Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

Unser Protokoll ist von Bedeutung, weil es die etablierte Technik der Mikroinjektion in Drosophila-Embryonen verwendet, um neue Forschungen über die Aktin-Stress-Reaktion und die begleitende Assemblierung von Aktinstäbchen zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Aktin-Stress-Reaktion in einer Vielzahl von Kontexten untersuchen können, z. B. auf einem mutierten Screen oder unter verschiedenen Stressbedingungen. Eine Person, die diese Technik noch nie zuvor durchgeführt hat, kann Schwierigkeiten haben, die Embryonen zu handhaben und die Mikroinjektion durchzuführen.

Wir empfehlen, diese Schritte so lange zu üben, bis sich der Benutzer wohl fühlt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Handhabung, Positionierung und Montage des Embryos sowohl für die Mikroinjektion als auch für die Bildgebung allein aus den schriftlichen Anweisungen möglicherweise nicht klar sind. Bereiten Sie Embryo-Entnahmebecher und Apfelsaft-Agar-Platten gemäß den Anweisungen des Manuskripts vor.

Um die großzügigste Eiablage zu fördern, stellen Sie zwei Tage vor dem Experiment Auffangbecher mit Fliegen auf. Gib mindestens 100 weibliche und 50 männliche Fliegen in jeden Auffangbecher und bedecke ihn dann mit einer Apfelsaftplatte. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus G-Aktinrot vor und lagern Sie sie auf Eis, bis sie in die Mikronadel geladen wird.

Lassen Sie die Fliegen 30 Minuten lang Embryonen auf die Apfelsaftplatten mit Hefepaste bei 18 Grad Celsius legen. Während die Fliegen legen, schneidest du mit einer Rasierklinge einen vier mal einen Zentimeter großen rechteckigen Keil aus Apfelsaft-Agar aus und legst ihn auf einen 25 mal 75 Millimeter großen Glasschieber. Entnehmen Sie die Platte aus der Sammlung und dechorionieren Sie die Embryonen, indem Sie frische Bleichlösung auf die Platte gießen und eine Minute lang schwenken.

Befeuchten Sie die Borsten eines Pinsels mit destilliertem Wasser und übertragen Sie damit dechorionierte und gewaschene Embryonen aus dem Sammelkorb auf den vorbereiteten Apfelsaft-Agar-Keil auf dem Objektträger. Ordnen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze oder einer Präpariernadel 10 Embryonen in einer geraden Linie entlang der Längsachse des rechteckigen Agarkeils an. Ordnen Sie die Embryonen von Kopf bis Schwanz so an, dass ihre dorsale Seite dem Forscher zugewandt ist.

Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen halben Zentimeter vom Ende einer P200-Pipettenspitze ab und tauchen Sie sie in den Embryokleber. Beschichten Sie einen fünf Millimeter großen Bereich entlang der langen Kante eines 24 x 50 Millimeter großen rechteckigen Deckglases großzügig und lassen Sie es mit der Leimseite nach oben trocknen. Sobald der Embryokleber getrocknet ist, legen Sie den Deckglaskleber vorsichtig mit der Seite nach unten auf die Reihe der ausgerichteten Embryonen auf dem Agar und lassen Sie zwei bis drei Millimeter Abstand zwischen dem Rand des Deckglases und der Reihe der Embryonen.

Drehen Sie das Deckglas um, so dass die Embryonen nach oben zeigen. Sie sollten in einer Linie entlang einer langen Kante des Deckglases geklebt werden, wobei ihr Bauchbereich zur nächsten Kante zeigt. Legen Sie das Deckglas auf 150 Gramm frisches blaues Trockenmittel in ein 16-Unzen-Schraubglas und schrauben Sie den Deckel fest auf.

Trocknen Sie die Embryonen 8 bis 10 Minuten lang aus, entfernen Sie dann das Deckglas aus dem Trockenmittelglas und kleben Sie jede kurze Seite des Deckglases mit der Embryonenseite nach oben auf einen Objektträger. Fügen Sie zwei bis drei Tropfen hohles Kohlenstoff-27-Öl mit einer Pasteur-Pipette hinzu, um die ausgerichteten Embryonen zu bedecken und sie vor weiterer Dehydrierung zu schützen. Während die Embryonen austrocknen, laden Sie den zuvor vorbereiteten G-Aktinrot-Überstand mit einer Mikroladerspitze in die Mikronadel zurück.

Befestigen Sie die Mikronadel am Nadelhalter und ziehen Sie die Schraube fest. Legen Sie den Objektträger mit den eingefassten Embryonen auf den Mikroskoptisch und bringen Sie die Nadel mit den Mikronadelsteuerungen in die gleiche Brennebene wie die Embryonen. Führen Sie die Mikronadel so in den Embryo ein, dass sie den Embryo in der Mitte seiner Bauchregion am Äquator des Embryos trifft.

Wenn die Mikronadelspitze in der Mitte des Embryos sichtbar ist, lösen Sie die Injektion aus. Entfernen Sie nach der Injektion langsam die Mikronadel. Verschieben Sie das Stadium und führen Sie die Injektion bei den anderen Embryonen durch.

Nachdem alle Embryonen injiziert wurden, legen Sie den Objektträger mit den Embryonen in eine feuchte Inkubationskammer und schließen Sie den Deckel. Entnehmen Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen aus der feuchten Inkubationskammer. Arbeiten Sie schnell und hebeln Sie vorsichtig die doppelseitigen Klebebandstücke ab, mit denen das Deckglas auf dem Objektträger befestigt wurde.

Kleben Sie zwei 2,5 Zentimeter lange Stücke doppelseitiges Klebeband zusammen und schneiden Sie das Band der Länge nach in zwei Streifen. Kleben Sie 2/3 der Länge jedes Klebestreifens auf das erste Deckglas und blenden Sie jede Seite der Embryonen aus. Lassen Sie 1/3 der Klebebandstreifen an der Kante des ersten Deckglases hängen, wo die Embryonen stecken bleiben.

Legen Sie vorsichtig ein zweites rechteckiges Deckglas auf die Klebebandstreifen, um die Embryonen zwischen den Deckgläsern einzuklemmen, wobei Sie die 25-Millimeter-Kanten ausrichten, aber die 50-Millimeter-Kanten um einen Zentimeter voneinander versetzt halten. Vergewissern Sie sich, dass die beheizte Stufe die richtige Temperatur hat. Und wenn Sie ein inverses Mikroskop verwenden, geben Sie Immersionsflüssigkeit auf die ausgewählte Objektivlinse.

Legen Sie das Deckglas-Sandwich vorsichtig auf den Tisch und achten Sie darauf, dass die neue Bildoberfläche diejenige ist, die die Immersionsflüssigkeit berührt. Fokussieren Sie sich auf einen Embryo, der sich in der Zellularisierung befindet, wechseln Sie dann in den Laseraufnahmemodus am konfokalen Mikroskop und passen Sie die Laserleistung und -verstärkung, die Bildgröße, das Kacheln und die Projektionseinstellungen wie gewünscht an. Nehmen Sie Oberflächenansichtsbilder durch die Brennebenen der Zellkerne des Embryos auf, um intranukleäre Aktinstäbchen zu finden.

Stäbchen sollten in mehreren Ausrichtungen als helle Streifen oder Punkte innerhalb der vergleichsweise dunklen Kerne erscheinen. Die Aktin-Stress-Reaktion und hitzegestresste Embryonen wird durch die Assemblierung von intranukleären Aktinstäbchen deutlich. Aktinstäbchen treten in unterschiedlichen Ausrichtungen innerhalb der Zellkerne auf und können durch mehrere Fokusebenen abgebildet werden.

Im Vergleich dazu weisen Kontrollembryonen, die bei 18 Grad Celsius inkubiert wurden, keine Aktinstäbchen auf. Der prozentuale Anteil der Kerne, die Stäbchen enthalten, kann quantifiziert und FRAP-Experimente an den Stäbchen durchgeführt werden. Ein Beispiel für ein Fluoreszenz-Erholungsdiagramm für einen gebleichten versus ungebleichten Bereich eines Aktinstäbchens ist hier dargestellt.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Aktinstäbchenbildung temperaturabhängig ist. Für die Schritte nach der Mikroinjektion ist es entscheidend, die Embryonen auf der gewünschten Inkubationstemperatur zu halten. Nach der Mikroinjektion kann der Forscher FRAP durchführen, um den fehlenden F-Aktinumsatz in den Aktinstäbchen zu bestätigen oder um Veränderungen des F-Aktinumsatzes zu quantifizieren, die in anderen aktinreichen Strukturen auftreten.