Immunhistochemische Techniken zur Analyse der zellulären Proliferation und Neurogenese bei Ratten unter Verwendung des Thymidin-Analogons BrdU

Dies ist ein Schlüsselprotokoll auf dem Gebiet der Neurogenese bei Erwachsenen. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Beschreibung der Schritte, die erforderlich sind, um eine erfolgreiche Färbung zu erzielen. Diese Technik ermöglicht es, gleichzeitig spezifische Proteine zu identifizieren, die in den zu teilenden Zellen koexprimiert werden, während die Integrität des Gewebes erhalten bleibt.

Wir empfehlen, die Gewebeantikörper und -bedingungen im Voraus zu testen. Die entscheidenden Schritte sind die Membranpermeabilisierung, die sorgfältige DNA-Denaturierung und das Testen der Zeiten für Blockierungs- und Waschschritte. Die Standardisierung der Technik ist eine Herausforderung für neue Labore.

Die Reagenzienvorbereitung und die Verabreichung von Thymidinanalogon bei Nagetieren sind entscheidend für erfolgreiche Ergebnisse. Für die Verabreichung von Thymidinanalogon BrdU immobilisieren Sie die untere Bauchhöhle, um die Versuchsratte zurückzuhalten, und verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um intraperitoneal eine frisch zubereitete 50 Milligramm pro Kilogramm BrdU-Lösung in das Tier zu injizieren. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt wird das Gehirn entnommen und das Gehirn eingefroren, um die Aufnahme von 40 Mikrometer dicken Koronalschnitten mit einem Kryostat-Mikrotom zu ermöglichen, und die Schnitte in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte in Kryoschutzlösung in der Reihenfolge ihrer Entnahme gelegt. Wenn alle Schnitte entnommen sind, lagern Sie die Proben bis zu einigen Monaten bei minus 20 Grad Celsius.

Um die BrdU-Färbung zu beurteilen, überführen Sie die Scheiben unter Verwendung einer Peroxidase-Reaktion mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex auf 0,1 molare PBS, bis die Proben Raumtemperatur erreichen, und spülen Sie das Gewebe dreimal für 10 Minuten mit frischen 0,1 molaren PBS pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche werden die Schnitte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in endogener Peroxidase-Blockierungslösung inkubiert, gefolgt von drei 10-minütigen Wäschen in 0,1 molaren PBS. Nach der letzten Wäsche werden die Schnitte 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in zwei molaren Salzsäure inkubiert, gefolgt von einer 10-minütigen Spülung in 0,1 molaren Boratpuffern.

Nach drei Wäschen in eiskaltem 0,1 molaren PBS inkubieren Sie die Proben zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in PBS+-Blockierungslösung, gefolgt von einer Inkubation über Nacht mit Maus-Anti-BrdU-Primärantikörper in PBS+ bei vier Grad Celsius. Nach drei 0,1-molaren PBS-Waschungen inkubieren Sie die Proben zwei bis vier Stunden lang mit dem entsprechenden biotinylierten Maus-Sekundärantikörper in PBS+ bei Raumtemperatur. Behandeln Sie die Abschnitte nach dem Waschen eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit ABC-Lösung, gefolgt von drei 0,1-molaren PBS-Wäschen.

Nach dem letzten Waschen die Scheiben für eine zwei- bis 10-minütige Inkubation in die DAB-Peroxidase-Substratlösung geben, bis die Scheiben dunkelgrau werden. Wenn positive Zellen sichtbar sind, spülen Sie die Proben mit drei 15-minütigen Waschgängen mit Leitungswasser, gefolgt von drei 0,1-molaren PBS-Waschungen. Nach der letzten Wäsche Die Scheiben mit einer weichen Bürste vorsichtig auf gelatinierte Objektträger auflegen, um sie über Nacht bei Raumtemperatur an der Luft trocknen zu lassen.

Am nächsten Morgen verwenden Sie ein permanentes Eindeckmedium, um Deckgläser über die Proben zu legen. Um die BrdU-positiven Zellen zu quantifizieren, verwenden Sie zunächst die 4-fache Vergrößerung an einem Mikroskop, um den Gyrus dentatus zu identifizieren, und durchsuchen Sie die körnige Zellschicht entlang der Z-Achse sorgfältig nach BrdU-markierten Zellkernen. Nachdem Sie einen Intervallabschnitt für die Zellsuche im gesamten Gyrus dentatus ausgewählt haben, werden alle BrdU-positiven Zellen gezählt.

Die Morphologie des markierten Zellkerns kann sich ändern, je nachdem, wie viel BrdU die Zelle eingebaut hat. Bewegen Sie sich langsam über die Z-Achse, um alle Zellkerne von mindestens 10 Schnitten pro Tier und mindestens fünf Tieren pro Gruppe zu quantifizieren, die einen Cluster integrieren. Für die Bildentfaltung öffnen Sie das 3D-Plugin für die Beugungspunktspreizungsfunktion, geben Sie alle erforderlichen Daten ein, klicken Sie auf OK und speichern Sie die Datei.

Öffnen Sie als Nächstes das DeconvolutionLab2-Plugin und ziehen Sie das passende Z-Stack-Bild und die PSF-Datei in den entsprechenden Fensterbereich. Wählen Sie den Dekonvolutionsalgorithmus und die Anzahl der Iterationen aus und klicken Sie auf Ausführen. Um die entfalteten Bilder zu einem einzigen Z-Stapel-Bild zu kombinieren, wählen Sie Bild und Stapel aus und klicken Sie auf Z-Projekt.

Wählen Sie im Menü "Projektionstyp" die Option "Maximale Intensität". Klicken Sie auf OK und speichern Sie die Datei. Um ein RGB-Bild zu erstellen, wählen Sie Bild und Farbe und klicken Sie auf Kanäle zusammenführen, um das entsprechende Bild aus dem Dropdown-Menü auf den gewünschten Farbkanal einzustellen.

Deaktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Komposition erstellen. Klicken Sie auf OK und speichern Sie die Datei. Wenn alle Kanalbilder erstellt wurden, öffnen Sie mindestens zwei der Bilddateien, und wählen Sie für jede Bilddatei unterschiedliche Farbkanäle aus, um ein RBG-Bild zu erstellen.

In diesen Bildern sind repräsentative Abschnitte des Gyrus dentatus mit BrdU-markierten Zellen zu sehen. Wie in diesen vergrößerten Bildern der Schnitte zu sehen ist, zeigen die markierten Zellen eine intensive dunkle Färbung. Abgesehen davon gibt es signifikante Unterschiede in der BrdU-positiven Zellzahl zwischen kontrollierten Ratten, die sich nicht körperlich betätigten, und der Versuchsgruppe, die körperlicher Aktivität ausgesetzt war, was mit anderen berichteten Ergebnissen übereinstimmt, die gezeigt haben, dass körperliche Aktivität die Zellproliferation im erwachsenen Gyrus dentatus erhöht.

Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, verwenden Sie frisch zubereitete Lösungen und behandeln Sie das Gewebe schonend. Der Hippocampus ist anfällig dafür, sich von den restlichen Objektträgern zu trennen, wenn er durch ihn behandelt wird, und kann übersehen werden. Dieses Verfahren könnte für die Bewertung der DNA-Markierung und des DNA-Index der DNA-Synthese und für Studien zur Verdopplung der Zellproliferation angepasst werden.

Wir hoffen, dass diese Bemühungen für die wissenschaftliche Gemeinschaft hilfreich waren und es einfacher machen, neue Fragen bei der Erforschung der Zellproliferation zu beantworten, wenn die Immunhistochemie Technik ist.