Name: Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Erfahren Sie, wie transzelluläre Proteinwechselwirkungen in HEK-293T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie semiquantitativ gemessen werden. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Adhäsionsmechanismen in der Neurobiologie.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Mental Health (R00MH103531 und R01MH116901 to J.A.), ein Predoctoral Training Grant vom National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.) und ein Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.) unterstützt. Wir danken Dr. Kevin Woolfrey für die Hilfe beim Mikroskop, Dr. K. Ulrich Bayer für den Einsatz seines Epifluoreszenzmikroskops und Thomas Südhof (Stanford University) für das LRRTM2-Plasmid.

1. Zellkultur und Transfektion
<ol><li>Herstellung von HEK-Zellmedien mit DMEM, 1x (Dulbecco es Modification of Eagle es Medium) ergänzt mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat und 10% FBS. Steriler Filter.</li>
	<li>Präbestimmen Sie geeignete Liganden und Rezeptoren für den Aggregationstest. HINWEIS: In dieser Studie wurden Neurexin3-SS4+/- und einer seiner bekannten Liganden, LRRTM2, verwendet. Liganden und Rezeptoren von Interesse wurden aus cDNAs in pcDNA3.1 ausgedrückt. Eine Gibson-Baugruppe wurde verwendet, um Neurexin3" in pcDNA3.112einzufügen. Neurexin3- F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTGAGCTCGGATCCGCCACCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCT GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>Bereiten Sie HEK293T-Zellen vor.<ol>
<li>Wachsen Sie HEK293T-Zellen, um in einem T-75-Kolben zu konfluenz.</li>
		<li>Einmal konfluent, 2 ml Trypsin verwenden und 2 min in 37 °C Inkubator geben. Fügen Sie dem Kolben 6 ml HEK-Medien hinzu, um Zellen wieder auszusetzen, und übertragen Sie alle 8 ml in ein 15 ml konisches Rohr.</li>
		<li>Pellet bei 500 x g für 5 min und resuspendieren in HEK-Zellmedien für insgesamt 8 ml.</li>
		<li>Zählen Sie Zellen und fügen Sie 735.000 Zellen in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte hinzu. Passen Sie die Endlautstärke mit HEK-Zellmedien auf 2 ml für jeden Brunnen an.</li>
		<li>In 37 °C-Inkubator geben und Zellen über Nacht oder bis zu 50-60% Konfluenz wachsen lassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfekte HEK293T-Zellen mit der Calciumphosphatmethode13.<ol>
<li>Transfekte gut-1 mit 3 g des von Interesse und Co-Transfekte mit 1 g fluoreszierendem Protein (3 g pcDNA3.1-Neurexin3-WT SS4- und 1 g mCherry).</li>
		<li>Transfekte gut-2 wie in Schritt 1.4.1. aber mit dem mutierten Protein von Interesse (pcDNA3.1-Neurexin3-A687T SS4-).</li>
		<li>Transfekte gut-3 mit 3 g des Liganden von Interesse und ko-transfekect mit 1 g eines anderen fluoreszierenden Proteins (3 g pcDNA3.1 LRRTM2 und 1 g GFP).</li>
		<li>Transfezieren Sie gut-4 und well-5 als Negativkontrollen: gut-4 mit 1 g GFP und gut-5 mit 1 g mCherry.</li>
		<li>Bereiten Sie eine weitere Platte (wie in Schritt 1.4.1-1.4.4) vor, wenn zusätzliche Bedingungen oder Kontrollen erforderlich sind (Neurexin3-WT/A687T SS4+). HINWEIS: Die Transfektionseffizienz wird 24 h nach der Transfektion unter einem Epifluoreszenzmikroskop analysiert und als Anzahl der Zellen quantifiziert, die das fluoreszierende Protein exzieren, mit dem sie transfiziert wurden. Ein schlankerer Ansatz würde die Transfektion von HEK-Zellen mit einem bikannronischen Vektor, der für ein fluoreszierendes Protein kodiert, und den Liganden von Interesse umfassen und wird oberhalb der Kotransfektion dringend empfohlen. Im Falle dieser Studie sind Alpha-Neurexine 4,3 kb und eine niedrige Fluoreszenzintensität wurde mit einem bicistronischen System beobachtet, das eine Kotransfektion erforderlich macht.</li>
	</ol></li>
	<li>48 Stunden nach der Transfektion Ernten Sie Zellen zur Aggregation.<ol>
<li>Waschen Sie jeden Brunnen zweimal mit PBS.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml 10 mM EDTA in PBS in jeden Brunnen ein, um Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen sanft zu dissoziieren und die Platte bei 37 °C für 5 min zu inkubieren. HINWEIS: Trypsin wird für Schritt 1.5.2 aufgrund einer möglichen proteolytischen Spaltung von Adhäsionsmolekülen in der Studie nicht empfohlen. Darüber hinaus kann das Protokoll nach der EDTA-Zugabe möglicherweise erst nach Abschluss angehalten werden, da Zellen nun Umgebungsbedingungen ausgesetzt sind.</li>
		<li>Tippen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, und ernten Sie jede gut in separaten 15 ml konischen Rohren.</li>
		<li>Zentrifugenkonrohre bei 500 x g und Raumtemperatur für 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Während zellenpelletieren, bereiten Sie 6 Inkubationsröhrchen vor, indem Sie die Oberseite jedes Mikrozentrifugenrohres mit jeder Bedingung beschriften. HINWEIS: Jede Permutation der GFP- und mCherry-Bedingungen sollte verwendet werden, um alle experimentellen Bedingungen und ordnungsgemäßen Kontrollen zu umfassen. Zum Beispiel: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3-WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3-A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3"WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3-A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Stellen Sie zusätzliche Rohre vor, um weitere Bedingungen und Kontrollen zu erfüllen.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 500 l HEK-Medien mit 10 mM CaCl2 und 10 mM MgCl2 auf 37 °C erwärmt. HINWEIS: Die Zugabe von CaCl2 und MgCl2 ermöglicht die Wiederherstellung der Bindung von Haftmolekülen und ist nur erforderlich, wenn die betreffenden transzellulären Interaktionspartner divalente Kationen zur Adhäsion benötigen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen in jedem 15 ml konischen Rohr mit einem Hämozytometer und aliquot 200.000 Zellen jeder Bedingung in ein geeignetes Rohr von Schritt 1.6.1 für eine 1:1-Mischung in einem Gesamtvolumen von 500 l. HINWEIS: Es sollte nur 5 min pro Bedingung zu zählen und aliquot Beträge.</li>
	<li>Röhren bei Raumtemperatur in einem langsamen Rohrrotator inkubieren.</li>
</ol>2. Bildaufnahme
<ol><li>Optimieren Sie die Aufnahmeparameter für mikroskopische Erfassungsparameter für bestimmte Proben. In diesem Beispiel wurden Bilder auf einem Weitfeldmikroskop aufgenommen. Verwenden Sie ein 5-faches Luftobjektiv (NA: 0,15; WD: 20000 m), um ein ausreichend großes Feld für die Analyse zu erhalten.</li>
	<li>Bewerten Sie die Basisaggregation unmittelbar nach dem Mischen der beiden Bedingungen von HEK-Zellen in Schritt 1.8. Dies sind jetzt die "Time Zero"-Bilder.<ol>
<li>Pipette 40 l jedes Probengemisches auf ein geladenes Mikroskopschlitten und Bild unter Fluoreszenz in den Kanälen 488 und 561.</li>
		<li>Erwerben Sie drei verschiedene Sichtfelder auf einer Fokusebene pro Stichprobenablage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erfassen Sie die endgültigen Bilder in 60 min als 'zeit 60' Bild.<ol>
<li>Um das "Zeit 60"-Bild des Gemischs nach einer 60 min Inkubation zu erhalten, nehmen Sie eine weitere 40-L-Probe jeder Bedingung aus rotierenden Rohren und Pipette jeder Probe auf einem geladenen Schlitten. Bild wie in Schritt 2.2.2. HINWEIS: Die Zellaggregation sollte alle 15 Min. überprüft werden, bis die Sättigung eintritt. Der Zeitpunkt der Aggregation hängt von den getesteten Proteinen ab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ImageJ/Fidschi-Analyse
<ol><li>Um das Ausmaß der Aggregation mit Fiji/ImageJ zu quantifizieren, speichern Sie Analysedateien.<ol>
<li>Speichern Sie die bereitgestellten ergänzungskodierungsdateien Dateien im Ordner imageJ-Makros auf dem Computer.</li>
		<li>Installieren Sie das bereitgestellte Aggregationsmakro (Plugins, Makros, Installieren und wählen Sie die Datei "AggregationAssay.txt".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie Schwellenwerte.<ol>
<li>Laden Sie eine 'Time Zero' .tif Datei in imageJ und teilen Sie die Kanäle auf (Bild | Farbe | Split-Kanäle). HINWEIS: Das Bild "Zeit Null" wird verwendet, um die Schwellenwerte und die kleinste Punktzeichengröße für das gesamte Experiment zu bestimmen.</li>
		<li>Maskieren Sie jeden Kanal(Plugins | Makros | AggregationAssay_MakeMask). Das Fenster "Maske aus Bild erstellen" wird angezeigt. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen neben Schwellenwert für Bild bestimmen und Clusterparams aus Histogramm bestimmen, und klicken Sie auf OK.</li>
		<li>Bestimmen Sie den Schwellenwert des Bildes mithilfe der Folienleiste, notieren Sie die Zahl rechts neben der Folienleiste, und klicken Sie auf OK.</li>
		<li>Es wird ein Histogramm der Clustergröße angezeigt. Wählen Sie eine Clustergröße aus dem Histogramm aus, das zum Experiment passt, geben Sie diese Zahl in das Feld Min ClusterGröße: ein, und klicken Sie auf OK. Cluster unterhalb dieser Größe werden nicht analysiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie die Analyse aus.<ol>
<li>Öffnen Sie das 'time 60'-Bild von Bedingung 1 in imageJ und teilen Sie die Kanäle wie in Schritt 3.2.1 auf.</li>
		<li>Maskieren Sie jeden Kanal (Plugins, Makros, AggregationAssay_MakeMask). Verwenden Sie den gleichen Schwellenwert und dieselbe Größe, die in Schritt 3.2.3 und Schritt 3.2.4 festgelegt wurden. Deaktivieren Sie die Felder neben Schwellenwert für Bild bestimmen und Clusterparams aus Histogramm bestimmen, und geben Sie die Größe und die Schwellenwerte manuell in die entsprechenden Felder ein, und klicken Sie dann auf OK.</li>
		<li>Berechnen sie denAggregationsindex (Plugins | Makros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Wählen Sie die maskierten Kanäle aus, in die verglichen werden soll, und das Verzeichnis, in das die resultierenden Dateien gespeichert werden sollen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.3.1–3.3.3 für jedes 'time 60'-Bild in jeder Bedingung. ANMERKUNG: Der Aggregationsindex ist definiert als die Gesamteoüberlappungsfläche geteilt durch die Summe der beiden Kanalbereiche abzüglich des Überlappungsbereichs multipliziert mit 100 (Aggregationsindex = Überlappungsfläche/[Fläche von Kanal 1 + Fläche von Kanal 2 – Überlappungsfläche] x 100). Diese Normalisierung ist ein "OR"-Vorgang zwischen den beiden maskierten Kanälen, die die Gesamtpixel in beiden Masken darstellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
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<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die Sezieren der Protein-Protein-Wechselwirkungen, die während der Zelladhäsion im Trans auftreten, kann zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die grundlegenden zellulären Prozessen zugrunde liegen, einschließlich der Bildung, Funktion und Wartung von Synapsen während der Reifung und des Umbaus. Die Implikationen von Zell-zu-Zell-Interaktionen gehen über die Neurobiologie hinaus und spielen eine breitere Rolle bei der Signaltransduktion, Zellmigration und Gewebeentwicklung14<...

Synaptische Wechselwirkungen, die durch synaptische Adhäsionsmoleküle erleichtert werden, sind die Grundlage für die Entwicklung, Organisation, Spezifikation, Wartung und Funktion von Synapsen und die Erzeugung von neuronalen Netzwerken. Die Identifizierung dieser transsynaptischen Zelladhäsionsmoleküle nimmt rapide zu; Daher ist es von grundlegender Bedeutung, verbindliche Partner zu identifizieren und zu verstehen, wie diese neuen Adhäsionsmoleküle miteinander interagieren. Zusätzlich hat die Genomsequenzierung Mutationen in vielen dieser Adhäsionsmoleküle identifiziert, die häufig mit einer Vielzahl von neuroentwicklungsbedingten, neuropsychiatrischen und Suchterkrankungen verbunden sind1. Mutationen in Genen, die für synaptische Zelladhäsionsmoleküle kodieren, können Trans-Wechselwirkungen nachteilig verändern und zu pathophysiologischen Veränderungen bei der Synapsenbildung und-Erhaltung beitragen.
Es gibt mehrere Assays zur quantitativen Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen wie isotherme Kalorimetrie, kreisförmiger Dichroismus, Oberflächen-Plasmonresonanz2 und obwohl quantitativ, haben sie mehrere Einschränkungen. Erstens benötigen sie rekombinantes Protein, das manchmal langwierige und mühsame Reinigungsschritte erfordert. Zweitens erfordern sie eine ausgeklügelte Spezialausrüstung und technisches Know-how. Drittens können sie das Bindungsgrad überschätzen, da sie sowohl cis- als auch Trans-Wechselwirkungen zwischen Proteinen ermöglichen, die natürlicherweise in vivo an eine Membran gebunden sind. Hier schlagen wir einen einfachen und relativ schnellen Assay vor, der ausschließlich Trans-Interaktionen testet.
Um viele der Komplikationen im Zusammenhang mit gereinigten Protein-Assays zu umgehen, haben wir einen zellbasierten Protein-Interaktionstest optimiert, der Trans-Interaktionen in einem reduzierten heterologen Zellsystem rekapituliert. Dieser Assay wurde zuvor in verschiedenen Formen verwendet, um transzelluläre Wechselwirkungen zu untersuchen. Bei diesem Ansatz werden Kandidatenzelladhäsionsmoleküle in HEK293T-Zellen transfiziert. Unter physiologischen Bedingungen weisen HEK293T-Zellen keine Selbstaggregation auf, so dass sie beispielhafte Modelle für diesen Test aufweisen. Wenn jedoch einzelne Populationen von HEK-Zellen, die Rezeptor und Liganden exexegieren, kombiniert werden, erzwingt die Bindung des Rezeptors und des Liganden die Aggregation von HEK-Zellen. Diese Aggregation wird ausschließlich durch Transinteraktionen vermittelt und ist in der Regel in Dutzenden von Minuten beobachtbar. Bei dieser Methode sind keine Proteinreinigungsschritte erforderlich, und die Effizienz der Methode beruht auf dem Paradigma, dass Populationen von HEK-Zellen, die Cognate-Adhäsionsmoleküle exdrücken, kombiniert und dann nur zig Minuten später abgebildet werden. Darüber hinaus ist diese Methode relativ kostengünstig, da weder Antikörper noch kostspielige Ausrüstung erforderlich sind. Die einzige Ausrüstung, die für die Erfassung von Daten benötigt wird, ist ein Standard-Fluoreszenzmikroskop. Ein weiterer Vorteil dieses zellbasierten Assays ist die Fähigkeit, die Wirkung krankheitsrelevanter Punktmutationen auf Trans-Wechselwirkungen schnell zu untersuchen. Dies kann durch Transfizieren von HEK-Zellen mit cDNAs der mutierten Varianten des Proteins von Interesse durchgeführt werden.
In diesem Protokoll stellen wir ein Beispiel vor, in dem wir untersuchen, ob sich eine Missense-Mutation in Neurexin3 "(Neurexin3"A687T), die bei einem Patienten mit einer tiefen geistigen Behinderung und Epilepsie identifiziert wurde, wechselwirkungen im Trans mit Leucin-reichem Repeat-Transmembranprotein 2 (LRRTM2) verändert. Neurexin3 ist ein Mitglied der evolutionär konservierten Familie von präsynaptischen Zelladhäsionsmolekülen und während neuere Arbeiten mehrere Rollen an der Synapseidentifizierthaben 3,4,5,6,7, bleibt unser synaptisches Verständnis dieses Moleküls und aller Mitglieder der Neurexin-Familie unvollständig. LRRTM2 ist ein exzitatorisches postsynaptisches Zelladhäsionsprotein, das an der Synapsenbildung und-erhaltung8,9,10teilnimmt. Wichtig ist, dass LRRTM2 ausschließlich mit Neurexin-Isoformen interagiert, denen die Spleißstelle 4 alternatives Exon (SS4-) fehlt, aber nicht mit Neurexin-Isoformen, die die Spleißstelle 4 alternatives Exon (SS4+) enthalten. Die menschliche Missense-Mutation (A687T), die in Neurexin3 identifiziert wurde, befindet sich in einer nicht untersuchten extrazellulären Region, die evolutionär konserviert ist und zwischen allen Alpha-Neurexinenkonserviertwird 7 . Da die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Molekülen8,9,11festgestellt wurde, stellten wir die Frage: Wird die Bindungsfähigkeit von Neurexin3' SS4- zu LRRTM2 durch eine A687T-Punktmutation verändert? Dieser Test ergab, dass die A687T-Punktmutation unerwartet die Aggregation von Neurexin3zu LRRTM2 verbesserte, was darauf hindeutet, dass die extrazelluläre Region, in der sich die Punktmutation befindet, eine Rolle bei der Vermittlung transsynaptischer Wechselwirkungen spielt.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Einweg-Mikroröhrchen mit Schnappverschlüssen</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>Inkubation einer gemischten Population von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&ndash; Durchflussfiltereinheit, 0,2 μm aPES-Membran</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>Sterilisation von HEK-Medien</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube Zentrifugenröhrchen</td><td>Ward' s Science</td><td>470224-998</td><td>Ernte von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>6 gut sterile Gewebekulturplatten</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>Kultivierung von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Transfektion von Calciumphosphat, HEK-Zellresuspension</td></tr><tr><td>Zentrifuge- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laborprodukte</td><td>75004377</td><td>Ernte von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>CO2-Zellinkubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Inkubation von HEK-Zellen während des Wachstums</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) mit 4,5 g/L Glukose, L-Glutamin & Natriumpyruvat</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK-Zellerhaltung</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Passieren/Ernten von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>Ernte von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>Falcon Belüftete Kulturflaschen, 75 cm2 Wachstumsbereich</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>Kultivierung von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK-Zellerhaltung</td></tr><tr><td>HEK293T Zellen</td><td>ATCC</td><td></td><td>Modellsystem</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Bildanalyse</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid-Hexahydrat</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK-Zellresuspension</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei</td><td>Fisher BioReagenzien</td><td>BP332-500</td><td>Transfektion von Calciumphosphat</td></tr><tr><td>Trypsin 0,25% (1X) Lösung</td><td>GE Gesundheitswesen Leben Sciences</td><td>SH30042.01</td><td>Passgierende HEK-Zellen</td></tr><tr><td>Röhrenrotator</td><td></td><td></td><td>Inkubation einer gemischten Population von HEK-Zellen</td></tr><tr><td>UltraClear-Objektträger. Weiß mattiert, positiv geladen</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Bildaufnahme</td></tr><tr><td>Weitfeldmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Bildaufnahme</td></tr></tbody></table>

messung transzellulärer wechselwirkungen durch proteinaggregation in einem heterologen zellsystem

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Protein-Wechselwirkungen an zellulären Schnittstellen diktieren eine Vielzahl von biologischen Ergebnissen, die von der Gewebeentwicklung und Krebsprogression bis hin zur Synapsenbildung und -erhaltung reichen. Viele dieser grundlegenden Wechselwirkungen treten bei Trans auf und werden typischerweise durch heterophile oder homophile Wechselwirkungen zwischen Zellen induziert, die membranverankerte Bindungspaare exdrücken. Die Aufklärung, wie krankheitsrelevante Mutationen diese grundlegenden Proteinwechselwirkungen stören, kann Einen Einblick in eine Vielzahl von Zellbiologiefeldern geben. Viele Protein-Protein-Interaktions-Assays sind in der Regel nicht uneindeutig zwischen cis und Trans-Wechselwirkungen, was potenziell zu einer Überschätzung des In-vivo-Bindungsumfangs führt und eine arbeitsintensive Reinigung von Protein- und/oder spezialisierten Überwachungsgeräten beinhaltet. Hier präsentieren wir ein optimiertes einfaches Protokoll, das die Beobachtung und Quantifizierung von nur Trans-Wechselwirkungen ohne langwierige Proteinreinigungen oder spezielle Geräte ermöglicht. Der HEK-Zellaggregationstest beinhaltet das Mischen von zwei unabhängigen Populationen von HEK-Zellen, die jeweils membrangebundene Cognateligaden exdrücken. Nach einer kurzen Inkubationszeit werden Proben abgebildet und die resultierenden Aggregate quantifiziert.

Die A687T-Mutation erhöht die Neurexin3-SS4-Bindung an LRRTM27 Um zu untersuchen, wie interzelluläre Wechselwirkungen zweier bekannter synaptischer Proteine durch die Einführung einer Punktmutation bei einem Patienten mit geistiger Behinderung und Epilepsie beeinflusst werden, verwendeten wir den oben genannten HEK-Zellaggregationstest (Abbildung 1). Die Zellen wurden gemäß Abschnitt 1 transfiziert und für die Bildgebung gemäß den Abschnitten 1 und 2 des Protok...

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Der zellbasierte Assay ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung von Transadhäsionswechselwirkungen, ohne dass langwierige Proteinaufreinigungen oder spezielle Geräte erforderlich sind. Obwohl die hier getesteten Proteininteraktionen für die Neurobiologie relevant sind, kann diese Methode auf jeden Forschungsbereich angewendet werden, in dem die Proteinadhäsion interzellulär stattfindet. 48 Stunden nach der Transfektion der HEK-293T-Zellen ernten Sie die Zellen aus der Sechs-Well-Platte zur Aggregation.Zuerst waschen Sie jedes Mal gut mit PBS. Um die Zellen vorsichtig zu trennen, fügen Sie als Nächstes einen Milliliter 10 Millimolar EDTA in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte dann bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Minuten Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, und ernten Sie jede Vertiefung in ein separates konisches 15-Milliliter-Röhrchen.Die Röhrchen werden bei 500 x g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert. Während die Zellen pelletieren, bereiten Sie sechs Inkubationsröhrchen vor, indem Sie die Oberseiten der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Versuchsbedingungen beschriften. Jede Permutation von GFP und mCherry sollte verwendet werden.Entfernen Sie den Überstand aus den konischen 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Medium. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellen in jedem konischen Röhrchen. Aliquotieren Sie dann 200.000 Zellen aus jeder Bedingung in das entsprechende Inkubationsröhrchen für eine Eins-zu-Eins-Mischung mit einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern.Nachdem Sie die im nächsten Abschnitt beschriebene Baseline-Aggregation beurteilt haben, legen Sie die Inkubationsröhrchen bei Raumtemperatur in einen langsamen Röhrchenrotator. Um die Aggregation zu beurteilen, pipettieren Sie zu Studienbeginn und erneut nach 60 Minuten 40 Mikroliter aus dem Inkubationsröhrchen auf einen geladenen Objektträger. Die Baseline-Erfassung sollte so schnell wie möglich nach der Zugabe von Zellen in das Mikrozentrifugenröhrchen erfolgen.Stellen Sie den Objektträger unter Fluoreszenz sowohl im grünen als auch im roten Kanal dar. Nehmen Sie für jede Folie Bilder von drei verschiedenen Sichtfeldern in einer Fokusebene auf. HEK-293T-Zellen wurden mit einem Protein von Interesse, einem mutierten Protein von Interesse oder einem Liganden von Interesse transfiziert und mit einem fluoreszierenden Protein co-transfiziert.Zellpopulationen, die das Protein von Interesse exprimieren, wurden mit Zellpopulationen, die den interessierenden Liganden exprimieren, gemischt und nach 60 Minuten auf Aggregation untersucht. In Überlagerungen von Bildern, die im grünen und roten Kanal aufgenommen wurden, wird die Aggregation als gelbe Punktzahl angezeigt. Bedingungen, unter denen Zellen keine synaptischen Liganden exprimierten, zeigten eine minimale Aggregation.Auch wurde eine minimale Aggregation gezeigt, wenn nur eine der beiden Populationen synaptische Liganden exprimierte. Es zeigte sich keine Aggregation, wenn die beiden Zellpopulationen inkompatible Adhäsionsmoleküle exprimierten. Die Bedingungen mit kompatiblen Adhäsionsmolekülen zeigten nach einer 60-minütigen Inkubation eine signifikante Aggregation.Überraschenderweise zeigte das mutierte Protein von Interesse signifikant mehr Aggregation als sein Wildtyp-Gegenstück, was darauf hindeutet, dass die Punktmutation die Bindungsfähigkeiten des Proteins erhöht. Mutationen in vielen Adhäsionsmolekülen werden häufig mit neurologischen Entwicklungs-, neuropsychiatrischen und Suchtstörungen in Verbindung gebracht. Mit dieser Technik kann man die Auswirkungen von krankheitsrelevanten Punktmutationen auf trans-Interaktionen untersuchen.

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Research

Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

In diesem Video demonstrieren wir einen zellbasierten Proteinaggregationsassay mit Proteasom-Inhibitoren, die die Proteasomaktivität blockieren und verhindern, dass fehlgefaltete, mutierte Proteine, die mit einer fluoreszierenden Markierung fusioniert sind, einen Ubiquitin-abhängigen proteasomalen Abbau durchlaufen, was zu ihrer Akkumulation im Zellzytoplasma führt. Anschließend werden die Proteinaggregate mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht und quantifiziert.

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In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Messung transzellulärer Wechselwirkungen zwischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen durch den HEK-Zellaggregationsassay. In diesem Assay wird eine gleiche Anzahl von HEK-Zellen, die ein gewünschtes präsynaptisches Zelladhäsionsmolekül exprimieren, und ein fluoreszierendes Protein mit HEK-Zellen gemischt, die ein postsynaptisches Zelladhäsionsmolekül und ein weiteres fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Wechselwirkung zwischen den...

Zellaggregationsassay zum Nachweis von Trans-Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen

In diesem Video demonstrieren wir die In-Zell-Kernspinresonanzspektroskopie-Technik, um Protein-Liganden-Wechselwirkungen zwischen unmarkierten, überexprimierten Proteinen und kleinen Molekülen zu untersuchen. Die erfolgreiche Liganden-Protein-Wechselwirkung wird visuell durch das Auftreten eines zusätzlichen Satzes von Peaks im interessierenden Spektralbereich bestätigt, der die ursprünglichen Peaks allmählich ersetzt.

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Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Die Oligomerisierung des Ryanodinrezeptors, eines homo-tetrameren Ionenkanals, der die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern vermittelt, ist entscheidend für die Kontraktion von Skelett- und Herzmuskeln. In dieser Arbeit stellen wir komplementäre in vivo und in vitro Methoden zum Nachweis der Selbstassoziation von Proteinen und zur Bestimmung der Homo-Oligomer-Stöchiometrie vor.

Genetische und biochemische Ansätze für<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Beurteilung von Protein Oligomerisierung: Der Ryanodinrezeptor Case Study

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

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Überwachung der Proteinaggregationskinetik in vivo mittels automatisierter Einschlusszählung bei Caenorhabditis elegans

Hier beschreiben wir eine Methode zur bakteriellen Koexpression von differentiell markierten Proteinen unter Verwendung einer Reihe kompatibler Vektoren, gefolgt von den konventionellen Pulldown-Techniken zur Untersuchung von Proteinkomplexen, die sich in vitro nicht zusammensetzen können.

Pulldown-Assay gekoppelt mit Co-Expression in Bakterienzellen als zeiteffizientes Werkzeug zum Testen anspruchsvoller Protein-Protein-Interaktionen

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Einzelmolekülmessung der Proteininteraktionsdynamik in biomolekularen Kondensaten

Erfahren Sie, wie transzelluläre Proteinwechselwirkungen in HEK-293T-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie semiquantitativ gemessen werden. Diese Methode ermöglicht die schnelle Analyse von Adhäsionsmechanismen in der Neurobiologie.

Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem

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