Name: Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Generierung dreidimensionaler Motornerve-Organoide aus humanen iPS-Zellen auf einem PDMS-Mikrofluidik-Chip. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonbündelentwicklung und verbessert das Drug Screening für motorische Neuronenerkrankungen.

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Diese Studie wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) Grants-in-Aid for Scientific Research 17H05661 und 18K19903, Core-2-Core-Programm und Beyond AI Institute unterstützt.

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<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
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<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

In einem Teil dieses Protokolls wurde Jiksak Bioengineering, Inc., das von Jiro Kawada gegründet wurde, ein Patent lizenziert.

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung eines Motornervenorganoids (MNO), das ein Axonbündel hat, das aus einem motorischen Neuronensphäroid aus menschlichen iPS-Zellen ausgefahren wird. Das geformte Axonbündel ist dick, flexibel und in unidirektionalen Strukturen gut organisiert. Durch die Sezieren des Axonbündels können hochreines axonales Protein und RNA ausreichend für biochemische Analysen gewonnen werden. Die neuronale Aktivität kann in Axonbündeln und Sphäroiden mit Kalziumbildgebung gemessen werden. Eine Kontamination von kerntechnischen und dendritischen Proteinen im axonalen Lysat wurde durch westliches Blotting nicht nachgewiesen, was zeigt, dass unsere Methode Axone effizient von Zellkörpern und Dendriten trennte.
Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die schnelle Differenzierung und Generierung von MNO mit einem Axonbündel, in dem alle Prozesse in 4 Wochen mit dem 3D-Protokoll und 5-6 Wochen mit dem 2D-Protokoll durchgeführt werden können. Dies ist kurz im Vergleich zu anderen Protokollen, die in der Regel 3-4 Wochen dauern, um einfach in MN von embryonalen Stammzellen und iPS-Zellen17 zu unterscheiden, und es dauert zusätzliche 2-4 Wochen, um axonale Dehnung zu erhalten. Das 3D-Protokoll wird aufgrund der kürzeren Differenzierungszeit, weniger Schritten und reduzierten technischen Risiken ohne den Dissoziationsschritt im Vergleich zum 2D-Protokoll in der Regel gegenüber dem 2D-Protokoll bevorzugt. Der mikrofluidische Gewebekulturchip wurde so konzipiert, dass sich die Axone von MNS durch den Mikrokanal zum anderen Fach hin ausziehen können, was die Bildung eines Bündels von Axonen erleichtert, indem axo-axonale Wechselwirkungen und Affinität zwischen Axonen induzieren. Aufgrund des einfachen Versuchsaufbaus können alle hier beschriebenen Protokolle nicht nur von Bioingenieuren durchgeführt werden, die mit der Manipulation eines Gewebekulturchips vertraut sind, sondern auch von Biologen und Neurowissenschaftlern, die mit Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechniken nicht vertraut sind. Es sollte beachtet werden, dass die Schritte 1 und 2 auch mithilfe eines externen Fertigungsdienstes ausgeführt werden können.
Einer der entscheidenden Schritte zum Ausführen des Protokolls ist ein sequenzieller Wechsel des Kulturmediums. Es wird empfohlen, das Kulturmedium bei jedem Schritt während der Differenzierung vollständig zu ändern, damit Faktoren im verbrauchten Medium die MN-Differenzierung nicht stören. Ein weiterer kritischer Punkt dieses Protokolls ist die Aufrechterhaltung undifferenzierter iPS-Zellen in guter Qualität. Die Qualität der anfänglichen iPS-Zellkultur wirkt sich signifikant auf die Effizienz bei der Gewinnung von motorischen Neuronen und MNO aus. Ein weiterer Punkt ist, dass der Durchmesser von MNS kleiner sein sollte als die Größe der Bohrung des Chips (1,5 mm). Größere Sphäroide können nicht in die Kammer gelangen und können im Mittelteil eine schwere hypoxische Nekrose erleben. Die Größe von MNSs kann gesteuert werden, indem eine anfängliche Aussaatanzahl von iPS-Zellen (im 3D-Protokoll) oder motorischen Neuronen (im 2D-Protokoll) geändert wird. Die Sädichte der Zellen sollte für jede iPS-Zelllinie optimiert werden.
Unterteilte mikrofluidische Geräte mit Mikrorillen und kleinen Porenfiltern wurden häufig verwendet, um Axone von Zellkörpern und Dendriten zu trennen. Diese Technik kann auch Axone von Zellkörpern und Dendriten trennen, mit überlegener Fülle von Axonen in gebündeltem Gewebe. Im Vergleich zu den anderen Methoden besteht eine wesentliche Einschränkung dieser Methode darin, dass sie nicht zwei verschiedene Kulturmedien in der aktuellen Gestaltung des Gewebekulturchips trennen kann, was die Fähigkeit der Kokultur zweier unterschiedlicher Zellen behindert, die zwei unterschiedliche Medien erfordern. Eine weitere Einschränkung ist, dass der PDMS-Chip eine vorbestimmte Beschränkung der Größe des Gewebes vorgegeben hat. Ein Sphäroid, das größer als das Loch ist, kann nicht in die Kammer gelangen, und das Axonbündel kann nicht dicker als die Breite des mikrofluidischen Kanals werden.
Diese Methode kann auf andere Arten von Neuronen angewendet werden. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass sie in der Lage ist, einen Zerebralparesetrakt mit einer modifizierten Methode in Kombination mit zerebralen Organoidtechniken zu modellieren18. Kortikale Sphäroide wurden in beide Fächer eingeführt und die Axone spontan wechselseitig zu jedem Sphäroid gestreckt, und in der Folge bildete sich spontan ein Axonbündel. Dadurch können zwei kortikale Sphäroide durch ein Axonbündel verbunden werden, und das Gewebe konnte als ein Stück erhalten werden. Dies zeigt, dass der Ansatz sehr vielseitig ist, um Axon-Bündelgewebe unabhängig von neuronalen Zelltypen zu bilden. In diesem Protokoll wurden menschliche iPS-Zellen verwendet, jedoch können andere Stammzellen, einschließlich menschlicher ES-Zellen und menschlicher neuronaler Stammzellen, mit Änderungen am vorgestellten Protokoll verwendet werden. 3D-Sphäroide von Neuronen können durch verschiedene Protokolle19,20erzeugt werden. Diese Methode der Herstellung von Geweben mit einem Axon-Bundle kann möglicherweise in Der Zukunft mit den anderen Differenzierungsprotokollen für die Herstellung von 3D MN Sphäroid kombiniert werden. Darüber hinaus können die Dicke und Länge des Axonbündels durch einfache Änderung der Breite und Höhe der Mikrokanäle des Gewebekulturchips für zukünftige Entwicklungen gesteuert werden.
Wir glauben, dass dieses Protokoll für Arzneimitteltests und -screenings verwendet werden kann und zum Verständnis der Mechanismen beitragen kann, die der Entwicklung und Denkkrankheiten von Axonfaszien zugrunde liegen.

Spinale motorische Neuronen (MN) erweitern Axone auf Skelettmuskeln, um die Körperbewegung zu steuern. Ihre axonalen Bahnen sind im Entwicklungsprozess hoch organisiert und reguliert. Trotz vieler Studien über Axonverlängerung und Anleitung1werden die Mechanismen für die organisierte Axonbündelbildung noch untersucht. Axone von motorischen Neuronen werden oft durch neurodegenerative Erkrankungen wie amyotrophe Lateralsklerose (ALS)2geschädigt, aber pathophysiologische Mechanismen der Schäden an Axonfascicles sind schlecht verstanden. Daher ist ein physiologisches und pathologisches Modell zur Rekapitulation der Axonbündelbildung und Regression im Feld erforderlich.
Ein menschliches, von Stammzellen abgeleitetes motores Neuron ist eine vielversprechende Plattform, um die Entwicklung und Krankheiten wie ALS3zu verstehen. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können verwendet werden, um Krankheiten mit Patienten-abgeleiteten Zellen zu modellieren. Bis heute wurden verschiedene Differenzierungsmethoden von pluripotenten Stammzellen in MN4,5,6berichtet. Axone von Neuronen in zweidimensionaler Kultur sind jedoch zufällig orientiert und rekapitulieren nicht in vivo Mikroumgebung innerhalb sich entwickelnder Nerven, in denen Axone durch dichte axo-axonale Wechselwirkungen unidirektional zusammengesetzt werden7. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine Technik entwickelt, um ein dreidimensionales Gewebe zu erzeugen, das dem motorischen Nerv aus den menschlichen iPS-Zellen8ähnelt, und das Gewebe als Motornervenorganoid (MNO) bezeichnet. Das MNO besteht aus Zellkörpern, die sich in einem motorischen Neuronensphäroid (MNS) und einem axonalen Faszikel befinden, das aus dem Sphäroid ausgestreckt ist. Die Axone im Faszikel sind unidirektional ausgerichtet, was Axonen bei der Entwicklung von Motornerven ähnelt. Daher bieten MNOs auf einzigartige Weise eine physiologische axonale Mikroumgebung, was von keiner anderen zuvor entwickelten neuronalen Kulturmethode durchgeführt wurde.
In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden für die Gewebekultur-Chips-Herstellung, schnelle motorische Neurondifferenzierung und motorische Nervenorganoidbildung in entwickelten Chips. Unser Gewebekultur-Chip ist sehr einfach, und er enthält nur ein Fach zum Akzeptieren eines Sphäroids, einen Mikrokanal zur Bildung eines Axonbündels und ein Fach für das Gehäuse von Axonklemmen. Das Gerät enthält keine komplexen Strukturen, einschließlich Mikrogrooves oder Mikroporenfilter, die häufig verwendet werden, um Axone und Zellkörper nach Größe9,10zu trennen. Daher können unsere Geräte einfach hergestellt werden, indem Sie die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte befolgen, wenn ein Photolithographie-Setup verfügbar ist.
Eine schnelle Differenzierung menschlicher iPS-Zellen wird durch eine optimierte Kombination von Induzierenden und Musterfaktoren (SB431542, LDN-193189, Retinoinsäure (RA) und geglätteten Agonisten (SAG)) und Beschleunigungsfaktoren (SU5402 und DAPT) erreicht. Es wurde berichtet, dass die Kombination von SU5402 und DAPT die Differenzierung von peripheren Neuronen und neuronalen Kammzellenbeschleunigt 11. In diesem Protokoll bieten wir drei verschiedene Methoden zur Generierung von MNOs an, damit Leser sich für eine Methode entscheiden können, die ihren Bedürfnissen am besten entspricht. Wir empfehlen die Differenzierung menschlicher iPS-Zellen nach der Bildung eines Sphäroids (die 3D-Methode), da das differenzierte MNS direkt in einen Gewebekulturchip übertragen werden kann. Alternativ können menschliche iPS-Zellen in monolayer (2D)-Kultur in motorische Neuronen unterschieden und dann zu dreidimensionalen motorischen Neuronsphäroiden erzeugt werden, wie wir zuvor berichteten8. Wir haben das Protokoll aktualisiert, und mit der in diesem Protokoll beschriebenen dreidimensionalen Differenzierungsmethode kann der Übergang von 2D zu 3D vermieden werden und MNOs können mit kürzerer Differenzierungszeit, weniger Schritten und reduzierten technischen Risiken ohne den Dissoziationsschritt erhalten werden. Kommerziell erhältliche Neuronen können auch verwendet werden, um MNS zu generieren, um die Zeit für differenzierung zu reduzieren.
Um ein MNO zu generieren, haben wir ein MNS im Gewebekulturchip kultiviert. Die Axone verlängern sich aus dem Sphäroid und erstrecken sich in den Mikrokanal, in dem sich Axone unidirektional sammeln und ausrichten. Dies erleichtert die axo-axonale Interaktion und spontane Bildung eines eng zusammengesetzten unidirektionalen Bündelgewebes von Axonen im Mikrokanal, das durch dieses Protokoll einzigartig erreicht wird, während entweder eine spontane Bündelbildung oder eine geführte axonale Orientierung allein durch andere Protokolle12,13,14erreicht werden kann. In einem typischen Experiment wandern nur wenige Zellen aus Sphäroiden zum Mikrokanal und die meisten Zellen bleiben in der Nähe von Sphäroiden. Diese Methode ermöglicht es, Axone spontan von den Sphäroiden zu trennen, ohne größenabhängige physikalische Barrieren (z. B. Mikronuten oder Mikroporenfilter) zu verwenden, um Axone von Zellkörpern zu trennen.
Das resultierende MNO kann verschiedenen Untersuchungen unterzogen werden, einschließlich morphologischer, biochemischer und physikalischer Analysen. Der Zellkörper und das verlängerte Axonbündel können durch Schneiden physikalisch isoliert und für nachgelagerte Experimente, z.B. biochemische Assays, separat analysiert werden. Biologische Materialien wie RNA und Protein können aus wenigen Axonbündeln für regelmäßige biochemische Tests wie RT-PCR und Western Blotting isoliert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Motornervenorganoid aus iPS-Zellen, das ein attraktives physiologisches und pathologisches Modell bietet, um den Mechanismus zu untersuchen, der der Entwicklung und Krankheit von Axonfascicles zugrunde liegt.

<table><tbody><tr><td>(Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorsilan</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd (Formaldehyd) wässrige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&micro; l Pipettenspitzen mit breiter Bohrung</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten</td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Neurotropher Faktor aus dem Gehirn (BDNF)</td><td>Wako</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Inkubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor-reduziertes Matrigel (Basalmembranmatrix)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>iCell Motoneuron (kommerziell erhältliche humane iPS-Zell-abgeleitete Motoneuronen)</td><td>Zelluläre Dynamik</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol (IPA)</td><td>Wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Ersatz</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>MEA Sonde</td><td>Alpha MED Scientific inc</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Nicht-essentielle Aminosäurelösung (100x) (NEAA)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Glas</td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2100</td><td>Microchem</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>Prime Oberfläche 96U</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR (Passaging-Reagenz)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>Retinsäure</td><td>Wako</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>Siliziumwafer</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>Silpot 184 w/c kit</td><td>Dow Toray</td><td>Silpot 184 w/c kit</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Entwickler</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin I Antikörper</td><td>Millipore</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Flüssigkeit ohne Phenolrot (Dissoziationslösung)</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

dreidimensionale motornerve organoid generation

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Eine Faszikel von Axonen ist eines der wichtigsten strukturellen Motive im Nervensystem beobachtet. Eine Störung der Axonfaszien könnte entwicklungs- und neurodegenerative Erkrankungen verursachen. Obwohl zahlreiche Studien mit Axonen durchgeführt wurden, ist unser Verständnis der Bildung und Dysfunktion von Axonfascicles aufgrund des Mangels an robusten dreidimensionalen In-vitro-Modellen immer noch begrenzt. Hier beschreiben wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur schnellen Generierung eines Motornervenorganoids (MNO) aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) in einem mikrofluidischen Gewebekulturchip. Zunächst wird die Herstellung von Chips beschrieben, die für das Verfahren verwendet werden. Aus menschlichen iPS-Zellen wird ein motorischer Neuronsphäroid (MNS) gebildet. Als nächstes wird das differenzierte MNS in den Chip übertragen. Danach wachsen Axone spontan aus dem Sphäroid heraus und fügen sich in einem Mikrokanal, der im Chip ausgestattet ist, zu einem Faszikel zusammen, der ein MNO-Gewebe erzeugt, das ein Bündel von Axonen trägt, das aus dem Sphäroid ausgestreckt wird. Für die nachgelagerte Analyse können MNOs aus dem Chip entnommen werden, um für morphologische Analysen fixiert oder für biochemische Analysen sowie Kalzium-Bildgebung und Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen seziert zu werden. Mit diesem Protokoll generierte MNOs können Arzneimitteltests und -screenings erleichtern und zum Verständnis der Mechanismen beitragen, die der Entwicklung und Erkrankungen von Axonfaszikeln zugrunde liegen.

Motorneuronen wurden innerhalb von 12-14 Tagen in 3D-Differenzierungsverfahren unterschieden (Abbildung 4 und Abbildung 5). Wichtig ist, dass mehr als 60% der Zellen während der Differenzierung den motorischen Neuronenmarker HB9 exprimiert haben. Die Immunhistochemie ergab, dass etwa 80% der Zellen im MNS SMI32-positive motorische Neuronen waren. HB9 und SMI32 sind die etablierten motorischen Neuronmarker im Frühstadium15,16. Die Expression von HB9 und SMI32 sind die wichtigsten Parameter, die bestätigt werden müssen, um die zelluläre Identität der motorischen Neuronen zu gewährleisten. Nach der Einführung eines MNS in den Kulturchip erstrecken sich Axone in den Kanal und ein Axonbündel bildet sich. Durch Mikrokanäle, die als physikalische Leitfäden dienen, erlängen sich Axone aus dem MNS und bilden ein Bündel durch axo-axonale Wechselwirkung (Abbildung 6A). Es ist wichtig, die Bildung des Axonbündels durch mikroskopische Beobachtung zu bestätigen, um die Erzeugung eines MNO zu bestätigen. Ein erfolgreiches MNO trägt ein Axonbündel, das breiter als 50 m ist, und wenige isolierte Axone aus dem Bündel im Kanal. Die anfängliche Dehnung der Axone kann 24 Stunden nach der Einführung des Sphäroids beobachtet werden. Innerhalb der nächsten 3-4 Tage erreichten die Axone die Mitte des Mikrokanals und erreichten dann innerhalb von weiteren 10 Tagen das andere Ende(Abbildung 6A). Folglich sammelten sich die Axone und bildeten ein gerades und unidirektionales Bündel in 2-3 Wochen in einem Chip, und danach wurden neuronale Aktivitäten beobachtet.
Motornervenorganoide können aus dem Chip gesammelt werden, indem das PDMS aus dem Mikroskopglas für die biologische Analyse abgelöst wird (Abbildung 6B). Axonbündel und Zellkörper können durch Schneiden mit einem chirurgischen Messer oder einer Pinzette unter dem Mikroskop seziert und isoliert werden (Abbildung 6B). Diese biologischen Materialien einschließlich RNA und Protein können für regelmäßige biochemische Tests wie RT-PCR und Western Blotting verwendet werden. In Axonbündeln von MNOs werden nukleare oder dendritische Herstellerproteine bei der westlichen Blotting nicht nachgewiesen (Abbildung 6C).
In Kombination mit einem Kalziumindikator (Fluo-4 AM) kann die neuronale Aktivität im Gewebekulturchip erfasst werden. Spontane Aktivität von motorischen Neuronen im Sphäroid und im Axonbündel wurde innerhalb des MNO beobachtet. Auch wurden die neuronalen Aktivitäten mit Hilfe eines Multi-Elektroden-Array-Systems beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Abbildung 1: Die Dimension des PDMS-Gewebekulturchips. (A) Fotomaske des Gewebekulturchips. (B) Abmessungen des Mikrokanals im Gewebekulturchip. Der Durchmesser der Basiskammer zum Halten des motorischen Neuronsphäroids beträgt 2 mm und das Loch von PDMS über der Kammer 1,5 mm. Die Breite und Höhe eines Mikrokanals, der zwei Kammern überbrückt, sind beide 150 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Darstellung der motorischen Neuronendifferenzierung. (A) Die Differenzierungsschritte beinhalteten die neuronale Induktion, die Musterung in die Motorneuronenlinie und die Reifung der motorischen Neuronen. (B) Zwei Optionen zum Erstellen von Motorneuronsphäroid (MNS) aus iPS-Zellen: 3D-Protokoll und ein 2D-Protokoll mit Dissoziationsschritt von motorischen Neuronen. Motornervenorganoid (MNO) kann durch beide Protokolle erhalten werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Abbildung 3: Schritt-für-Schritt-Protokoll für Keller-Membran-Matrix-Beschichtung und Motorneuron-Sphäroid-Einführung. (A) Kellermembran-Matrixbeschichtung im Kanal des Gewebekulturchips. (B) MNS-Einführung in das Loch des Chips. (C) Kulturmedium veränderung durch Streben nach erschöpftem Medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Abbildung 4: Differenzierung von 2D- und 3D-Motorneuronen. (A) Zeitverlauf der repräsentativen 3D-MNS-Differenzierung (3D-Protokoll). Die Größe des MNS nahm im Laufe der Zeit allmählich zu. Maßstabsleiste: 500 m. (B) Zeitverlauf der 2D-Differenzierung auf -D2, D0, D1, D6, D12 (2D-Protokoll). Maßstabsleiste: 500 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Abbildung 5: Charakterisierung der motorischen Neuronen. (A) (Links) Eine Kryosektion eines MNS, der mit SMI-32-Antikörper und DAPI gefärbt ist. (Mitte) Ein Phasenkontrastbild von neu beschichtetem MNS auf einer mit der Kellermembran beschichteten Oberfläche. Axonale Dehnung wurde beobachtet. (Rechts) Axone von replated MNS mit Synapsin I und Tuj1 Antikörpern gefärbt. Skalenbalken: 500 m (Links und Mitte) und 50 m (rechts). (B) Ein repräsentatives Bild von 2D-Motorneuronen, die mit Tuj- und HB9-Antikörpern immunostainiert sind. Maßstabsleiste: 200 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Abbildung 6: Charakterisierung eines Motornervenorganoids (MNO), das in einem Kulturchip erzeugt wird. (A) Repräsentative Bilder der Axondehnung und der dicken Axonbündelbildung auf D32. Maßstabsleiste: 500 m. (B) Immunostainierung des Motornervenorganoids (MNO) durch SMI-32 und DAPI. Axone und Zellkörper können durch physikalisch schneiden isoliert werden. Scale bar: 1 mm. (C) Reinheit des Proteins aus Axonen und Zellkörpern, quantifiziert durch western Blotting. MAP2, ein dendritischer Marker, wurde im axonalen Protein nicht nachgewiesen, während der axonale Marker Tau1 im axonalen Protein angereichert ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Herstellung des menschlichen iPS-Zell-abgeleiteten motorischen Nervenorganoids durch spontane Montage eines robusten Bündels von Axonen, das von einem Sphäroid in einem Gewebekulturchip erweitert wird.

Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung der Mechanismen, die der Entwicklung und der Erkrankung von Axonbündeln zugrunde liegen, mit Hilfe von motorischen Nervenorganoiden, die aus den menschlichen iPS-Zellen außerhalb des Körpers gewonnen werden. Durch die einfache Kultivierung von neuronalen Sphäroiden und maßgeschneiderten Mikrokulturchips können unidirektionale Axonbündel spontan erzeugt und für verschiedene nachgelagerte Experimente verwendet werden. Motorische Nervenorganoide können das Screening und Testen von Medikamenten für Motoneuronenerkrankungen, einschließlich LS, erleichtern, indem sie ein physiologischeres Modell als frühere In-vitro-Systeme bereitstellen.Geben Sie in einem Abzug und mit der entsprechenden PSA drei Milliliter SU-8 2100 auf einen mit Aceton gereinigten Siliziumwafer und platzieren Sie den Wafer in der Mitte eines Spin-Coaters. Fixieren Sie den Wafer durch Vakuum und drehen Sie den Wafer 10 Sekunden lang mit 500 Umdrehungen pro Minute, um das SU-8 gleichmäßig über die Waferoberfläche zu beschichten, dann drehen Sie den Wafer 30 Sekunden lang mit einer Beschleunigung von 300 Umdrehungen pro Sekunde mit 1.500 Umdrehungen pro Minute, um eine 150 Mikrometer dicke Schicht Fotolack auf dem Wafer zu erhalten. Setzen Sie die Fotomaske nach dem weichen Backen auf den Masken-Aligner und setzen Sie den Wafer 60 Sekunden lang ultraviolettem Licht aus.Nach dem Backen auf einer heißen Platte entwickeln Sie den Wafer 10 bis 20 Minuten lang in einem Fotolackentwickler unter Rühren auf einem Orbitalschüttler und wechseln Sie die Entwicklungslösung einmal während des Prozesses. Um die untere Schicht des Chips für die Gewebekultur vorzubereiten, gießen Sie frisch vorbereitetes PDMS auf den Wafer in der gewünschten Dicke und entgasen Sie das Gemisch in einer Vakuumkammer. Härten Sie das PDMS mindestens drei Stunden lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius aus.Schneiden Sie nach dem Abkühlen mit einer Klinge das ausgehärtete PDMS vom Wafer ab, und verwenden Sie dann nicht ausgehärtetes PDMS mit Backen, um ein mittleres Reservoir mit der PDMS-Unterschicht zu verbinden, um den zusammengesetzten PDMS-Gewebekulturchip zu erhalten. Um den PDMS-Chip für die Bildung von motorischen Nervenorganoiden vorzubereiten, sterilisieren Sie den Chip und ein 76 x 52 Millimeter großes Mikroskopglas in einer Petrischale, die 70 % Ethanol enthält, für mindestens eine Stunde. Legen Sie den Chip am Ende der Inkubation auf das Nassmikroskopglas.Nach dem Trocknen über Nacht sollte der Chip am Glas haften. Geben Sie ein 30-Mikroliter-Tröpfchen verdünnter Basalmembranmatrix in DMEM/F12 auf eine Seite des Einlasses des Kanals und aspirieren Sie die Lösung von der anderen Seite des Einlasses, um die Oberfläche des Mikrokanals mit der Matrix zu beschichten. Anschließend wird der PDMS-Chip mit der Beschichtungslösung in einer Petrischale eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.Um die Differenzierung von 3D-iPS-Zellen in Motoneuronen zu induzieren, säen Sie viermal 10 bis vierte iPS-Zellen pro Vertiefung in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte in 100 Mikroliter Feeder- und serumfreies Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 mikromolaren Y-27632, aus. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter KSR-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB431542 und 100 nanomolaren LDN-193189. Ersetzen Sie an den Tagen zwei und drei die Überstände durch 100 Mikroliter KSR-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB431542, 100 nanomolaren LDN-193189, fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten.An den Tagen vier und fünf ersetzen Sie die Überstände durch eine Mischung aus 75 % KSR-Medium und 25 % N2-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB431542, 100 nanomolaren LDN193189, fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten. An den Tagen sechs und sieben ersetzen Sie die Überstände durch eine Mischung aus 50 % KSR-Medium und 50 % N2-Medium, ergänzt mit fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten. Ersetzen Sie an den Tagen acht und neun die Überstände durch eine Mischung aus 25 % KSR-Medium und 75 % N2-Medium, ergänzt mit fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten.Ersetzen Sie an den Tagen 10 und 11 die Überstände durch N2-Medium, das mit fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten ergänzt wird. Ersetzen Sie an Tag 12 die Überstände in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter Reifungsmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophen Faktor aus dem Gehirn pro Vertiefung. Um die Bildung von motorischen Nervenorganoiden zu induzieren, ersetzen Sie die Beschichtungslösung im PDMS-Chip durch 150 Mikroliter Reifungsmedium, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors ergänzt wird, und verwenden Sie eine Mikropipetspitze mit breiter Bohrung, um Motoneuronen-Sphäroide vorsichtig aus einer Vertiefung der 96-Well-Platte in den Einlass des Mikrokanals des Chips hinzuzufügen.Platzieren Sie ein kleines Reservoir mit sterilem Wasser in der Nähe des Gewebekulturchips in der Schale, um eine mittlere Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie die Schale in einen 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des erschöpften Nährmediums aus der Mitte des Mediumreservoirs durch frisches Reifungsmedium, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophen Faktors aus dem Gehirn ergänzt wird. Axone wachsen vom Sphäroid des Motoneurons in den Kanal hinein und fügen sich über einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen spontan zu einem einzigen Bündel zusammen, um ein motorisches Nervenorganoid zu bilden.Motoneuronen differenzieren sich innerhalb von 12 bis 14 Tagen in 3D-Differenzierungsverfahren. Wichtig ist, dass mehr als 60% der Zellen während der Differenzierung den Motoneuron-Marker HB9 exprimieren und etwa 80% der Zellen im Motoneuron-Sphäroid SMI32-positiv sind. Mit dem Mikrokanal, der als physikalische Führung dient, verlängern sich die Axone vom Sphäroid des Motoneurons innerhalb von 24 Stunden nach der Einführung in das Sphäroid zu einer gebündelten axo-axonalen Interaktion.Die Axone erreichten innerhalb der nächsten drei bis vier Tage das Zentrum des Mikrokanals und dehnten sich nach weiteren 10 Tagen bis zum anderen Ende des Mikrokanals aus. Motorische Nervenorganoide können für die biologische Analyse vom Chip entnommen werden, indem das PDMS vom Mikroskopglas gelöst wird. Die Axonbündel und Zellkörper können dann mit einem chirurgischen Messer oder einer Pinzette präpariert und unter dem Mikroskop isoliert werden.In Axonbündeln von motorischen Nervenorganoiden werden dendritische Markerproteine durch Western Blot nicht nachgewiesen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Sphäroide vollständig auf den Boden des Kulturchips fallen. Wir zeigten, dass die Untersuchung der Stellen und der Boden helfen kann, die Position des Sphäroids im Chip zu bestimmen.Die isolierten Axonbündel können für verschiedene zusätzliche Methoden untersucht werden. Eine große Menge an Axonen kann gewonnen und für biochemische Assays verwendet werden, die erhebliche Materialien erfordern.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Video zeigt die Bildung von neuromuskulären Verbindungen mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts. Neuronale Vorläuferzellen und Muskelvorläuferzellen werden in verschiedene Vertiefungen innerhalb des Geräts ausgesät und zu Motoneuronen bzw. Myotuben reifen gelassen. Die Bildung eines Volumens und eines chemischen Gradienten führt zur Entwicklung aktiver neuromuskulärer Verbindungen.

Erzeugung neuromuskulärer Verbindungen mit einem mikrofluidischen Gerät

Dieses Video demonstriert die Methode zur Herstellung von motorischen Nervenorganoiden, indem zuerst humane induzierte pluripotente Stammzellen in einem speziellen Medium kultiviert werden, um Sphäroide zu bilden, dann mit spezifischen Inhibitoren in Motoneuronen differenziert und schließlich in einem mikrofluidischen Chip kultiviert werden, um Axone zu verlängern und motorische Nervenorganoide zu bilden.

Entwicklung von humanen iPSC-abgeleiteten motorischen Nervenorganoiden mit einem mikrofluidischen Chip

Dieses Video zeigt die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) in dopaminerge Neuronen, um ein Modell für die Untersuchung der Parkinson-Krankheit bereitzustellen. Die hES-Zellen werden in einem neuronalen Induktionsmedium in einer Mikrotiterplatte kultiviert, um 3D-Neurosphären zu bilden. Diese werden dann in einem neuronalen Induktionsmedium kultiviert, um die Differenzierung in dopaminerge Vorläuferneuronen zu fördern. Die endgültige Reifung der Neuronen erfolgt in einem...

Erzeugung dopaminerger neuronaler Organoide aus humanen embryonalen Stammzellen

Diese Studie stellt Protokolle vor und beschreibt Protokolle, um zwei spezifische menschliche neurale Organoide als relevantes und genaues Modell für die Untersuchung von 1) der Entwicklung des menschlichen Glioblastoms innerhalb menschlicher neuronaler Organoide ausschließlich beim Menschen und 2) neuronendopaminergen Organoiden abzuleiten. Differenzierung, die ein dreidimensionales Organoid erzeugt.

Human neurale Organoide zur Untersuchung von Hirntumor und neurodegenerativen Erkrankungen

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung menschlicher motorischer Einheiten in kommerziell erhältlichen mikrofluidischen Geräten durch Kokulturierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Motoneuronen mit humanen primären Mesoangioblasten-abgeleiteten Myotuben, was zur Bildung funktionell aktiver neuromuskulärer Verbindungen führt.

Erzeugung humanmotorischer Einheiten mit funktionellen neuromuskulären Verbindungen in mikrofluidischen Geräten

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Hirnorganoiden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen). Um Gehirnorganoide in großen Mengen und von hoher Qualität zu erhalten, verwenden wir hausgemachte Mini-Bioreaktoren.

Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

In dieser Studie stellen wir eine detaillierte Technik für ein einfaches, aber robustes kortikales Organoid-Kultursystem unter Verwendung von standardmäßigen feederfreien hPSC-Kulturen zur Verfügung. Dies ist ein schnelles, effizientes und reproduzierbares Protokoll zur Erzeugung von Organoiden, die Aspekte der Hirnseneszenz in vitro modellieren.

Robuste und hochreproduzierbare Erzeugung kortikaler Hirnorganoide zur Modellierung der neuronalen Seneszenz des Gehirns in vitro

Obwohl die peripheren Nervensystem (PNS) in der Lage ist signifikant Reparatur nach Verletzung, ist wenig über die zellulären und molekularen Mechanismen, die dieses Phänomen regeln bekannt. Mit Live-transgene Zebrafisch und einer reproduzierbaren Nervendurchtrennung Assay können wir dynamische Gliazellen Verhalten während Nerv Degeneration und Regeneration zu studieren.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

Astrozyten im ZNS verändern ihre funktionellen und strukturellen Eigenschaften als Reaktion auf schädliche Reize. Dieser Bericht stellt ein Protokoll zur Beurteilung der dreidimensionalen Astrozytenmorphologie bei Erkrankungen oder nach therapeutischen Eingriffen vor.

Protokoll zur dreidimensionalen konfokalen morphometrische Analyse der Astrozyten

Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.

Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern

Erfahren Sie die Generierung dreidimensionaler Motornerve-Organoide aus humanen iPS-Zellen auf einem PDMS-Mikrofluidik-Chip. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Axonbündelentwicklung und verbessert das Drug Screening für motorische Neuronenerkrankungen.

Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

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