Name: Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit Bead-Aggregationsassays die Adhäsionseigenschaften von Zelladhäsionsmolekülen charakterisieren. Diese schnelle Methode nutzt Protein-G-Magnetperlen, um homophile Adhäsion direkt zu testen.

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Diese Arbeit wurde durch einen NSF/ARRA-Preis (IOS 0920357) und einen Preis des NIH (5R21MH098463) unterstützt.

1. Zellpräparation (Tag -2 bis 0) <ol><li> Split HEK293-Zellen 1: 5 unter Verwendung von 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung und Inkubation in Wachstumsmedium bei 37 ° C mit 5% CO 2, bis 60 bis 80% konfluent (2 - 3 Tage). Für jede Bedingung Kulturzellen in 2 x 100-mm-Schalen. </li></ol> 2. Zell Transfektion (Tag 1) <ol><li> Transfektion von HEK293-Zellen mit Plasmid-Codierung Fc-Fusion mit einem Transfektionsreagenz Lipofectamine wie. Alternative Methoden, die in vergleichbaren Transfektionseffizienzen führen, können ebenfalls verwendet werden. </li><li> Rück transfizierten Zellen für 24 Stunden Inkubator. </li></ol> 3. Zellvermehrung (Tag 2) <ol><li> Vorheiz Growth Medium ohne fötales Rinderserum (-FBS) bis 37 ° C beträgt. </li><li> Spülen Geschirr 2x mit 10 ml Wachstumsmedien -FBS, und geben die Gerichte an die 37 ° C-Inkubator für 1 Stunde. </li><li> Spülen der Kulturen Geschirr noch einmal mit 10 ml Wachstumsmedien -FBS, für insgesamt 3 Waschungen. </li><li> IncuBeize die transfizierten HEK293-Zellen bei 37 ° C für weitere 48 h ohne FBS vor dem Sammeln Medien. </li></ol> 4. Bead Aggregation (Tag 4) <ol><li> Medien von Kulturschalen sammeln, übertragen Sie Medien von jedem Paar von Gerichten zu 50 ml konischen Röhrchen und Spin bei 500 g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren. </li><li> Filtermedien 50 ml konischen Röhrchen in ein Zentrifugalfilter mit einer 30 ml Spritze und 0,45 um-Spritzenfilter. </li><li> Spin Zentrifugalfilter bei 4.000 × g und 4 ° C bis zum Volumen der konzentrierten Kulturmedium beträgt etwa 500 ul (etwa 15 min). Wiederholen, bis alle Kulturmedien wurde hinzugefügt und eingeengt. </li><li> Fügen 1,5 ul Protein G magnetischen Kügelchen auf 1 ml eiskaltem Bindungspuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe, auf ein Magnet und entfernen Puffer. Sofort die geballte Kulturmedien, um das Protein G magnetischen Beads hinzuzufügen. </li><li> Drehen Röhrchen bei 4 ° C für 2 Stunden. </li><li> PlAss Rohre auf einem Magneten und Medien zu entfernen. Waschen schnell Perlen zweimal mit eiskaltem 1 ml Binding Buffer, und dann wieder zu suspendieren Perlen in 300 ul Binding Buffer. </li><li> Split resuspendiert Perlen in 2 Röhren, 150 ul in jedes Rohr, und fügen Sie 1,5 ul 200 mM CaCl 2 oder 200 mM EDTA für die &quot;Calcium&quot; und &quot;kein Kalzium&quot; Bedingungen auf. </li><li> Transfer 100 ul von jedem Zustand in einen Depression gut schieben und sammeln mikroskopischen Aufnahmen mit einem Durchlichtmikroskop (Abbildung 2). Sammeln Sie Bilder von 5 Sichtfelder für jedes Experiment an jedem gewünschten Zeitpunkt. </li></ol> 5. Datenanalyse <ol><li> Mit ImageJ oder vergleichbare Bildanalyse-Software, öffnen Sie eine der fünf Bilddatensätze mit dem Import / Bildsequenz ... aus dem Pulldown-Menü Datei. Diese werden als Bildstapels geöffnet werden. </li><li> Im Dialogfeld Bild ... / Eigenschaften, ändern Sie die iMagier Einheiten auf Pixel und setzen Pixel Breite und Höhe bis 1,0 Pixel. </li><li> Konvertieren Sie die Bilder in dual mit dem Anpassen / Schwellenwert ...-Befehl in der Bild Pulldown-Menü. Stellen Sie den Schwellenwert auf Pixel, die Perlen oder Perlen Aggregate beitragen, umfassen, aber das auszuschließen Hintergrund und kleinen Partikeln. Gelten für alle Bilder im Stapel. </li><li> Im Dialogfeld Set Maße, überprüfen Sie die Umgebung und Stack Position Boxen. </li><li> Analyze Particles ... in der Analyse Pulldown-Menü. Dadurch wird eine Liste der identifizierten Partikel, einschließlich ihrer Größe (Fläche) und das Bild in der sie erkannt zu generieren. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für die Experimente und Versuchsbedingung. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
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<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
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<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
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<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zelladhäsion ist ein wesentliches Merkmal der vielzelligen Leben und wird von einem breiten Spektrum von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Von diesen sind die detaillierten Klebeeigenschaften nur für einen relativ kleinen Anteil verstanden. Hier haben wir ein einfaches, schnelles Protokoll zur Untersuchung der homophile Haftfähigkeit von sekretierten Ektodomänen in einem geeigneten Epitop-Tag fusioniert beschrieben. Dieser Ansatz hat eine Reihe von wichtigen Vorteilen. Zuerst werden die stabilen Zelllinien nicht erfo...

Zell-Zell-Adhäsion ist wesentlich für die Entwicklung und die Integrität von mehrzelligen Organismen und durch eine Vielfalt von Zelloberflächenmolekülen vermittelt. Viele dieser Adhäsionsmoleküle wurden identifiziert und charakterisiert, obwohl viele noch zu entdecken sind. Verschiedene Methoden werden verwendet, um die Eigenschaften von Zelladhäsionsmolekülen (CAMs), einschließlich Zellsortierung Assays, Zellaggregationsassays 1-8 und biophysikalische Methoden, wie die Rasterkraftmikroskopie und Oberflächenkraftspektroskopie 9-12 untersuchen. Die Komplexität auch in vitro-Systemen unter Verwendung von Zelllinien vereinfacht macht es schwierig, die Hafteigenschaften eines mutmaßlichen CAM bestimmen. Typischerweise wird ein Molekül als ein CAM, wenn die Zellaggregation induziert, wenn sie in einem nicht-klebenden Zelllinie transfiziert. Es ist jedoch klar, dass dies keine direkte Hinweise auf Haftungsaktivität. Beispielsweise erleichtert die Zelloberfläche Lieferung oder Stabilität einesCAM würde auch zu einer erhöhten Zellaggregation 1,13 führen. Darüber hinaus kann eine wahre CAM nicht, Zellaggregation vermitteln, wenn die Zelllinie fehlt anderen Co-Faktoren für Zelloberflächen Lieferung oder Stabilisierung erforderlich. Um diese erschwerenden Faktoren zu vermeiden, mehr direkte Assays eingesetzt werden, die auf der Idee basieren, dass adhäsive Wechselwirkungen sollte eine intrinsische biochemische Eigenschaft der extrazellulären Domäne sein. Während Perlen wurden zunächst zur Ng-CAM 2 zu charakterisieren, haben diese Tests, um Cadherin-vermittelte Adhäsion 12,14,15 untersuchen erweitert. Verwendung Fusion des C-Cadherin-Ektodomäne-Fc-Fusionen zeigten die Gumbiner Labor dass mehrere Cadherin Wiederholungen tragen zu Interaktionen 14 homo. Mit vergleichbaren Wulst Aggregationstests, E-Cadherin und N-Cadherin-Haft wurden ebenfalls gekennzeichnet 12,15, als eine Reihe von Protocadherinen 1,15-18 und Dscam Isoformen von Drosophila haben <em&gt; 19. Hier beschreiben wir einen relativ einfachen und schnellen Test zur Charakterisierung der Klebstoff Aktivität sezerniert Epitop markierte Ektodomäne von mutmaßlichen homo Nocken (Abbildung 1). Wir haben diesen Test verwendet hauptsächlich die Mitglieder der Cadherin-Oberfamilie charakterisieren.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>Einzureichen</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 Zellen</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash; Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-10-Membran</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm</td><td>Spritzenfilter Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fidschi (ImageJ) Bildanalysesoftware</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a><</td><td></td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Tabelle der Puffer/Lösungen</td></tr><tr><td>Wachstumsmedien</td><td>DMEM + 10% FBS + Pen-Strep</td><td>Filter: Sterilisieren und lagern bei 4 °C.</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsmedien &ndash; FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep Filter</td><td>sterilisieren und lagern bei 4 °C.</td><td></td></tr><tr><td>Bindungspuffer</td><td>50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA</td><td>Vortex bis zum Auflösen, auf Eis halten.</td><td></td></tr></tbody></table>

wulst aggregationsassays zur charakterisierung von putativen zelladhäsionsmoleküle

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Zell-Zell-Adhäsion ist von grundlegender Bedeutung für Vielzeller und wird durch eine Vielfalt von Zelloberflächenproteinen vermittelt. Jedoch sind die adhäsiven Wechselwirkungen vieler dieser Proteine ​​schlecht verstanden. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der Hafteigenschaften von mutmaßlichen homophile Zell-Adhäsionsmoleküle. Kultivierten HEK293-Zellen mit Plasmid-DNA, kodierend eine sekretierte, Epitop-tagged Ektodomäne eines Zelloberflächenprotein transfiziert. Unter Verwendung von für die Epitop-Markierung funktionalisierten Kügelchen wird das lösliche, sekretierte Fusionsprotein aus dem Kulturmedium festgehalten. Die beschichteten Perlen können dann direkt in Perlenaggregationstests oder fluoreszierende Perle Sortier Assays für homophile Adhäsion zu prüfen. Falls gewünscht, kann die Mutagenese dann verwendet, um die spezifische Aminosäuren oder Domänen für die Haftung erforderlichen aufzuklären. Dieser Test erfordert nur geringe Mengen an exprimiertem Protein, nicht die Herstellung von stabilen Zelllinien erfordern, und kann acco werdeninnerhalb von 4 Tagen mplished.

Ein Beispiel ist in Abbildung 2, die Kalzium-abhängige Aggregation zeigt Wulst von der Ektodomäne von N-Cadherin-Fc (NcadEC-Fc) fusioniert dargestellt. In Abwesenheit von Calcium, Perlen weisen eine geringe oder keine Tendenz zu aggregieren, und es gibt keine Zunahme der Gesamtgröße mit der Zeit (1A, C). In Anwesenheit von Calcium, Perlen mit NcadEC-Fc-Show robust Aggregation beschichtet, mit Aggregatgröße über die Zeit (Abbildung 1B, C) ​​zu. Dieses Experiment wurde dr...

Hier präsentieren wir eine einfache, schnelle Methode zur Charakterisierung der intrinsischen Adhäsionseigenschaften von mutmaßlichen Zelladhäsionsmolekülen. Die sezernierte, mit Epitopen markierte Ektodomäne eines Zelladhäsionsmoleküls wird aus dem Kulturmedium auf kleinen, einheitlich funktionalisierten Kügelchen eingefangen. Diese Kügelchen können dann sofort in einfachen Bead-Aggregations-Assays verwendet werden.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit von Protein-Ektodomänen zu testen, homophile Adhäsion zu vermitteln, um dies zu erreichen: Plasmide, die für die Fusion eines Ektodomänenfragments mit der FC-Region von humanem IgG kodieren, werden in HEC 2 93 Zellen transfiziert. Die sezernierten Odin FC-Fusionsproteine werden auf magnetischen Kügelchen eingefangen, die an Protein G konjugiert sind, und nach einem Waschen werden die beschichteten Kügelchen in Lösung interagieren lassen. Die beschichteten Kügelchen werden dann abgebildet, um das Ausmaß der Aggregation zu beurteilen, und schließlich quantifiziert. Mit einer einfachen Bildanalyse zeigen die resultierenden Daten, ob das Protein in der Lage ist, homophile Adhäsion zu vermitteln.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zellaggregationsassays besteht darin, dass sie schnell und einfach ist und die Adhäsionsaktivität des von Ihnen gewählten Proteins direkt testet. Diese Technik wird von Dr. Michelle Eman, einer leitenden Wissenschaftlerin des Labors, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die kultivierten Zellen zwei bis drei Tage vor der Transfektion für NCA hier ECFC vorbereiten.Verwenden Sie 0,05 %-Trips in EDTA, um die HEC 2 93-Zellen von den Kulturschalen zu lösen. Bereiten Sie für jede Bedingung zwei 100-Millimeter-Gerichte vor. Teilen Sie die Zellen eins bis fünf und kultivieren Sie sie dann ein.Ergänztes Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bis sie zu 60 bis 80 % zusammenfließen. Verwenden Sie am Tag der Transfektion ein Reagenz wie Lipo, um ein Plasmid einzuführen, das für die FC-Fusion kodiert.Nach der Transfektion werden die Zellen am Tag nach der Transfektion für 24 Stunden in den Inkubator zurückgeführt. Vorwärmen, DMEM mit aufgestautem Streptokokken und ohne fötales Rinderserum auf 37 Grad Celsius. Spülen Sie jede Schale zweimal mit 10 Millilitern des erwärmten Mediums aus und stellen Sie die Schalen dann nach der Inkubation für eine Stunde in den 37 Grad Celsius Inkubator, spülen Sie die Kulturschalen ein weiteres Mal mit 10 Millilitern DMEM ohne fötales Rinderserum für insgesamt drei Wäschen aus und inkubieren Sie dann die durchtrennten Zellen bei 37 Grad Celsius für weitere 48 Stunden, bevor Sie das Medium sammeln. Vier Tage nach der Transfektion wird das Medium mit einer serologischen Pipette aus jedem Paar Kulturschalen entnommen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.Zentrifugieren Sie dann das Medium bei 500 g pro fünf Minuten, um die Zelltrümmer nach dem Schleudern zu pelletieren, gießen Sie das Medium aus jedem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in eine 30-Milliliter-Spritze und filtrieren Sie es durch eine 0,45-Mikron-Spritze. In einen Zentrifugalkonzentrator filtrieren. Die Zentrifugalfilter werden so lange gedreht, bis das Volumen des konzentrierten Nährmediums auf ca. 500 Mikroliter reduziert wurde.Dies dauert ca. 15 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Kulturmedium hinzugefügt und konzentriert wurde. Anschließend werden in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe 1,5 Mikroliter Protein G magnetische Kügelchen auf einen Milliliter eiskalten Bindungspuffer gegeben.Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Bead-Aggregation. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten Sie das Verfahren genau befolgen. Beobachte die Perlen schnell, aber nicht zu hart.Sie sollten niemals an der Seite des Rohres trocknen oder zu lange auf dem Magneten verbleiben. Setzen Sie das Röhrchen auf einen Magneten und saugen Sie den Puffer mit einer Pipette ab. Geben Sie dann sofort das konzentrierte Nährmedium zu den Protein-G-Magnetkügelchen.Drehen Sie die Röhren zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magneten und entfernen Sie das Medium schnell. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter eiskaltem Bindepuffer und resuspendieren Sie die Kügelchen dann in 300 Mikrolitern Bindepuffer.Teilen Sie die resuspendierten Kügelchen in zwei Röhrchen mit je 150 Mikrolitern auf. Fügen Sie dann 1,5 Mikroliter Calciumchlorid oder EDTA für die Calcium- bzw. Null-Calcium-Bedingungen hinzu. Übertragen Sie 100 Mikroliter von jeder Erkrankung auf eine Depression.Brunnen-Objektträger mit einem Durchlichtmikroskop. Sammeln Sie Bilder aus fünf Sichtfeldern für jedes Experiment zu jedem gewünschten Zeitpunkt. Mit image J oder einer vergleichbaren Bildanalysesoftware.Öffnen Sie einen der fünf Bilddatensätze in Bild J im Dropdown-Menü. Wählen Sie oben auf dem Bildschirm Datei aus. Wählen Sie dann Importieren und dann Bildsequenz.Suchen Sie den Ordner mit den Bilddateien und öffnen Sie sie als Bildstapel. Klicken Sie anschließend in der Dropdown-Menüleiste auf Bild und wählen Sie dann Eigenschaften aus. Um dort das Eigenschaftenfenster zu öffnen.Ändern Sie die Bildeinheiten in Pixel und legen Sie die Pixelbreite und -höhe auf 1,0 fest. Klicken Sie erneut auf das Bild, wählen Sie Anpassen und dann Schwellenwert, um das Schwellenwertfenster zu öffnen, und verwenden Sie den Schieberegler, um den Bildschwellenwert anzupassen. Fügen Sie Pixel hinzu, die zu Perlen beitragen, und schließen Sie kleine Partikel aus.Wenden Sie den Schwellenwert auf alle Bilder im Bildstapel an. Weiter in der Dropdown-Menüleiste am oberen Rand des Bildschirms. Klicken Sie auf Analysieren.Wählen Sie dann Messungen festlegen, um das Messdialogfeld mit den Kontrollkästchen Bereich auswählen und Stapelposition am oberen Bildschirmrand zu öffnen. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Partikel analysieren. Dadurch wird eine Liste der identifizierten Partikel erstellt, einschließlich ihrer Größe und des Bildes, in dem sie identifiziert wurden.Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Experiment und jede Versuchsbedingung, um die kalziumabhängige Adhäsionsfähigkeit von Zebrafisch und Cadherin zu bestimmen. HEC 2, 9 3 Zellen wurden mit der NCAT-Herrin-OD-Domäne transfiziert, zwei fc fusioniert, und anschließend wurden kalziumabhängige Kügelchenaggregationszellen abgebildet und analysiert, wie in diesem Video beschrieben, wie in diesen Bildern zu sehen ist. In Abwesenheit von Kalzium zeigen die Kügelchen eine geringe oder keine Tendenz zur Aggregation, und es gibt keine Zunahme der Aggregatgröße mit der Zeit in Gegenwart von Kalzium.Mit NCAT und ECFC beschichtete Beats zeigen jedoch eine robuste Aggregation, wobei die Aggregatgröße im Laufe der Zeit als semiquantitatives Maß für die Adhäsion zunimmt. Die Durchlichtbilder aus drei Experimenten wurden analysiert, um die mittlere Größe der Aggregate zu bestimmen. Wie in dieser Grafik zu sehen ist, wurde die Aggregation von ncoer ECFC-beschichteten Kügelchen in Gegenwart von Calcium und in Abwesenheit von Calcium in Abständen von 15 Minuten bestimmt.Im Laufe einer Stunde zeigen diese Daten, dass die Ektodomäne von Zebrafischen n Cadherin die Kalzium-abhängige homophile Adhäsion vermittelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie testen können, ob die Adhäsion eine intrinsische biochemische Eigenschaft Ihres Proteins von Interesse ist.

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Eine Haftung Frequenz-Assay zur Messung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung Kinetik, wenn beide Moleküle auf der Oberfläche der interagierenden Zellen verankert sind beschrieben. Diese mechanisch-basierter Assay wird beispielhaft mit einer Mikropipette unter Druck menschlichen roten Blutkörperchen als Haftvermittler Sensor und Integrin αLβ2 und ICAM-1 als interagierende Rezeptoren und Liganden.

Adhesion Frequency-Assay für In Situ Kinetics Analyse der Cross-Junktionaler Molecular Interactions an der Zell-Zell-Schnittstelle

In diesem Video demonstrieren wir die Technik zur Messung transzellulärer Wechselwirkungen zwischen synaptischen Zelladhäsionsmolekülen durch den HEK-Zellaggregationsassay. In diesem Assay wird eine gleiche Anzahl von HEK-Zellen, die ein gewünschtes präsynaptisches Zelladhäsionsmolekül exprimieren, und ein fluoreszierendes Protein mit HEK-Zellen gemischt, die ein postsynaptisches Zelladhäsionsmolekül und ein weiteres fluoreszierendes Protein exprimieren. Die Wechselwirkung zwischen den...

Zellaggregationsassay zum Nachweis von Trans-Wechselwirkungen zwischen Zelladhäsionsmolekülen

Wir berichten über eine in vitro Methode, die die Quantifizierung der tatsächlichen Anzahl von Adhäsionszellen innerhalb einer Endothelzell-Monoschicht ermöglicht.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

Die bakterielle Anheftung an Wirtszellen ist ein wichtiger Schritt während der Besiedlung und Infektion des Wirts. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von polymergekoppelten rekombinanten Adhäsinen als biomimetische Materialien, die es ermöglichen, den Beitrag einzelner Adhäsine zu diesen Prozessen unabhängig von anderen bakteriellen Faktoren zu analysieren.

Biomimetische Materialien zu den Bakterien-Wirt-Interaktionen Charakterisieren

Dieser Strömungs Adhäsionsassay stellt eine einfache, hochschlag Modell von T-Zell-epithelialen Zell-Wechselwirkungen. Eine Spritzenpumpe wird verwendet, Scherspannung zu erzeugen, und die konfokale Mikroskopie erfasst Bilder für die Quantifizierung. Das Ziel dieser Studien ist es, um effektiv T Zelladhäsion quantifizieren Strömungsbedingungen.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Die Zelloberflächen Adhäsionen sind von zentraler Bedeutung in Mechanotransduktion, da sie mechanische Spannung und initiieren die Signalwege beteiligt in Gewebshomöostase und Entwicklung übertragen. Hier stellen wir ein Protokoll für die biochemischen Wege Sezieren, die als Antwort auf Zug aktiviert werden, unter Verwendung von Liganden-beschichteten magnetischen Mikrokügelchen und Kraftbeaufschlagung Adhäsionsrezeptoren.

Analyse Zelloberflächenhaftung Remodeling in Reaktion auf mechanische Spannung Mit Magnetic Beads

Diese Studie zeigt den nutzen und die einfache quantitative Zellmembran Erweiterung Messung und ihre Korrelation zum Klebstoff Kapazität von Zellen. Als ein repräsentatives Beispiel zeigen wir hier der Dickkopf-related Protein 3 (DKK3) fördert erhöhte Pseudopodien Bildung und Zelle Haftfähigkeit in NNR Karzinom-Zellen in Vitro.

Charakterisierung der Zellmembran Erweiterungen und studieren ihre Rolle im Krebs Zelle Adhäsion Dynamik

Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll zur schnellen und semiquantitativen Messung von Liganden-Rezeptor-Wechselwirkungen in Trans in einem heterologen Zellsystem mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Messung transzellulärer Wechselwirkungen durch Proteinaggregation in einem heterologen Zellsystem

Der Artikel beschreibt die Quantifizierung von 1) der Größe und Anzahl der fokalen Verklebungen und 2) Zellformindex und seine Verteilung von konfokalen Bildern der konfluenten Monolayer von MCF7-Zellen.

Quantifizierung von Zell-Substrat-Adhäsionsflächen und Zellformverteilungen in MCF7-Zell-Monolayern

Dieses Protokoll stellt die experimentellen Verfahren zur Durchführung des Adhäsions-Footprint-Assays vor, um die Adhäsionsereignisse während der schnellen Zellrollenadhäsion abzubilden.

Abbildung der molekularen Adhäsion im Zellrollen durch Adhäsion Footprint Assay

Erfahren Sie, wie Sie mit Bead-Aggregationsassays die Adhäsionseigenschaften von Zelladhäsionsmolekülen charakterisieren. Diese schnelle Methode nutzt Protein-G-Magnetperlen, um homophile Adhäsion direkt zu testen.

Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

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