Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem
22. Mai 2020
Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Der zellbasierte Assay ermöglicht die Beobachtung und Quantifizierung von Transadhäsionswechselwirkungen, ohne dass langwierige Proteinaufreinigungen oder spezielle Geräte erforderlich sind. Obwohl die hier getesteten Proteininteraktionen für die Neurobiologie relevant sind, kann diese Methode auf jeden Forschungsbereich angewendet werden, in dem die Proteinadhäsion interzellulär stattfindet. 48 Stunden nach der Transfektion der HEK-293T-Zellen ernten Sie die Zellen aus der Sechs-Well-Platte zur Aggregation.
Zuerst waschen Sie jedes Mal gut mit PBS. Um die Zellen vorsichtig zu trennen, fügen Sie als Nächstes einen Milliliter 10 Millimolar EDTA in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte dann bei 37 Grad Celsius. Nach fünf Minuten Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um die Zellen zu lösen, und ernten Sie jede Vertiefung in ein separates konisches 15-Milliliter-Röhrchen.
Die Röhrchen werden bei 500 x g bei Raumtemperatur fünf Minuten lang zentrifugiert. Während die Zellen pelletieren, bereiten Sie sechs Inkubationsröhrchen vor, indem Sie die Oberseiten der Mikrozentrifugenröhrchen mit den Versuchsbedingungen beschriften. Jede Permutation von GFP und mCherry sollte verwendet werden.
Entfernen Sie den Überstand aus den konischen 15-Milliliter-Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Medium. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellen in jedem konischen Röhrchen. Aliquotieren Sie dann 200.000 Zellen aus jeder Bedingung in das entsprechende Inkubationsröhrchen für eine Eins-zu-Eins-Mischung mit einem Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern.
Nachdem Sie dieim nächsten Abschnitt beschriebene Baseline-Aggregation beurteilt haben, legen Sie die Inkubationsröhrchen bei Raumtemperatur in einen langsamen Röhrchenrotator. Um die Aggregation zu beurteilen, pipettieren Sie zu Studienbeginn und erneut nach 60 Minuten 40 Mikroliter aus dem Inkubationsröhrchen auf einen geladenen Objektträger. Die Baseline-Erfassung sollte so schnell wie möglich nach der Zugabe von Zellen in das Mikrozentrifugenröhrchen erfolgen.
Stellen Sie den Objektträger unter Fluoreszenz sowohl im grünen als auch im roten Kanal dar. Nehmen Sie für jede Folie Bilder von drei verschiedenen Sichtfeldern in einer Fokusebene auf. HEK-293T-Zellen wurden mit einem Protein von Interesse, einem mutierten Protein von Interesse oder einem Liganden von Interesse transfiziert und mit einem fluoreszierenden Protein co-transfiziert.
Zellpopulationen, die das Protein von Interesse exprimieren, wurden mit Zellpopulationen, die den interessierenden Liganden exprimieren, gemischt und nach 60 Minuten auf Aggregation untersucht. In Überlagerungen von Bildern, die im grünen und roten Kanal aufgenommen wurden, wird die Aggregation als gelbe Punktzahl angezeigt. Bedingungen, unter denen Zellen keine synaptischen Liganden exprimierten, zeigten eine minimale Aggregation.
Auch wurde eine minimale Aggregation gezeigt, wenn nur eine der beiden Populationen synaptische Liganden exprimierte. Es zeigte sich keine Aggregation, wenn die beiden Zellpopulationen inkompatible Adhäsionsmoleküle exprimierten. Die Bedingungen mit kompatiblen Adhäsionsmolekülen zeigten nach einer 60-minütigen Inkubation eine signifikante Aggregation
.Überraschenderweise zeigte das mutierte Protein von Interesse signifikant mehr Aggregation als sein Wildtyp-Gegenstück, was darauf hindeutet, dass die Punktmutation die Bindungsfähigkeiten des Proteins erhöht. Mutationen in vielen Adhäsionsmolekülen werden häufig mit neurologischen Entwicklungs-, neuropsychiatrischen und Suchtstörungen in Verbindung gebracht. Mit dieser Technik kann man die Auswirkungen von krankheitsrelevanten Punktmutationen auf trans-Interaktionen untersuchen.
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Überblick
Diese Studie präsentiert ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen in trans unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskopie-Ansatzes in HEK-293T-Zellen. Die Methode ermöglicht die Quantifizierung von Protein-Adhäsionsinteraktionen, die für die Neurobiologie und potenziell andere Forschungsbereiche relevant sind.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurobiologie
- Zelladhäsion
- Proteininteraktionen
Hintergrund
- Ligand-Rezeptor-Interaktionen sind entscheidend für die zelluläre Kommunikation.
- Das Verständnis dieser Interaktionen hilft, Mechanismen neurodevelopmentaler und neuropsychiatrischer Störungen zu erklären.
- Traditionelle Methoden erfordern möglicherweise umfangreiche Proteinreinigung oder spezialisierte Ausrüstung.
- Diese Studie schlägt einen effizienteren Ansatz unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie vor.
Ziel der Studie
- Entwicklung eines schnellen und effektiven Protokolls für die Untersuchung von Proteinadhäsion in einem zellbasierten Assay.
- Beurteilung, wie Punktmutationen in Proteinen trans-Interaktionen beeinflussen.
- Anwendung dieser Methode breit in Proteinadhäsionsstudien außerhalb der Neurobiologie.
Verwendete Methoden
- Fluoreszenzmikroskopie wurde für die Bildgebung von Zellinteraktionen eingesetzt.
- HEK-293T-Zellen wurden als biologisches Modell verwendet, wobei der Fokus auf transfizierten Proteinen und Liganden lag.
- Der experimentelle Zeitplan umfasste die Beurteilung der Zellaggregation nach 60 Minuten post-Transfektion.
- Die Zellzählung wurde mit einem Hämozytometer durchgeführt, gefolgt von Zellresuspendierung und Mischen für die Bildgebung.
Hauptergebnisse
- Die Aggregation von Zellen, die kompatible Adhäsionsmoleküle exprimieren, war nach 60 Minuten signifikant verstärkt.
- Mutierte Proteine zeigten eine größere Aggregation im Vergleich zu Wildtyp-Gegenstücken, was auf verbesserte Bindungsfähigkeiten hinweist.
- Minimale Aggregation wurde beobachtet, wenn entweder keine oder nur eine Population synaptische Liganden exprimierten.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine optimierte Methode zur Bewertung interzellulärer Adhäsionsinteraktionen.
- Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial dieser Technik zur Untersuchung der Auswirkungen von Mutationen auf Proteininteraktionen.
- Die Erkenntnisse aus dieser Methode sind wertvoll für das Verständnis der Mechanismen, die verschiedenen neurodevelopmentalen und psychologischen Störungen zugrunde liegen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
