Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Einbettung von Drosophila-Embryonen zur Abbildung von Hämozyten. Ihre embryonalen Makrophagen. Die Embryonen werden von Fliegen auf Apfelsaft-Agarplatten in einem Legekäfig über Nacht abgelegt.

Am nächsten Tag wird die Agri-Platte entfernt und die Embryonen werden nach weiteren Wäschen von der Agri-Platte in ein Zellsieb gewaschen, um Ablagerungen zu entfernen. Das Zellsieb mit den Embryonen wird in Bleiche getaucht, um die Embryonen zu überziehen. Nach dem Abwaschen des Bleichmittels werden die Embryonen in ein Tröpfchen Wasser übertragen.

Das Wassertröpfchen wird dann abgesaugt und die Embryonen werden mit hello carbon oil bedeckt. Entsprechend eingelagerte Embryonen mit sichtbaren Embryonen werden zwischen zwei aufgeklebten Deckgläsern in ein Petri pro Membran übertragen und sorgfältig in Öl ausgerichtet. Anschließend wird ein drittes Deckglas über die Embryonen gestülpt und mit Nagellack verklebt.

Die Beweglichkeit der Hämozyten im Embryo kann nun durch das oberste Deckglas eines Mikroskops abgebildet werden. Hallo, ich bin Jennifer Zaed vom Brian Strm Labor in der Mietabteilung von Seoul und der Abteilung für Molekulare Biophysik am Kings College London. Und ich bin Ian Evans vom Wood Lab in der Abteilung für Biologie und Biochemie an der University of Bath.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zum Montieren von Josephs Bryo auf ein Livebild, die Hämostelle, die embryonalen Makrophagen dieses Organismus. Wir verwenden dieses Verfahren, um die Entwicklungsausbreitung und die Windreaktion auf diese wichtigen Immunzellen und die Zytoskelettmaschinerie, die sie zur Durchführung dieser Prozesse nutzen, zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie unter UAS-Kontrolle geeignete TROs OAL-Leitungen erhalten, die Hämozyten-spezifisches Gal, vier Treiber und genetisch kodierte fluoreszierende Reporter enthalten. Hier wird Serpent Gal Four verwendet, um die Expression eines fluoreszierenden roten Kernmarkers von UAS Red Stinger zu steuern. Für eine Diskussion der Bandbreite der empfohlenen GAL-Vier-Treiber und UAS-Konstrukte siehe bitte das begleitende schriftliche Protokoll, in dem 20 Drosophila jedes Geschlechts in einen Legehennenkäfig gesetzt werden.

Der Legekäfig besteht aus einer 55-Milliliter-Apfelsaft-Agri-Platte, die an der Unterseite eines Kunststoffrohrs befestigt ist, wobei das andere Ende mit Gaze bedeckt ist, um die Luftzirkulation zu ermöglichen. Alternativ kann auch ein einfacher Kunststoff-Peaker mit Löchern verwendet werden. Perforieren Sie den Boden, lassen Sie die Fliegen mindestens zwei Tage lang an den Legekäfig gewöhnen, nachdem sich die Fliegen akklimatisiert haben, wechseln Sie zu einem neuen, vorgewärmten Apfelsaftrost und lassen Sie die Fliegen über Nacht bei 25 Grad Celsius liegen.

Informationen zur Entnahme von Embryonen in diskreten Stadien finden Sie im beigefügten schriftlichen Protokoll. Sobald die Fliegen für die richtige Zeit zum Legen inkubiert sind, verwenden Sie eine Waschflasche, um etwa drei Milliliter Wasser auf die Platte aufzutragen. Dann werden mit einem weichen Pinsel die Embryonen aus dem Apfelsaft entfernt, und die entfernten Embryonen sind mit bloßem Auge leicht zu erkennen, wenn man ein Zellsieb über ein Becherglas hält.

Gießen Sie das Wasser aus dem Apfelsaft in das Zellsieb, um die Embryonen zu sammeln. Gib dann mehr Wasser zum Apfelsaft. Aate. Wiederholen Sie den Siebvorgang, bis die gewünschte Anzahl von Embryonen entnommen wurde.

Waschen Sie anschließend die Embryonen mit einer Waschflasche im Zellsieb mit etwa 10 Millilitern Wasser. Sobald die Embryonen gewaschen wurden, legen Sie das Zellsieb in den Deckel des Apfelsaftbelüftes. Fügen Sie sauberes Bleichmittel hinzu, das ausreicht, um die Embryonen im Zellsieb zu suspendieren und die Embryonen zu überziehen.

Übertragen Sie das Zellsieb und den Petrischalendeckel in ein Seziermikroskop, um die Dekoration der Embryonen zu verfolgen. Unter Hellfeldbeleuchtung ist die Dekoration abgeschlossen, wenn sich die dorsalen Anhänge aufgelöst haben, was innerhalb von zwei Minuten geschehen sollte. Nachdem die Dekoration abgeschlossen ist, nehmen Sie das Zellsieb mit den Embryonen aus dem Bleichmittel und halten Sie das Sieb wieder über ein Becherglas.

Waschen Sie mit einer Waschflasche vorsichtig, aber gründlich Bleichmittelreste ab. Tragen Sie blaues Laborgewebe auf die Unterseite des Zellsiebs auf, um das restliche Wasser abzutupfen. Wenn sich die blaue Farbe in Weiß ändert oder rosa Bleichmittelreste vorhanden sind, fahren Sie mit dem Waschen fort und stellen Sie sicher, dass alle Spuren von Bleiche entfernt wurden, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.

Das Entfernen von überschüssigem Wasser aus dem Zellsieb erleichtert im nächsten Schritt die Entnahme von Embryonen mit einem Pinsel. Sobald das gesamte Bleichmittel von den Embryonen entfernt wurde, geben Sie mit einem feinen Pinsel einen Tropfen Wasser in einen Deckel der Petrischale. Sammeln Sie alle beschichteten Embryonen aus dem Sieb und suspendieren Sie sie wieder im Tröpfchen.

Tragen Sie anschließend ein Chem-Tuch auf die Außenseite des Zellsiebs auf, um die Embryonen zu trocknen. Sobald die Embryonen getrocknet sind, fügen Sie einen Tropfen Halo-Kohlenstofföl, 700, hinzu, um alle Embryonen zu bedecken. Geben Sie dann einen zweiten kleinen Tropfen Öl neben das Tröpfchen mit den Embryonen.

Untersuchen Sie die Embryonen unter einem Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop. Identifizieren Sie geeignete Embryonen des gewünschten Genotyps, um die laterale Migration der Zyten abzubilden. Auf der ventralen Mittellinie.

Wählen Sie die Embryonen im Stadium 13 bis 14. In diesem Beispiel werden die Zyten durch die fluoreszierenden Kerne identifiziert und sind im Kopf und entlang des ventralen Nervenstrangs und des sich entwickelnden dorsalen Gefäßes sichtbar, um die Beweglichkeit der Hämos nach der Ausbreitung über den Embryo abzubilden, wählen Sie Embryonen im Stadium 15. In diesem Stadium hat sich der Hämos über den gesamten Embryo verteilt.

Auf der ventralen Seite des Embryos sollten jedoch drei parallele Hämolinien sichtbar sein, nachdem die Mittellinie seitlich gewandert ist. Sobald die Embryonen ausgewählt sind, verwenden Sie eine gebogene Uhrmacherzange der Nummer fünf, um die ausgewählten Embryonen aufzunehmen. Achten Sie darauf, die Membranen der Fläschchen nicht zu durchstechen.

Legen Sie dann die Embryonen in den zweiten Tropfen Öl auf die Unterseite einer 50 Millimeter Petri Perm Lumax-Schale. Geben Sie zwei kleine Tropfen Halo Caron Öl 700 in einem Abstand von etwa einem Zentimeter. Bringen Sie unter Hellfeldbeleuchtung an einem Präpariermikroskop einen Deckglas auf jeden Tropfen an.

Übertragen Sie vorsichtig bis zu 15 Embryonen mit einer gebogenen Pinzette. Richten Sie die Embryonen mit der Bauchseite nach oben und parallel zum Rand der Abdeckung aus. Sobald die Embryonen ausgerichtet sind, gleitet sie an einen kleinen Tropfen Öl und lässt es sich ausbreiten, um eine homogene Schicht zwischen den beiden Deckgläsern zu bilden.

Nachdem sich das Öl verteilt hat, kann dies einige Minuten dauern. Überprüfen Sie, ob die Embryonen noch ventral sind. Mit der Seite nach oben, wenn sich die Embryonen leicht gerollt haben.

Positionieren Sie sie mit der Pinzette wieder neu. Zum Schluss mit der Pinzette Nummer drei. Legen Sie ein drittes Deckglas über die Embryonen.

Überbrückung der beiden zuvor aufgeklebten Deckgläser. Kleben Sie diesen Deckglas auf den Einband. Stützen mit Nagellack schieben.

Die Embryonen sind nun bereit für die Bildgebung. Dieser SRP-Embryo mit vier UAS Red Stinger-Embryonen wurde mit der Bauchseite nach oben montiert und Zeitrafferbilder wurden mit einem Leica M 2 0 5 Fluoreszenz-Dissektionsmikroskop aufgenommen. Die Zyten werden durch ihre rot markierten Zellkerne sichtbar.

Der Film beginnt im Stadium 12 bis 13 der Entwicklung, wenn die Zyten den Kopf verlassen und entlang der ventralen Mittellinie wandern. Nach etwa einer Stunde beginnen die Zyten von der Mittellinie zu wandern und sich entlang der ventralen Oberfläche in laterale Positionen zu verteilen. Für den Rest der Entwicklung.

Die Hämozyten sind sehr aktiv und wandern durch den Embryo. Wir müssen Ihnen zeigen, wie Sie den Joseph-Embryo überwachen können, um die Bewegung oder die Hämo-Seite live in vivo zu verfolgen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Embryonen vorsichtig zu behandeln, insbesondere auf der Dauerwellenschale, um Schäden zu vermeiden, sobald die Embryonen in Öl sind, sie sind relativ widerstandsfähig gegen Austrocknung, aber es sollte darauf geachtet werden, dass die Embryonen nicht zu lange gebleicht werden, wenn die Embryonen entfernt werden.

Wenn Sie schließlich mehrere Embryonen einsetzen, haben Sie die bestmögliche Chance, einen Embryo in der perfekten Ausrichtung für die Live-Bildgebung zu erhalten. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.