Analyse komplexer Moleküle und ihrer Reaktionen auf Oberflächen mittels Cluster-induzierter Desorption/Ionisationsmassspektrometrie
1. März 2020
Neutrale SO2-Cluster mit niedriger kinetischer Energie (< 0,8 eV/Konstituentus) werden verwendet, um komplexe Oberflächenmoleküle wie Peptide oder Lipide zur weiteren Analyse mittels Massenspektrometrie mittels eines Ionenfallen-Massenspektrometers zu desorben. Eine spezielle Probenvorbereitung ist nicht erforderlich, und eine Echtzeitbeobachtung der Reaktionen ist möglich.
Die durch neutrale SO2-Cluster induzierte Desorptionsionisierung, die wir kurz DINeC nennen, ist eine weiche und effiziente Desorptionsionisierungsmethode. Wir verwenden es unter anderem für die Massenspektrometrie von Biomolekülen, wie Peptiden und Proteinen. Als DINeC, Desorptionsmoleküle intakt von den Probenoberflächen, subtile chemische Veränderungen in diesen Molekülen leicht in den Massenspektren detektiert werden.
Der Prozess wird in der folgenden Simulation veranschaulicht. Die eingehenden Cluster zersplittern durch den Aufprall auf die Oberfläche des Clusters. Das Oberflächenisotopdipeptid wird in einem der Clusterfragmente aufgelöst und durch diesen Prozess desorptiert.
Im Experiment wird der Strahl von SO2-Clustern über Überschallausdehnung aus einer gepulsten Düse erzeugt. Die Moleküle, die während des Aufpralls auf der Clusteroberfläche gelöst und ionisiert werden, werden in die Ionenfalle für die Massenspektrometrie übertragen. Typische Massenspektren zeigen nur Spitzen bei den MO-Eingestelltwerten des intakten Moleküls.
Das Verfahren wird Karolin Bomhardt und Pascal Schneider, zwei Doktoranden in meinem Labor, demonstrieren. Schneiden Sie bei Standardproben die Substrate aus Siliziumwafern mit einer Dicke von etwa 0,5 bis einem Millimeter in Stücke von einem mal einen Quadratzentimeter. Reinigen Sie die Siliziumsubstrate in einem Ultraschallbad von Ethanol und Aceton für jeweils 15 Minuten.
Trocknen Sie die Substrate in einem Strom von trockenem Stickstoffgas. Dann fünf bis 30 Mikroliter der Probenlösung auf das Substrat werfen. Lassen Sie die Probe je nach Dampfdruck des Lösungsmittels unter Umgebungsbedingungen oder in einem Trockenhaus trocknen, bis das gesamte Lösungsmittel verdampft und ein Trockenfilm gebildet wurde.
Betrachten Sie das einfachste Vorbereitungsschema. Zum Beispiel, für die Untersuchung von Highlighter-Tinte, zeichnen Sie einfach einen Punkt auf der Substratoberfläche. Montieren Sie die Proben auf dem Probenhalter mit Klebeband oder Klemmen, die mit Schrauben angezogen werden.
Zusätzlich eine Referenzprobe wie einen mikrometerdicken Film von Angiotensin II auf den Probenhalter montieren. Drücken Sie dann die Entlüftungssperre, um das Lastsperrsystem zu entlüften. Warten Sie fünf Minuten, oder bis der atmosphärische Druck erreicht ist.
Öffnen Sie das Lastschloss und montieren Sie den Probenhalter. Schließen Sie das Lastschloss und pumpen Sie die Lastsperrkammer auf einen Druck unter zwei mal 10 auf die negative Fünf-Millibar. Öffnen Sie das Ventil zur DINeC-Kammer und übertragen Sie den Probenhalter mit dem Transferstab zum Hauptmanipulator.
Befestigen Sie den Probenhalter am Manipulator. Ziehen Sie die Transferstange ein und schließen Sie das Ventil zwischen dem Lastschloss und der DINeC-Kammer. Öffnen Sie das Ventil zwischen gaszylinder und düse.
Stellen Sie den Druck des Schwefeldioxid- und Heliumgasgemisches an der Umrisslinie des Gasmischsystems auf 15 bar ein. Legen Sie die Position des Manipulators auf die Position des Referenzbeispiels fest. Stellen Sie für die Messung kationischer Massenspektren die Vorspannung der Probe und des Rasters auf plus 40 Volt bzw. plus sieben Volt ein.
Um die gepulste Düse und das Ionenfang-Massenspektrometer anzutreiben, stellen Sie den externen Funktionsgenerator auf zwei Hertz ein. Stellen Sie mit dem Verzögerungsgenerator die Zeitverzögerung zwischen dem klaren Trapsignal aus der Ionenfalle und dem Auslösesignal für die gepulste Düse auf fünf Millisekunden ein. Wählen Sie in der Bruker-Steuerungssoftware auf der Seite Modus des Hauptdialogfensters Erweiterte Auflösung für den Scan-Modus aus.
Geben Sie m über Z 50 bis 3000 für den Bereich ein, geben Sie 0,1 Millisekunden für die Akkumulationszeit ein, geben Sie 10 Zyklen für den Durchschnitt ein, und wählen Sie für die Polarität positiv für die Messung kationischer Massenspektren und negativ für die Messung von anionischen Spektren. Sobald ein Druck unter dreimal 10 auf die negative sechs Millibar in der DINeC-Kammer erreicht wurde, beginnen Sie die Messung. Stellen Sie den Wert M über Z auf die jeweilige Masse ein, um dem zeitabhängigen Chromatogrammsignal zu folgen.
Drücken Sie In der Steuerungssoftware auf Operate. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Messungen, indem Sie die Aufnahmetaste drücken. Messen Sie das Testspektrum einer Referenzprobe, z. B. Angiotensin II, für etwa 300 Sekunden.
Optimieren Sie die Signalintensität durch Einstellung der Zeitverzögerung zwischen dem klaren Trapsignal und dem Signal, das die gepulste Düse auslöst. Wenn die Zeitverzögerung optimiert ist, bewegen Sie den Manipulator in die Position der zu messenden Probe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufzeichnen, um Massenspektren über den Zeitzeitraum zu erfassen.
Laden Sie nach Abschluss der Messung den jeweiligen Datensatz in das Datenanalyseprogramm, wie hier für die Referenzmessung gezeigt. Wählen Sie die Zeitspanne des Interesses für das Chromatogramm mit der rechten Maustaste aus. Das durchschnittliche Spektrum wird in einem separaten Fenster angezeigt.
Klicken Sie auf Als ASCII-Datei exportieren, um das Spektrum als Datendatei zur weiteren Verarbeitung in einem Programm ihrer Wahl zu exportieren. Das DINeC-Massenspektrum einer Angiotensin-II-Probe änderte sich mit der Zeit, da die Probe auf etwa 140 Grad Celsius erhitzt wurde. Sobald die Temperatur den Endwert erreicht hatte, fiel der Höhepunkt des angegriffenen prointierten Moleküls bei M über Z gleich 1047 und es wurden neue Spitzen beobachtet.
Der Prozess wird in diesen drei Diagrammen zusammengefasst. Die zusätzlichen Spitzen bei M über Z, die 932, 1012 und 1029 entsprachen, wurden gut beobachtet. Die Analyse der Reaktionskinetik zeigt, dass das Gebilde mit M über Z, das 1029 entspricht, ein Zwischenprodukt ist, das weiter in kleinere Fragmente zerlegt wurde, als die Intensität zuerst zunahm und dann abnahm.
Die wichtigsten Merkmale von DINeC sind die weiche Natur des Desorptionsprozesses, die Effizienz und die hohe Oberflächenempfindlichkeit. Sie alle kommen mit den geringen Anforderungen an die Probenvorbereitung zusammen. DINeC kann somit auf eine Vielzahl unterschiedlicher Proben angewendet werden, von organischen Rindenmaterialien bis hin zu komplexen Oberflächenadsorbaten im Submonolayer-Bereich.
In allen Fällen können vollständige chemische Informationen in Echtzeit abgerufen werden.
Übersicht
Diese Studie präsentiert eine neuartige Desorptions-Ionisationsmethode unter Verwendung neutraler SO2-Cluster, genannt DINeC, für die Massenspektrometrie-Analyse von Biomolekülen. Die Technik ermöglicht die Echtzeitbeobachtung chemischer Veränderungen in Peptiden und Proteinen ohne umfangreiche Probenvorbereitung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Massenspektrometrie
- Biomolekulare Analyse
- Oberflächenchemie
Hintergrund
- DINeC ist eine sanfte Desorptions-Ionisationsmethode.
- Sie ermöglicht die Analyse komplexer Oberflächenmoleküle.
- Echtzeitüberwachung von Reaktionen ist möglich.
- Minimale Probenvorbereitung ist erforderlich.
Zweck der Studie
- Zur Demonstration der Effektivität von DINeC für die Massenspektrometrie.
- Zur Analyse subtiler chemischer Veränderungen in Biomolekülen.
- Zur Bereitstellung eines detaillierten Protokolls für Probenvorbereitung und Messung.
Verwendete Methoden
- Produktion von SO2-Clustern durch Überschallexpansion.
- Desorption von Molekülen durch Cluster-Oberflächenaufprall.
- Übertragung ionisierter Moleküle in ein Ionenfallen-Massenspektrometer.
- Echtzeit-Datenerfassung und Analyse von Massenspektren.
Hauptergebnisse
- Massenspektren zeigen intakte molekulare Peaks.
- Neue Peaks entstehen mit steigender Temperatur während der Analyse.
- Reaktionskinetiken zeigen die Bildung von Zwischenspezies.
- DINeC demonstriert hohe Oberflächenempfindlichkeit und Effizienz.
Schlussfolgerungen
- DINeC ist eine vielseitige Methode, die für verschiedene Proben anwendbar ist.
- Es liefert umfassende chemische Informationen in Echtzeit.
- Die geringen Anforderungen an die Probenvorbereitung der Methode erhöhen ihren Nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
DINeC enables soft, matrix-free desorption/ionization of complex biomolecules from surfaces, supporting real-time monitoring of chemical modifications without extensive sample preparation. This capability enhances target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing quantitative, fragmentation-free mass spectra of peptides and proteins at sub-monolayer sensitivity. The method’s compatibility with ion trap MSn allows for detailed structural elucidation, improving predictive confidence in lead identification and preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting intact molecular ions and subtle chemical changes in peptides and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking through soft desorption that preserves labile modifications, reducing false negatives in target engagement studies.
- Predictive Value: Provides quantitative surface coverage data down to 0.1% of a monolayer, aiding in portfolio triage based on target abundance and modification status.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers matrix-free, quantitative mass spectra that enable reliable detection of surface-bound analytes without ionization suppression.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via consistent cluster beam generation and ion trap transfer, minimizing run-to-run variability.
- Scalability: Facilitates platform reuse across diverse sample types, from organic extracts to engineered surfaces, supporting high-throughput screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables real-time observation of surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition, allowing kinetic analysis of biomolecular stability.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing continuous chemical information from surface adsorbates to bulk molecules under identical analytical conditions.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports go/no-go criteria by identifying degradation intermediates and reaction pathways that may impact drug candidate stability or efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
DINeC integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, particularly for studies requiring surface-sensitive, real-time monitoring of biomolecular interactions or modifications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting post-translational modifications and ligand-induced conformational changes on surfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible desorption of intact molecules, providing quantitative outputs for hit confirmation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Delivers high-resolution mass spectra and MSn capabilities that allow teams to compare molecular states, modification sites, and fragmentation patterns across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by monitoring time-dependent chemical changes in peptides and proteins under controlled thermal or chemical stress.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical capability across departments, reducing redundant method development and enabling cross-project data consistency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by preserving molecular integrity and enabling detection of labile species that may be lost in harsher ionization methods.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized cluster beam parameters and minimal sample handling, reducing technical variance.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by eliminating matrix requirements and enabling direct analysis of native samples, lowering consumable costs and preparation time.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions through real-time kinetic data on surface reactions, supporting early identification of liabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cluster beam generation, ion trap operation, and surface science principles for optimal setup and data interpretation.
- Needs access to a pulsed nozzle system, sulfur dioxide and helium gas handling infrastructure, and a compatible ion trap mass spectrometer with MSn capabilities.
- Demands cross-team standardization of sample mounting, substrate cleaning, and drying protocols to ensure surface homogeneity and reproducible desorption efficiency.
- Involves adaptation considerations when transitioning from model peptides to complex native samples or heterogeneous surfaces, necessitating surface coverage optimization.
- Includes practical limitations such as the need for ultra-high vacuum conditions and potential cluster fragmentation effects at higher impact energies, which must be controlled to maintain soft desorption.
