Dreidimensionale Motornerve Organoid Generation

Dieses Protokoll erleichtert die Untersuchung der Mechanismen, die der Entwicklung und der Erkrankung von Axonbündeln zugrunde liegen, mit Hilfe von motorischen Nervenorganoiden, die aus den menschlichen iPS-Zellen außerhalb des Körpers gewonnen werden. Durch die einfache Kultivierung von neuronalen Sphäroiden und maßgeschneiderten Mikrokulturchips können unidirektionale Axonbündel spontan erzeugt und für verschiedene nachgelagerte Experimente verwendet werden. Motorische Nervenorganoide können das Screening und Testen von Medikamenten für Motoneuronenerkrankungen, einschließlich LS, erleichtern, indem sie ein physiologischeres Modell als frühere In-vitro-Systeme bereitstellen.

Geben Sie in einem Abzug und mit der entsprechenden PSA drei Milliliter SU-8 2100 auf einen mit Aceton gereinigten Siliziumwafer und platzieren Sie den Wafer in der Mitte eines Spin-Coaters. Fixieren Sie den Wafer durch Vakuum und drehen Sie den Wafer 10 Sekunden lang mit 500 Umdrehungen pro Minute, um das SU-8 gleichmäßig über die Waferoberfläche zu beschichten, dann drehen Sie den Wafer 30 Sekunden lang mit einer Beschleunigung von 300 Umdrehungen pro Sekunde mit 1.500 Umdrehungen pro Minute, um eine 150 Mikrometer dicke Schicht Fotolack auf dem Wafer zu erhalten. Setzen Sie die Fotomaske nach dem weichen Backen auf den Masken-Aligner und setzen Sie den Wafer 60 Sekunden lang ultraviolettem Licht aus.

Nach dem Backen auf einer heißen Platte entwickeln Sie den Wafer 10 bis 20 Minuten lang in einem Fotolackentwickler unter Rühren auf einem Orbitalschüttler und wechseln Sie die Entwicklungslösung einmal während des Prozesses. Um die untere Schicht des Chips für die Gewebekultur vorzubereiten, gießen Sie frisch vorbereitetes PDMS auf den Wafer in der gewünschten Dicke und entgasen Sie das Gemisch in einer Vakuumkammer. Härten Sie das PDMS mindestens drei Stunden lang in einem Ofen bei 60 Grad Celsius aus.

Schneiden Sie nach dem Abkühlen mit einer Klinge das ausgehärtete PDMS vom Wafer ab, und verwenden Sie dann nicht ausgehärtetes PDMS mit Backen, um ein mittleres Reservoir mit der PDMS-Unterschicht zu verbinden, um den zusammengesetzten PDMS-Gewebekulturchip zu erhalten. Um den PDMS-Chip für die Bildung von motorischen Nervenorganoiden vorzubereiten, sterilisieren Sie den Chip und ein 76 x 52 Millimeter großes Mikroskopglas in einer Petrischale, die 70 % Ethanol enthält, für mindestens eine Stunde. Legen Sie den Chip am Ende der Inkubation auf das Nassmikroskopglas.

Nach dem Trocknen über Nacht sollte der Chip am Glas haften. Geben Sie ein 30-Mikroliter-Tröpfchen verdünnter Basalmembranmatrix in DMEM/F12 auf eine Seite des Einlasses des Kanals und aspirieren Sie die Lösung von der anderen Seite des Einlasses, um die Oberfläche des Mikrokanals mit der Matrix zu beschichten. Anschließend wird der PDMS-Chip mit der Beschichtungslösung in einer Petrischale eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Um die Differenzierung von 3D-iPS-Zellen in Motoneuronen zu induzieren, säen Sie viermal 10 bis vierte iPS-Zellen pro Vertiefung in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer 96-Well-U-Bodenplatte in 100 Mikroliter Feeder- und serumfreies Zellkulturmedium, ergänzt mit 10 mikromolaren Y-27632, aus. Ersetzen Sie am nächsten Tag den Überstand in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter KSR-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB431542 und 100 nanomolaren LDN-193189. Ersetzen Sie an den Tagen zwei und drei die Überstände durch 100 Mikroliter KSR-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB431542, 100 nanomolaren LDN-193189, fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten.

An den Tagen vier und fünf ersetzen Sie die Überstände durch eine Mischung aus 75 % KSR-Medium und 25 % N2-Medium, ergänzt mit 10 mikromolaren SB431542, 100 nanomolaren LDN193189, fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten. An den Tagen sechs und sieben ersetzen Sie die Überstände durch eine Mischung aus 50 % KSR-Medium und 50 % N2-Medium, ergänzt mit fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten. Ersetzen Sie an den Tagen acht und neun die Überstände durch eine Mischung aus 25 % KSR-Medium und 75 % N2-Medium, ergänzt mit fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten.

Ersetzen Sie an den Tagen 10 und 11 die Überstände durch N2-Medium, das mit fünf mikromolaren DAPT, fünf mikromolaren SU5402, einer mikromolaren Retinsäure und einem mikromolaren geglätteten Agonisten ergänzt wird. Ersetzen Sie an Tag 12 die Überstände in jeder Vertiefung durch 100 Mikroliter Reifungsmedium, ergänzt mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophen Faktor aus dem Gehirn pro Vertiefung. Um die Bildung von motorischen Nervenorganoiden zu induzieren, ersetzen Sie die Beschichtungslösung im PDMS-Chip durch 150 Mikroliter Reifungsmedium, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter des vom Gehirn abgeleiteten neurotrophen Faktors ergänzt wird, und verwenden Sie eine Mikropipetspitze mit breiter Bohrung, um Motoneuronen-Sphäroide vorsichtig aus einer Vertiefung der 96-Well-Platte in den Einlass des Mikrokanals des Chips hinzuzufügen.

Platzieren Sie ein kleines Reservoir mit sterilem Wasser in der Nähe des Gewebekulturchips in der Schale, um eine mittlere Verdunstung zu verhindern, und stellen Sie die Schale in einen 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage die Hälfte des erschöpften Nährmediums aus der Mitte des Mediumreservoirs durch frisches Reifungsmedium, das mit 20 Nanogramm pro Milliliter neurotrophen Faktors aus dem Gehirn ergänzt wird. Axone wachsen vom Sphäroid des Motoneurons in den Kanal hinein und fügen sich über einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen spontan zu einem einzigen Bündel zusammen, um ein motorisches Nervenorganoid zu bilden.

Motoneuronen differenzieren sich innerhalb von 12 bis 14 Tagen in 3D-Differenzierungsverfahren. Wichtig ist, dass mehr als 60% der Zellen während der Differenzierung den Motoneuron-Marker HB9 exprimieren und etwa 80% der Zellen im Motoneuron-Sphäroid SMI32-positiv sind. Mit dem Mikrokanal, der als physikalische Führung dient, verlängern sich die Axone vom Sphäroid des Motoneurons innerhalb von 24 Stunden nach der Einführung in das Sphäroid zu einer gebündelten axo-axonalen Interaktion.

Die Axone erreichten innerhalb der nächsten drei bis vier Tage das Zentrum des Mikrokanals und dehnten sich nach weiteren 10 Tagen bis zum anderen Ende des Mikrokanals aus. Motorische Nervenorganoide können für die biologische Analyse vom Chip entnommen werden, indem das PDMS vom Mikroskopglas gelöst wird. Die Axonbündel und Zellkörper können dann mit einem chirurgischen Messer oder einer Pinzette präpariert und unter dem Mikroskop isoliert werden.

In Axonbündeln von motorischen Nervenorganoiden werden dendritische Markerproteine durch Western Blot nicht nachgewiesen. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Sphäroide vollständig auf den Boden des Kulturchips fallen. Wir zeigten, dass die Untersuchung der Stellen und der Boden helfen kann, die Position des Sphäroids im Chip zu bestimmen.

Die isolierten Axonbündel können für verschiedene zusätzliche Methoden untersucht werden. Eine große Menge an Axonen kann gewonnen und für biochemische Assays verwendet werden, die erhebliche Materialien erfordern.