Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in Drosophila Oozyten

In diesem Protokoll werden Zyten, die GFP-markierte Proteine exprimieren, aus weiblichen Drosophila präpariert und abgebildet, um die Bewegung des Proteins in lebenden Zellen zu untersuchen. Bereiten Sie zunächst eine Betrachtungskammer vor, indem Sie zwei Deckgläser mit Silikonfett auf einen Objektträger kleben, um einen Kanal zu bilden. Die Seiten des Kanals sind mit Halo-Kohlenstofföl ausgekleidet.

Als nächstes sezieren Sie die Eierstöcke eines Weibchens in einen Tropfen Halo-Kohlenstofföl auf einem Deckblatt. Isolieren Sie dann die einzelnen Zyten und drehen Sie das Deckglas über den Kanal im vorbereiteten Objektträger, um eine Betrachtungskammer zu schaffen. Nachdem Sie die Zyten mit einer Hellfeld- oder DIC-Optik lokalisiert haben, können Sie mit der konfokalen Mikroskopie und der zugehörigen Software in festgelegten Zeitintervallen digitale Bilder aufnehmen.

Letztendlich kann eine Zeitraffersequenz der erzeugten Bilder verwendet werden, um die Bewegung von Proteinen oder Partikeln in lebenden Zellen im Laufe der Zeit zu überwachen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselbereiche der Zell- und Entwicklungsbiologie zu untersuchen, wie z. B. den Protein- und mRNA-Transport und die Etablierung der Zellpolarität. Betäuben Sie zunächst die gesunden Fliegen, die weniger als eine Woche alt sind, und wählen Sie 10 bis 15 große Weibchen mit abgerundeten, cremefarbenen Bäuchen aus.

Setzen Sie die ausgewählten Fliegen und einige Männchen in ein Fläschchen mit neuem leicht gehefeigem Futter um. Dann brüten Sie die Fliegen zwei Tage lang bei 25 Grad Celsius aus, um sie zu mästen. Die Mast der Fliegen stellt sicher, dass eine Vielzahl von Stadien, insbesondere die Stadien acht bis 12, für die Bildgebung von ungemästeten Fliegen oder schlecht gemästeten Fliegen zur Verfügung stehen.

Befestigen Sie zwei Deckgläser im Abstand von etwa einem Zentimeter an einem Standard-Objektträger. Verwenden Sie nur so viel Fett, dass die Deckschicht gut abdicht ist. Drücken Sie auf jeden Eindeckzettel fest nach unten, um das Fett dünn und gleichmäßig zu verteilen.

Geben Sie dann etwas heiliges Kohlenöl 27 in die Verbindungsstelle zwischen den Deckgläsern und dem Gleiter, um zu verhindern, dass isolierte Zyten in den nachfolgenden Schritten verletzt werden. Geben Sie nun zwei bis drei Tropfen Kohlenöl 27 auf die Oberfläche eines 22 Quadratmillimeter großen Deckglases. Als nächstes pipettieren Sie ein einzelnes Weibchen aus dem Futterfläschchen und geben es vorsichtig in das Halo Caron-Öl.

Stecken Sie den Hosenschlitz mit einer scharfen Präparierzange gegen den Deckschirm und ziehen Sie die Spitze des Bauches ab. Entfernen Sie die Eierstöcke, indem Sie sie über die Oberfläche des Deckglases unter das Öl ziehen, um die Haftung der Zyten auf dem Deckglas zu fördern. Toupieren Sie nun die Eierstöcke vorsichtig auseinander und suchen Sie nach Zyten, die mindestens Stadium 10 B der Oogenese sind.

Identifizieren Sie die Eizellen in diesem Stadium, indem Sie nach Eikammern suchen, in denen die Eizelle mindestens 50 bis 60 % des Gesamtvolumens der Eikammer einnimmt. Mit einer Pinzette. Entnahme einzelner Eizellen aus der Eischeide mit ein bis drei Weibchen.

Isolieren Sie weiterhin fünf bis acht unbeschädigte Eizellen auf dem Deckglas. Entfernen Sie dann unbrauchbares Gewebe. Drehen Sie das Deckglas mit den Eizellen vorsichtig auf den vorbereiteten Objektträger um, so dass die Zyten zwischen den beiden Spacern positioniert sind.

Und denken Sie daran, drücken Sie nicht auf den Deckglas, da dies die Zyten beschädigen kann. Geben Sie bei Bedarf eine kleine Menge Halo-Kohlenstofföl an die Ränder des Sandwiches, um sicherzustellen, dass der Raum gefüllt ist. Beachten Sie, dass zu diesem Zeitpunkt der Oogenese die Follikelzellen, die über der Eizelle liegen, zu einem Zwang geworden sind und die Eizelle von allen Seiten umgeben, mit Ausnahme einer kleinen Region, in der Verbindungen zu den Ammenzellen bestehen bleiben. Bringen Sie eine Eizelle mit DIC- oder Phasenkontrastoptiken in den Fokus.

Untersuchen Sie die Eizelle auf Anzeichen von Schäden, wie z. B. das Auslaufen von Zytoplasma oder das Aufblähen von Follikelzellen. Stellen Sie sich nur die Eizellen vor, die gesund und unbeschädigt erscheinen. Zur direkten Überwachung des Streamings ohne GFP-Kennzeichnung.

Stellen Sie die Erfassungsbilder im ZI-Bereich des Oszilloskops mit höheren Verstärkungseinstellungen ein als für GFP-markierte Proteine. Verwendung von Luftobjektiven, um die Abdrift und Bewegung der Probe erheblich zu minimieren. Machen Sie optische Schnitte direkt unter der Oberfläche der Eizelle.

Sobald ein interessierender Bereich scharf ist, schalten Sie die Hellfeldoptik aus und wechseln Sie mit der Schnell-Scan-Vorschaufunktion der Software zur konfokalen Bildgebung, passen Sie Fokus und Verstärkung nach Bedarf an. Legen Sie außerdem die Parameter für Anregung, Wellenlänge und eine Emissionswellenlänge fest. Wählen Sie für die Aufnahme der Z-Achse eine konstante Z-Achse mit einer Verzögerung von 10 Sekunden zwischen den Frames.

Nachdem Sie eine typische Zeitraffersequenz zwischen 20 und 50 Bildern aufgenommen haben, überprüfen und bewerten Sie sofort die Videoqualität. Dieses einzelne Zeitrafferbild zeigt eine Eizelle im Stadium 11. Diese Eizelle, die das GFP-markierte Protein R TNL eins exprimiert, kann ein starkes Signal erzeugen.

R TNL scheint mit den langen Mikrotubuli zu kolokalisieren, die während des op-plasmatischen Strömens vorhanden sind. Typischerweise ist das op-plasmatische Strömen in einer Wildtyp-Eikammer als auffällige Bewegung von autofluoreszierenden ylk-Vesikeln offensichtlich, wie in einer maximalen Projektion von fünf Bildern einer Eikammer der Stufe 10 B gezeigt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man gesunde weibliche Zyten isoliert, die GFP-markierte Proteine exprimieren, wie man Proben für die Live-Bildgebung vorbereitet und wie man Zeitraffervideos von fluoreszierenden Proteinen und Partikeln aufnimmt.