Name: Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von Rhodamin-markiertem Aktin in Drosophila-Embryonen, um Aktinstäbchen unter Hitzestress zu visualisieren. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung zellulärer Stressantworten in vivo.

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Die Autoren würdigen die Arbeit von Liuliu Zheng und Zenghui Xue, die diese Technik im Sokac-Labor mitvorangetrieben haben, sowie Hasan Seede, der bei der Analyse mitgeholfen hat. Die Arbeit für diese Studie wird durch ein Stipendium des NIH (R01 GM115111) finanziert.

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
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<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
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<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
<li>Hunter, M. V., Willoughby, P. M., Bruce, A. E. E., Fernandez-Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+Stress+Orchestrates+Cell+Polarity+to+Promote+Embryonic+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Oxidative Stress Orchestrates Cell Polarity to Promote Embryonic Wound Healing.</a> Developmental Cell. 47 (3), 377-387 (2018).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte deklariert.

Die Bedeutung dieser Methode ist, dass sie das etablierte Protokoll der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27 nutzt, um neue Forschungen in Bezug auf die ASR und die begleitende Aktinstabmontage zu ermöglichen. Ein großer Vorteil der Injektion von G-ActinR...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Man G-ActinRed injizieren, um die Montage von intranuklearen Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu visualisieren, die sich einer induzierbaren Actin-Stressreaktion (ASR)1unterziehen. Wir entwickelten dieses Protokoll, um Studien der ASR zu unterstützen, die bei Embryonen zu gestörter Morphogenese und verminderter Lebensfähigkeit führt, und bei erwachsenen menschlichen Zelltypen ist mit Pathologien wie Nierenversagen2, Muskelmyopathien3und Alzheimer und Huntington4,5,6,7,8verbunden. Dieser ASR wird durch zahlreiche zelluläre Spannungen induziert, einschließlich Hitzeschock9,10,11, oxidativer Stress4,6, reduzierte ATP-Synthese12, und abnormale Huntingtin oder β-Amyloid-Oligomerisierung4,5,6,7,9,13,14,15,16. Ein Markenzeichen der ASR ist die Montage von abnormen Aktinstäben im Zytoplasma oder Kern der betroffenen Zellen, die durch stressinduzierte Hyperaktivierung eines Aktin-interagierenden Proteins, Cofilin1,5,6,10angetrieben wird. Leider bestehen nach wie vor wesentliche Wissenslücken in Bezug auf die ASR. Beispielsweise ist die Funktion der Aktinstäbe nicht bekannt. Wir verstehen nicht, warum Sichstäbe im Zytoplasma einiger Zelltypen bilden, aber der Kern anderer. Es ist auch nicht klar, ob die ASR für Zellen oder Embryonen, die sich stressfähig befinden, schützend oder maladaptiv ist. Schließlich kennen wir immer noch nicht die detaillierten Mechanismen, die der Cofilin-Hyperaktivierung oder Aktinstab-Montage zugrunde liegen. Somit bietet dieses Protokoll einen schnellen und vielseitigen Test zur Untersuchung des ASR, indem es die Aktinstabbildung und -dynamik im hochgradig beziehbaren Versuchssystem des lebenden Fruchtfliegenembryons visualisiert.
Das Protokoll zur Mikroinjektion von G-ActinRed in lebende Drosophila-Embryonen wurde ursprünglich entwickelt, um die Dynamik normaler zytoplasmatischer Aktinstrukturen17 während gewebebildender Ereignisse zu untersuchen. In diesen Studien fanden wir heraus, dass die G-Actin-Rot-Injektion die frühen Entwicklungsprozesse im Embryo, einschließlich Zytokinese oder Gastrulation17, 18, nicht beeinträchtigte. Wir modifizierten dann das Protokoll, passten die Embryo-Handhabung und G-ActinRed Injektion an, um die Bildgebung von Aktinstäben in wärmebelasteten Embryonen zu ermöglichen, die sich dem ASR1unterziehen. Andere Methoden neben G-ActinRote Injektion kann verwendet werden, um Actin in Embryonen zu visualisieren. Diese Methoden basieren auf der Exdinsiz fluoreszierender Proteine (FPs), die mit Actin oder Domänen von Actin-bindenden Proteinen wie Utrophin-mCherry, Lifeact, F-tractin-GFP und Moesin-GFP (rezensiert in19) markiert sind. Die Verwendung dieser FP-Sonden erfordert jedoch Vorsicht, da sie einige Aktinstrukturen stabilisieren oder stören können, nicht alle Aktinstrukturen20gleich kennzeichnen und im Falle von Actin-GFP stark überexprimiert werden – problematisch für die Analyse der Stabmontage, die nicht nur stressabhängig, sondern auch aktinkonzentrationsabhängigist 1. Somit ist G-ActinRed die bevorzugte Sonde für Stabstudien an Fliegenembryonen, und die große Größe des Embryos ermöglicht seine einfache Injektion.
Der Arbeitsablauf dieses Protokolls ähnelt anderen etablierten Mikroinjektionstechniken, die zur Injektion von Proteinen, Nukleinsäuren, Medikamenten und fluoreszierenden Indikatoren in Drosophila-Embryonen 21,22,23,24,25,26,27verwendet wurden. Nach der Mikroinjektion von G-ActinRed sind Embryonen jedoch leichtem Hitzestress ausgesetzt, um die ASR- und intranukleare Aktinstab-Montage zu induzieren. Für Labore mit Zugang zu Fliegen und einem Injektionssystem sollte diese Methode für bestimmte Studienlinien in Bezug auf die ASR leicht umsetzbar und anpassungsfähig sein, einschließlich ihrer Induktion durch unterschiedliche Spannungen oder Modulation in unterschiedlichen genetischen Hintergründen.

<table><tbody><tr><td>Adenosintriphosphat (ATP)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>Bestandteil von G-Puffer</td></tr><tr><td>Apfelsaft, Mott's, 64 fl oz</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>Bestandteil von Apfelsaftplatten</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>Bestandteil von Apfelsaftplatten</td></tr><tr><td>Bleach, PureBright Keimizid, 6,0% Natriumhypochlorit</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>Für die Dechorionierung von Embryonen</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>Bestandteil des G-Puffers</td></tr><tr><td>Zellsieb, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>Zur Entnahme dechorionierter Embryonen</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop, LSM 880 34-Kanal mit Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>Zur Abbildung von intranukleären Aktinstäbchen</td></tr><tr><td>Trockenmittel</td><td>Drierit</td><td>24001</td><td>Zum Austrocknen von Embryonen</td></tr><tr><td>Präpariermikroskop, Stemi 508 Stereoskop mit 8:1 Zoom Zeiss</td><td></td><td>4350649000000</td><td>Zum Anordnen von Embryonen auf einem Agarkeil</td></tr><tr><td>Präpariernadel, 5 Zoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>Zum Anordnen von Embryonen auf einem Agarkeil</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>Bestandteil des G-Puffers</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband, Scotch Permanent, 0,5 Zoll x 250 Zoll</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>Zur Herstellung von Embryokleber</td></tr><tr><td>Käfig für die Embryonenentnahme</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>Zur Unterbringung erwachsener Fliegen und zum Sammeln von Embryonen</td></tr><tr><td>Pinzette mit feiner Spitze, Dumont Pinzette, Typ 5</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>72701D</td><td>Zum Anordnen von Embryonen auf Agarkeilen</td></tr><tr><td>Glaskapillaren, Borosilcatglas, dünn 1 mm x 0,75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>Für Mikronadeln</td></tr><tr><td>Halogenkohlenwasserstofföl 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>Für die Hydratation von Embryonen</td></tr><tr><td>Beheizter Tischinkubator</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>Für die konfokale</td></tr><tr><td>Bildgebung Laborgewebewischer, KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>Laborgewebewischer</td></tr><tr><td>Lichtmikroskop, Invertoskop 40C Invertierter Phasenkontrast Mikroskop, generalüberholt</td><td>Zeiss</td><td>Auslaufmodell</td><td>Injektionsmikroskop</td></tr><tr><td>Methyl-4-hydroxybenzoat</td><td>Millipore-Sigma H36471KG</td><td></td><td>Bestandteil von Apfelsaftplatten</td></tr><tr><td>Microinjector, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Microloader Spitzen, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Zum Laden von Mikronadeln</td></tr><tr><td>Mikromanipulator und Injektionstisch mit X,Y,Z-Zifferblättern zur Nadeleinstellung</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>Zur Durchführung von Mikroinjektionen</td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher, Modell P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>Zum Ziehen von Kapillarröhrchen zur Herstellung von Mikronadeln</td></tr><tr><td>Mikroskop-Deckglas 24x50-1,5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Zum Einbetten von Embryonen</td></tr><tr><td>Objektträger, Lilac Colorfrost, vorgereinigt, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>Zum Einbetten von Embryonen zur Injektion</td></tr><tr><td>n-Heptan</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>Bestandteil des Embryoklebers</td></tr><tr><td>Objektiv, 10x</td><td>Zeiss</td><td>Abgekündigt</td><td>10x Objektiv für Injektionsmikroskop</td></tr><tr><td>Objektiv, C-Apochromat 40x/1,2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x Wasserobjektiv für konfokales</td></tr><tr><td>Objektiv, LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Cor DIC M27 für Öl-, Wasser-, Silikonöl- oder Glycerin-Immersion (D=0-0,17mm) (WD=0,57mm bei D=0,17mm)</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x gemischtes Immersionsobjektiv für konfokales</td></tr><tr><td>Objektiv, Plan-Apocrhomat 63x/1,40 Öl DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x Ölobjektiv für konfokal</td></tr><tr><td>Pinsel, Robert Simmons Expression E85 Spitz Rund Größe 2</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>Für den Embryotransfer</td></tr><tr><td>Papierhandtücher, Kleenex Papierhandtücher mit C-Faltung, weiß</td><td>Kimberly-Clark 884266344845</td><td></td><td>Zum Blottieren von Zellsieb</td></tr><tr><td>Pasteurpipette, 5 3/4 Zoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>Zum Abdecken von Embryonen mit Öl</td></tr><tr><td>Petrischale, Glas, 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>Für feuchte Brutkammer</td></tr><tr><td>Petrischale, Kunststoff, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>Für Apfelsaftplatten</td></tr><tr><td>Pipette, Eppendorf Referenz 0,5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>Zum Laden der Mikronadel-Pipettenspitze</td></tr><tr><td>, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>Zum Hinzufügen von Embryokleber zum Deckglas</td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>Zum Schneiden von Agarkeilen, Klebeband, Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>Rhodamin-konjugiertes globuläres Aktin, menschliches Blutplättchen (nicht Muskeln; 4x10 &mu; g)</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-Aktin^Rotes</td></tr><tr><td>Szintillationsfläschchen, 20 mL Borosillat aus Glas mit Polyethylen-Liner und Harnstoffkappen</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>Zur Herstellung von Embryokleber</td></tr><tr><td>Schraubglas, 16 oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>Zum Austrocknen von Embryonen</td></tr><tr><td>Tischmikrometer</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>602104PG</td><td>Zur Kalibrierung des Volumens der G-Aktin-Injektion</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>Bestandteil von Apfelsaftplatten</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>Bestandteil von G Puffer</td></tr><tr><td>Hefe, Lesaffre Yeast Corporation Hefe, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>Bestandteil von Hefepaste</td></tr></tbody></table>

imaging intranuclear actin rods in live heat stressed drosophila embryos

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Der Zweck dieses Protokolls ist es, intranukleare Aktinstäbe zu visualisieren, die sich in lebenden Drosophila melanogaster Embryonen nach Hitzestress zusammensetzen. Actin-Stäbe sind ein Kennzeichen einer konservierten, induktiven Actin Stress Response (ASR), die menschliche Pathologien begleitet, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen. Zuvor haben wir gezeigt, dass die ASR zu Morphogenese-Ausfällen und einer verminderten Lebensfähigkeit der sich entwickelnden Embryonen beiträgt. Dieses Protokoll ermöglicht die kontinuierliche Untersuchung der Mechanismen, die der Aktinstabbaugruppe und der ASR in einem Modellsystem zugrunde liegen, das sehr bildgebend, genetisch und biochemie geeignet ist. Embryonen werden gesammelt und auf einem Deckslip montiert, um sie für die Injektion vorzubereiten. Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin (G-ActinRed) wird verdünnt und in eine Mikronadel geladen. Eine einzige Injektion erfolgt in das Zentrum jedes Embryos. Nach der Injektion werden Embryonen bei erhöhter Temperatur inkubiert und intranukleare Aktinstäbe werden dann durch konfokale Mikroskopie visualisiert. Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) Experimente können an den Aktinstäben durchgeführt werden; und andere aktinreiche Strukturen im Zytoplasma können ebenfalls abgebildet werden. Wir stellen fest, dass G-ActinRed wie endogenes G-Actin polymerisiert und allein nicht die normale Embryoentwicklung beeinträchtigt. Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass während der Injektion Vorsicht geboten ist, um eine schwere Verletzung des Embryos zu vermeiden. Jedoch, mit der Praxis, Injektion von G-ActinRot in Drosophila Embryonen ist eine schnelle und zuverlässige Möglichkeit, Aktin-Stäbe zu visualisieren und kann leicht mit Fliegen jeder Art oder mit der Einführung von anderen zellulären Spannungen verwendet werden, einschließlich Hypoxie und oxidativen Stress.

In Abbildung 1ist ein schematischer Arbeitsablauf für die Handhabung von Embryonen dargestellt, und in Tabelle 1ist ein Zeitplan für ein typisches Experiment dargestellt. Eine Schätzung für ein gutes experimentelles Ergebnis ist, dass auf 10 injizierte Embryonen mindestens die Hälfte der betrachteten Embryonen im richtigen Entwicklungsstadium sein wird, unbeschädigt, und eine robuste ASR mit Hitzespannung bei 32 °C aufweisen. Diese ASR wird durch die Montage von intranuklea...

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Rhodamine-konjugiertes Kugelaktin in Drosophila-Embryonen zu injizieren und die intranukleare Aktinstabsmontage nach Hitzestress abzubilden.

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Unser Protokoll ist von Bedeutung, weil es die etablierte Technik der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen verwendet, um neue Forschungen über die Aktin-Stress-Reaktion und die begleitende Assemblierung von Aktinstäbchen zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Aktin-Stress-Reaktion in einer Vielzahl von Kontexten untersuchen können, z. B. auf einem mutierten Screen oder unter verschiedenen Stressbedingungen. Eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, die Embryonen zu handhaben und die Mikroinjektion durchzuführen.Wir empfehlen, diese Schritte so lange zu üben, bis sich der Benutzer wohl fühlt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Handhabung, Positionierung und Montage des Embryos sowohl für die Mikroinjektion als auch für die Bildgebung allein aus den schriftlichen Anweisungen möglicherweise nicht klar sind. Bereiten Sie Embryo-Entnahmebecher und Apfelsaft-Agar-Platten gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor.Um die großzügigste Eiablage zu fördern, stellen Sie zwei Tage vor dem Experiment Auffangbecher mit Fliegen auf. Gib mindestens 100 weibliche und 50 männliche Fliegen in jeden Auffangbecher und bedecke ihn dann mit einer Apfelsaftplatte. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus G-Aktinrot vor und lagern Sie sie auf Eis, bis sie in die Mikronadel geladen wird.Lassen Sie die Fliegen 30 Minuten lang Embryonen auf die Apfelsaftplatten mit Hefepaste bei 18 Grad Celsius legen. Während die Fliegen legen, schneidest du mit einer Rasierklinge einen vier mal einen Zentimeter großen rechteckigen Keil aus Apfelsaft-Agar aus und legst ihn auf einen 25 mal 75 Millimeter großen Glasschieber. Entnehmen Sie die Platte aus der Sammlung und dechorionieren Sie die Embryonen, indem Sie frische Bleichlösung auf die Platte gießen und eine Minute lang schwenken.Befeuchten Sie die Borsten eines Pinsels mit destilliertem Wasser und übertragen Sie damit dechorionierte und gewaschene Embryonen aus dem Sammelkorb auf den vorbereiteten Apfelsaft-Agar-Keil auf dem Objektträger. Ordnen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze oder einer Präpariernadel 10 Embryonen in einer geraden Linie entlang der Längsachse des rechteckigen Agarkeils an. Ordnen Sie die Embryonen von Kopf bis Schwanz so an, dass ihre dorsale Seite dem Forscher zugewandt ist.Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen halben Zentimeter vom Ende einer P200-Pipettenspitze ab und tauchen Sie sie in den Embryokleber. Beschichten Sie einen fünf Millimeter großen Bereich entlang der langen Kante eines 24 x 50 Millimeter großen rechteckigen Deckglases großzügig und lassen Sie es mit der Leimseite nach oben trocknen. Sobald der Embryokleber getrocknet ist, legen Sie den Deckglaskleber vorsichtig mit der Seite nach unten auf die Reihe der ausgerichteten Embryonen auf dem Agar und lassen Sie zwei bis drei Millimeter Abstand zwischen dem Rand des Deckglases und der Reihe der Embryonen.Drehen Sie das Deckglas um, so dass die Embryonen nach oben zeigen. Sie sollten in einer Linie entlang einer langen Kante des Deckglases geklebt werden, wobei ihr Bauchbereich zur nächsten Kante zeigt. Legen Sie das Deckglas auf 150 Gramm frisches blaues Trockenmittel in ein 16-Unzen-Schraubglas und schrauben Sie den Deckel fest auf.Trocknen Sie die Embryonen 8 bis 10 Minuten lang aus, entfernen Sie dann das Deckglas aus dem Trockenmittelglas und kleben Sie jede kurze Seite des Deckglases mit der Embryonenseite nach oben auf einen Objektträger. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen hohles Kohlenstoff-27-Öl mit einer Pasteur-Pipette hinzu, um die ausgerichteten Embryonen zu bedecken und sie vor weiterer Dehydrierung zu schützen. Während die Embryonen austrocknen, laden Sie den zuvor vorbereiteten G-Aktinrot-Überstand mit einer Mikroladerspitze in die Mikronadel zurück.Befestigen Sie die Mikronadel am Nadelhalter und ziehen Sie die Schraube fest. Legen Sie den Objektträger mit den eingefassten Embryonen auf den Mikroskoptisch und bringen Sie die Nadel mit den Mikronadelsteuerungen in die gleiche Brennebene wie die Embryonen. Führen Sie die Mikronadel so in den Embryo ein, dass sie den Embryo in der Mitte seiner Bauchregion am Äquator des Embryos trifft.Wenn die Mikronadelspitze in der Mitte des Embryos sichtbar ist, lösen Sie die Injektion aus. Entfernen Sie nach der Injektion langsam die Mikronadel. Verschieben Sie das Stadium und führen Sie die Injektion bei den anderen Embryonen durch.Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, legen Sie den Objektträger mit den Embryonen in eine feuchte Inkubationskammer und schließen Sie den Deckel. Entnehmen Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen aus der feuchten Inkubationskammer. Arbeiten Sie schnell und hebeln Sie vorsichtig die doppelseitigen Klebebandstücke ab, mit denen das Deckglas auf dem Objektträger befestigt wurde.Kleben Sie zwei 2,5 Zentimeter lange Stücke doppelseitiges Klebeband zusammen und schneiden Sie das Band der Länge nach in zwei Streifen. Kleben Sie 2/3 der Länge jedes Klebestreifens auf das erste Deckglas und blenden Sie jede Seite der Embryonen aus. Lassen Sie 1/3 der Klebebandstreifen an der Kante des ersten Deckglases hängen, wo die Embryonen stecken bleiben.Legen Sie vorsichtig ein zweites rechteckiges Deckglas auf die Klebebandstreifen, um die Embryonen zwischen den Deckgläsern einzuklemmen, wobei Sie die 25-Millimeter-Kanten ausrichten, aber die 50-Millimeter-Kanten um einen Zentimeter voneinander versetzt halten. Vergewissern Sie sich, dass die beheizte Stufe die richtige Temperatur hat. Und wenn Sie ein inverses Mikroskop verwenden, geben Sie Immersionsflüssigkeit auf die ausgewählte Objektivlinse.Legen Sie das Deckglas-Sandwich vorsichtig auf den Tisch und achten Sie darauf, dass die neue Bildoberfläche diejenige ist, die die Immersionsflüssigkeit berührt. Fokussieren Sie sich auf einen Embryo, der sich in der Zellularisierung befindet, wechseln Sie dann in den Laseraufnahmemodus am konfokalen Mikroskop und passen Sie die Laserleistung und -verstärkung, die Bildgröße, das Kacheln und die Projektionseinstellungen wie gewünscht an. Nehmen Sie Oberflächenansichtsbilder durch die Brennebenen der Zellkerne des Embryos auf, um intranukleäre Aktinstäbchen zu finden.Stäbchen sollten in mehreren Ausrichtungen als helle Streifen oder Punkte innerhalb der vergleichsweise dunklen Kerne erscheinen. Die Aktin-Stress-Reaktion und hitzegestresste Embryonen wird durch die Assemblierung von intranukleären Aktinstäbchen deutlich. Aktinstäbchen treten in unterschiedlichen Ausrichtungen innerhalb der Zellkerne auf und können durch mehrere Fokusebenen abgebildet werden.Im Vergleich dazu weisen Kontrollembryonen, die bei 18 Grad Celsius inkubiert wurden, keine Aktinstäbchen auf. Der prozentuale Anteil der Kerne, die Stäbchen enthalten, kann quantifiziert und FRAP-Experimente an den Stäbchen durchgeführt werden. Ein Beispiel für ein Fluoreszenz-Erholungsdiagramm für einen gebleichten versus ungebleichten Bereich eines Aktinstäbchens ist hier dargestellt.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Aktinstäbchenbildung temperaturabhängig ist. Für die Schritte nach der Mikroinjektion ist es entscheidend, die Embryonen auf der gewünschten Inkubationstemperatur zu halten. Nach der Mikroinjektion kann der Forscher FRAP durchführen, um den fehlenden F-Aktinumsatz in den Aktinstäbchen zu bestätigen oder um Veränderungen des F-Aktinumsatzes zu quantifizieren, die in anderen aktinreichen Strukturen auftreten.

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Research

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