Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um arrayed lentivirale oder retrovirale Assay-Bibliotheken zu überprüfen, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell, mittlerer Durchsatz und kostengünstig ist und geräte und Reagenzien verwendet, die für die meisten Forscher allgemein zugänglich sind. Um jeden lentiviralen Vektor in der Bibliothek zu erweitern und zu reinigen, fügen Sie zunächst 1,3 Milliliter Luria-Brühe hinzu, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in jeden Brunnen einer 96-Well-Tiefenbrunnenplatte.

Impfen Sie jeden Brunnen mit zwei Mikroliter Glyzerin-Lager für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie am nächsten Tag jede Bakterienkultur in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren zur Zentrifugation. Reinigen Sie jeden Vektor mit einem geeigneten bakteriellen Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.