwenden.

20.000 Sortierereignisse ergeben ein Gesamtsortiervolumen von ca. 100 Mikrolitern. Nachdem die Faxparameter und Betriebsmodi eingestellt sind und die Entnahmeröhrchen bereit sind, beginnen Sie nach Abschluss der Sortierung mit der Sortierung der Protoplasten. Mischen Sie die Probenentnahmeröhrchen, da sich die Zellsuspension an der Oberseite ansammeln kann, so dass nur 500 sortierte Ereignisse für die Microarray-Analyse nach RNA-Extraktion und CD-NA-Amplifikation verwendet werden können.

Hier verwenden wir das RNEZ Micro Extraction Kit, das WT ovation PICO RNA Amplifikationssystem und die Flo ovation CD NA Biotin Modul V two. Hier sind typische Faxergebnisse für Protoplasten, die von Nicht-GFP-Vogelscheuche-, GFP- und W 5G-FP-Sämlingen abgeleitet wurden: 100.000 Ereignisse werden in jedem Punktdiagramm der grünen Fluoreszenz auf der x-Achse im Vergleich zur roten Fluoreszenz dargestellt. Auf der Y-Achse werden die Ereignisse, die in das GFP-Sortiergatter fallen, grün hervorgehoben.

Dies ist eine Zusammenfassung des typischen Protoplastenertrags der Sämlinge, die entweder Vogelscheuche IGP exprimieren, das die Wurzelendodermis und das Ruhezentrum markiert, oder 5G FP, das das Ruhezentrum der Wurzel markiert. Im Ruhezentrum der Wurzel gibt es weniger Zellen als in der Wurzelendodermis. Obwohl mit mehr Protoplasten begonnen wurde, ist die Ausbeute an GFP-exprimierenden Zellen in der 5G-FP-Sorte der Walks geringer als bei der Vogelscheuchen-GFP-Sorte.

Jede Probe entspricht der RNA, die aus 10.000 Ereignissen extrahiert wurde. Die extrahierte RNA wird auf einem Bioanalysator analysiert, wobei die ribosomalen Peaks für die Vogelscheuchen-GFP-Proben oben und die 5G-FP-Proben unterhalb der extrahierten RNA für die Microarray-Analyse weiter verwendet werden können. Dieses Streudiagramm von log zwei Ausdrucksebenen veranschaulicht die Ähnlichkeit zwischen zwei Replikaten.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung von pflanzlichen Protoplasten für die zelltypspezifische Analyse durchführen können. Diese Technik ist auf viele verschiedene Pflanzengewebe und -arten anwendbar. Gute Erträge mit geringem Gehalt an Ablagerungen und gesunden Protoplasten führen zu besseren nachgelagerten Ergebnissen sowohl bei transkriptionellen als auch bei anderen Analysen.

Denke auch daran, dass es wichtig ist, die Wachstumsbedingungen des Pflanzenmaterials für den Vergleich zwischen den sortierten Proben identisch zu halten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.