Wulst Aggregationsassays zur Charakterisierung von putativen Zelladhäsionsmoleküle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fähigkeit von Protein-Ektodomänen zu testen, homophile Adhäsion zu vermitteln, um dies zu erreichen: Plasmide, die für die Fusion eines Ektodomänenfragments mit der FC-Region von humanem IgG kodieren, werden in HEC 2 93 Zellen transfiziert. Die sezernierten Odin FC-Fusionsproteine werden auf magnetischen Kügelchen eingefangen, die an Protein G konjugiert sind, und nach einem Waschen werden die beschichteten Kügelchen in Lösung interagieren lassen. Die beschichteten Kügelchen werden dann abgebildet, um das Ausmaß der Aggregation zu beurteilen, und schließlich quantifiziert. Mit einer einfachen Bildanalyse zeigen die resultierenden Daten, ob das Protein in der Lage ist, homophile Adhäsion zu vermitteln.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Zellaggregationsassays besteht darin, dass sie schnell und einfach ist und die Adhäsionsaktivität des von Ihnen gewählten Proteins direkt testet. Diese Technik wird von Dr. Michelle Eman, einer leitenden Wissenschaftlerin des Labors, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie die kultivierten Zellen zwei bis drei Tage vor der Transfektion für NCA hier ECFC vorbereiten.

Verwenden Sie 0,05 %-Trips in EDTA, um die HEC 2 93-Zellen von den Kulturschalen zu lösen. Bereiten Sie für jede Bedingung zwei 100-Millimeter-Gerichte vor. Teilen Sie die Zellen eins bis fünf und kultivieren Sie sie dann ein.

Ergänztes Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid, bis sie zu 60 bis 80 % zusammenfließen. Verwenden Sie am Tag der Transfektion ein Reagenz wie Lipo, um ein Plasmid einzuführen, das für die FC-Fusion kodiert.

Nach der Transfektion werden die Zellen am Tag nach der Transfektion für 24 Stunden in den Inkubator zurückgeführt. Vorwärmen, DMEM mit aufgestautem Streptokokken und ohne fötales Rinderserum auf 37 Grad Celsius. Spülen Sie jede Schale zweimal mit 10 Millilitern des erwärmten Mediums aus und stellen Sie die Schalen dann nach der Inkubation für eine Stunde in den 37 Grad Celsius Inkubator, spülen Sie die Kulturschalen ein weiteres Mal mit 10 Millilitern DMEM ohne fötales Rinderserum für insgesamt drei Wäschen aus und inkubieren Sie dann die durchtrennten Zellen bei 37 Grad Celsius für weitere 48 Stunden, bevor Sie das Medium sammeln. Vier Tage nach der Transfektion wird das Medium mit einer serologischen Pipette aus jedem Paar Kulturschalen entnommen und in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt.

Zentrifugieren Sie dann das Medium bei 500 g pro fünf Minuten, um die Zelltrümmer nach dem Schleudern zu pelletieren, gießen Sie das Medium aus jedem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in eine 30-Milliliter-Spritze und filtrieren Sie es durch eine 0,45-Mikron-Spritze. In einen Zentrifugalkonzentrator filtrieren. Die Zentrifugalfilter werden so lange gedreht, bis das Volumen des konzentrierten Nährmediums auf ca. 500 Mikroliter reduziert wurde.

Dies dauert ca. 15 Minuten. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Kulturmedium hinzugefügt und konzentriert wurde. Anschließend werden in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Probe 1,5 Mikroliter Protein G magnetische Kügelchen auf einen Milliliter eiskalten Bindungspuffer gegeben.

Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Bead-Aggregation. Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten Sie das Verfahren genau befolgen. Beobachte die Perlen schnell, aber nicht zu hart.

Sie sollten niemals an der Seite des Rohres trocknen oder zu lange auf dem Magneten verbleiben. Setzen Sie das Röhrchen auf einen Magneten und saugen Sie den Puffer mit einer Pipette ab. Geben Sie dann sofort das konzentrierte Nährmedium zu den Protein-G-Magnetkügelchen.

Drehen Sie die Röhren zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magneten und entfernen Sie das Medium schnell. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter eiskaltem Bindepuffer und resuspendieren Sie die Kügelchen dann in 300 Mikrolitern Bindepuffer.

Teilen Sie die resuspendierten Kügelchen in zwei Röhrchen mit je 150 Mikrolitern auf. Fügen Sie dann 1,5 Mikroliter Calciumchlorid oder EDTA für die Calcium- bzw. Null-Calcium-Bedingungen hinzu. Übertragen Sie 100 Mikroliter von jeder Erkrankung auf eine Depression.

Brunnen-Objektträger mit einem Durchlichtmikroskop. Sammeln Sie Bilder aus fünf Sichtfeldern für jedes Experiment zu jedem gewünschten Zeitpunkt. Mit image J oder einer vergleichbaren Bildanalysesoftware.

Öffnen Sie einen der fünf Bilddatensätze in Bild J im Dropdown-Menü. Wählen Sie oben auf dem Bildschirm Datei aus. Wählen Sie dann Importieren und dann Bildsequenz.

Suchen Sie den Ordner mit den Bilddateien und öffnen Sie sie als Bildstapel. Klicken Sie anschließend in der Dropdown-Menüleiste auf Bild und wählen Sie dann Eigenschaften aus. Um dort das Eigenschaftenfenster zu öffnen.

Ändern Sie die Bildeinheiten in Pixel und legen Sie die Pixelbreite und -höhe auf 1,0 fest. Klicken Sie erneut auf das Bild, wählen Sie Anpassen und dann Schwellenwert, um das Schwellenwertfenster zu öffnen, und verwenden Sie den Schieberegler, um den Bildschwellenwert anzupassen. Fügen Sie Pixel hinzu, die zu Perlen beitragen, und schließen Sie kleine Partikel aus.

Wenden Sie den Schwellenwert auf alle Bilder im Bildstapel an. Weiter in der Dropdown-Menüleiste am oberen Rand des Bildschirms. Klicken Sie auf Analysieren.

Wählen Sie dann Messungen festlegen, um das Messdialogfeld mit den Kontrollkästchen Bereich auswählen und Stapelposition am oberen Bildschirmrand zu öffnen. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie dann Partikel analysieren. Dadurch wird eine Liste der identifizierten Partikel erstellt, einschließlich ihrer Größe und des Bildes, in dem sie identifiziert wurden.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Experiment und jede Versuchsbedingung, um die kalziumabhängige Adhäsionsfähigkeit von Zebrafisch und Cadherin zu bestimmen. HEC 2, 9 3 Zellen wurden mit der NCAT-Herrin-OD-Domäne transfiziert, zwei fc fusioniert, und anschließend wurden kalziumabhängige Kügelchenaggregationszellen abgebildet und analysiert, wie in diesem Video beschrieben, wie in diesen Bildern zu sehen ist. In Abwesenheit von Kalzium zeigen die Kügelchen eine geringe oder keine Tendenz zur Aggregation, und es gibt keine Zunahme der Aggregatgröße mit der Zeit in Gegenwart von Kalzium.

Mit NCAT und ECFC beschichtete Beats zeigen jedoch eine robuste Aggregation, wobei die Aggregatgröße im Laufe der Zeit als semiquantitatives Maß für die Adhäsion zunimmt. Die Durchlichtbilder aus drei Experimenten wurden analysiert, um die mittlere Größe der Aggregate zu bestimmen. Wie in dieser Grafik zu sehen ist, wurde die Aggregation von ncoer ECFC-beschichteten Kügelchen in Gegenwart von Calcium und in Abwesenheit von Calcium in Abständen von 15 Minuten bestimmt.

Im Laufe einer Stunde zeigen diese Daten, dass die Ektodomäne von Zebrafischen n Cadherin die Kalzium-abhängige homophile Adhäsion vermittelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie testen können, ob die Adhäsion eine intrinsische biochemische Eigenschaft Ihres Proteins von Interesse ist.