Name: Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Lernen Sie ein Medium-Throughput-Screening mit Arrayed-Libraries und Dual-Luciferase-Reporter zur Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern in Krebszellen. Diese kostengünstige Methode ist schnell und zugänglich.

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Wir danken Emily Norton und Mikaelan Cucciarre-Stuligross für die Unterstützung bei der Herstellung von shRNA-Vektoren. Diese Arbeit wurde teilweise von einem Susan G. Komen Career Catalyst Grant unterstützt, der J.M.L. (#CCR17477184) verliehen wurde.

HINWEIS: Eine schematische Zusammenfassung dieses Protokolls ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Lentivirale Vektorbibliotheksvorbereitung
HINWEIS: Der demonstrierte Bildschirm verwendete eine angeordnete shRNA-Bibliothek, die als Glycerinbestände in 96-Well-Platten gekauft wurde, aber Bibliotheken können auch manuell basierend auf einer Kandidatenliste zusammengestellt werden. Entsprechende Kontrollen sollten in Betracht gezogen und in jede Bibliothek aufgenommen werden. Dazu gehören eine nicht zielgerichtete Kontroll-shRNA (shNTC), eine Kontroll-shRNA, die auf den untersuchten Transkriptionsfaktor abzielt, und, wenn möglich, eine shRNA, die auf Galleife zielt.
<ol><li>Fügen Sie 1,3 ml Luria Broth (LB) (1% Bacto-Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, pH 7,5) mit 100 g/ml Ampicillin zu jedem Brunnen einer 96-Well-Tiefenbohrung hinzu. Impfen Sie jeden Brunnen mit 2 l Glyzerinbestand und wachsen bei 37 °C über Nacht bei konstanter Rührung bei 225 U/min.</li>
	<li>Jede Bakterienkultur in ein 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen und die Bakterien durch Zentrifugation bei 21.000 x g bei 4 °C 10 min pellet.</li>
	<li>Reinigen Sie jeden Vektor mit einem bakteriellen Mini-Prep-Kit, indem Sie dem Herstellerprotokoll folgen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration jedes Vektors mit einem Spektralphotometer.</li>
	<li>Die Plasmide bei -20 °C lagern. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>2. Verpackung der arrayierten lentiviralen Bibliothek
HINWEIS: Alle Arbeiten mit Lentivirus, einschließlich Verpackung, Infektion und anschließender Kultivierung infizierter Zellen, sollten sich strikt an die institutionellen Vorschriften und Vorschriften für die biologische Sicherheit halten.
<ol><li>Erweitern Sie die 293FT-Zellen mit vollständigen Wachstumsmedien (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 4 mM L-Glutamin, 4.500 mg/L Glucose und Natriumpyruvat, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin-Antibiotikum und 2 mM L-Glutamin).</li>
	<li>Für jeden Vektor in der Bibliothek ab Schritt 1.4, Samen eine 24-Well mit 1 x 105 293FT Zellen. HINWEIS: Es wird empfohlen, einige zusätzliche Brunnen eines Kontrollvirusvektors zu verpacken und zu verwenden, um den Titer des Virus zu testen, bevor Sie mit Schritt 3 fortfahren (siehe unten).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h. HINWEIS: Ein allgemeines Protokoll für die Verpackung von Lentivirus, das zuvor14 beschrieben wurde, wurde für dieses Protokoll auf 24 Brunnen skaliert. Es verwendet psPAX2 für lentivirale Verpackungen und VSVG als Mantelprotein. Wenn ektropes Virus gewünscht wird, kann ein Vektor, der Eco liefert, anstelle von VSVG verwendet werden. Es wird dringend empfohlen, dass dieses Protokoll optimiert wird, um einen viralen Titer zu erreichen, der zwischen 30% -70% Infektionseffizienz der Zielzellen ergibt (siehe Diskussion). Eine Liste aller verwendeten Vektoren finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1.</li>
	<li>Richten Sie für jeden viralen Vektor aus Schritt 1.4 eine Transfektionsmischung ein, wie unten beschrieben. Jede Transfektion sollte 250 ng des viralen Vektors, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 l Transfektionsreagenz 1 und 23,75 l Transfektionspuffer enthalten (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Verdünnen Sie jeden lentiviralen Vektor mit nukleasefreiem Wasser auf 50 ng/l, und übertragen Sie dann 5 l (250 ng) in einen Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.</li>
		<li>Machen Sie die Transfektion super mischen, indem Sie 1,25 l * X des Transfektionsreagenz 1 und 23,75 L * X des vorgewärmten Transfektionspuffers, wobei "X" die Gesamtzahl der Transfektionen plus mehrere zusätzliche Volumenverluste während des Pipetierens zu berücksichtigen ist.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Transfektion Super-Mix bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie 125 ng * X von psPAX2 und 125 ng * X von VSVG auf das Rohr der Transfektion Super-Mix aus Schritt 2.4.3 und sanft Pipetten nach oben und unten zu mischen. Fahren Sie schnell mit Schritt 2.4.5 fort.</li>
		<li>Sofort aliquot die Mischung aus Schritt 2.4.4 in jedes Rohr eines PCR-Streifens, und dann verwenden Sie Mehrkanal-Pipette, um 25 l das Gemisch in jeden Brunnen enthaltenden viralen Vektor aus Schritt 2.4.1 zu übertragen.</li>
		<li>Bei Raumtemperatur 20 min inkubieren.</li>
		<li>Übertragen Sie alle 30 L aus jedem 96-Well aus Schritt 2.4.6 in einen Brunnen der 24-Well-haltigen 293 FT-Zellen aus Schritt 2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h und ersetzen Sie dann die Medien in jedem Brunnen der 24-Well-Platte durch 500 l frische komplette Wachstumsmedien. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für weitere 24 h.</li>
	<li>Mit einer Mehrkanal-Pipette, sammeln Sie den viralen Überstand aus jedem Brunnen und aliquot 220 l (genug für 1 Infektion in Schritt 3 plus etwas zusätzliches Volumen) in zwei 96-Wells jeweils. Dies sind die angeordneten viralen Überstandplatten.</li>
	<li>Bewahren Sie die angeordneten viralen Überstandplatten bei -80 °C auf. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Es wird auch empfohlen, einige der zusätzlichen Kontrollvirus zu testen, die verpackt wurde (siehe oben) auf den Zellen infiziert werden, bevor Sie mit Schritt 3 fortfahren. Dadurch soll sichergestellt werden, dass der Titer ausreicht, um eine Infektionseffizienz von mindestens 30 % zu erreichen.</li>
</ol>3. Infektion der Zellen für den Bildschirm
HINWEIS: Menschliche Melanomzellen (A375) wurden verwendet, um diesen Ansatz zu demonstrieren, aber diese Methode kann auf alle anhaftenden Zellen angewendet werden, die mit Lentivirus infizieren. Die Zellkultur und die Beschichtungsbedingungen sollten jedoch für jede Zelllinie optimiert werden (siehe Diskussion).
<ol><li>Erweitern Sie die Zellen, die in vollständigen Wachstumsmedien infiziert werden sollen.</li>
	<li>Samen 24-Well-Platten mit 1 x 105 Zellen in 0,5 ml komplettem Wachstumsmedium pro Brunnen. Seed ein Gut für jeden viralen Vektor getestet werden (einschließlich Kontrollen) und enthalten einen zusätzlichen Brunnen, der nicht infiziert werden, die als Kontrolle für die Arzneimittelauswahl in Schritt 3.7 dienen wird.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.</li>
	<li>Infizieren Sie jeden Brunnen aus Schritt 3.2 mit einem anderen viralen Überstand aus dem gefrorenen arrayed lentiviral überstand wie folgt.<ol>
<li>Bereiten Sie vollständige Wachstumsmedien vor, die 20 g/ml Polybren enthalten.</li>
		<li>Tauen Sie die arrayed lentiviral Bibliothek Überräube von Schritt 2.7 auf Raumtemperatur.</li>
		<li>Saugen Sie die Wachstumsmedien aus den 24-Well-Platten aus Schritt 3.2 und fügen Sie sofort 200 L Polybren-haltige Wachstumsmedien zu jedem Brunnen hinzu.</li>
		<li>Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 L virusischen Überstand von schritt 3.4.2 aus Schritt 3.4.2 auf die 24 Brunnen aus Schritt 3.4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 - 48 h. HINWEIS: Einige Zelllinien benötigen möglicherweise länger als 24 h, um die shRNAs auszudrücken und puromycinresistent zu werden. Der hier verwendete virale Vektor liefert einen Turbo-GFP-IRES-puroR mit einer miR30-basierten shRNA in der 3'UTR von puroR (Abbildung 1). Die Infektionseffizienz und Expression des Puromycinresistenzgens und der shRNA wurden durch grünes fluoreszierendes Protein überwacht.</li>
	<li>Bereiten Sie komplette Wachstumsmedien vor, die 2,5 g/ml Puromycin enthalten. HINWEIS: Die Selektionskonzentration von Puromycin variiert zwischen den Zelllinien. Es wird empfohlen, dass eine Antibiotika-Kill-Kurve für jede Zelllinie durchgeführt werden, um vor dem Bildschirm untersucht werden.</li>
	<li>Saugen Sie die Medien aus jedem Brunnen und ersetzen Sie durch 500 l Puromycin-haltige komplette Wachstumsmedien. HINWEIS: Achten Sie darauf, auch Puromycin zu einem Kontroll-Nicht-infizierten Brunnen hinzuzufügen, der in den nachfolgenden Schritten verwendet werden kann, um sicherzustellen, dass die Puromycin-Auswahl abgeschlossen ist.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h. HINWEIS: Es ist am besten, für 48 h zu wählen, so Beschichtungsdichte und viralen Titer sollte optimiert werden, so dass die Zellen nicht überkonfluent vor 48 h sind.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die infizierten Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop grün sind und dass Zellen, die nicht infiziert sind, gut mit Puromycin behandelt sind, alle tot sind, bevor Sie mit Schritt 4 fortfahren.</li>
</ol>4. Seeding-Zellen für die Transfektion von Dual-Luciferase-Reporter
HINWEIS: Es sollte eine Testtransfektion durchgeführt werden, um die optimale Sädichte für jede neue Zelllinie zu bestimmen.
<ol><li>Versuchen Sie jeden Brunnen aus Schritt 3.9 und übertragen Sie etwa 1 x 105 Zellen in Brunnen an der entsprechenden Position auf der neuen 24-Well-Platte wie folgt. HINWEIS: Dieses Protokoll ist für das Screening von Bibliotheken mit Hunderten von shRNAs konzipiert, so dass es nicht möglich ist, jeden Brunnen infizierter Zellen zu zählen. Daher wurden die folgenden Schritte verwendet, um die Zellzahlen in jedem Brunnen zu schätzen, um eine annähernd gleiche Beschichtungsdichte zu gewährleisten.<ol>
<li>Gruppieren Sie die Brunnen von Schritt 3.9 in 3 - 4 Gruppen, so dass alle Brunnen in einer Gruppe eine ähnliche Zelldichte haben.</li>
		<li>Trypsinize 1 repräsentativ gut aus jeder Gruppe mit 200 l Trypsin-EDTA (1x PBS ergänzt mit 0,5 mM EDTA und 0,1% Trypsin) für 5 min bei 37 °C. Dann neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA durch Zugabe von 400 l Puromycin mit vollständigen Wachstumsmedien.</li>
		<li>Zählen Sie jeden Vertreter gut, um die Gesamtzellzahl zu bestimmen und verdünnen Sie die Zellsuspension von jedem Repräsentativen gut auf 2 x 105 Zellen/ml der Verwendung vollständiger Wachstumsmedien.</li>
		<li>Saat 0,5 ml (1 x 105 Zellen) von Schritt 4.1.3 in die entsprechende Position auf einer neuen 24-Well-Platte und bebrüte diese neue 24-Well-Platte bei 37 °C mit 5% CO2 für 24 h.</li>
		<li>Verwenden Sie für jede Gruppe aus Schritt 4.1.1 die in Schritt 4.1.3 ermittelte Gesamtzellenzahl, um das Volumen von Trypsin-EDTA zu berechnen, das jedem Bohrkörper hinzugefügt werden soll, sodass die resultierende Zellsuspension 1 x 106 Zellen/ml beträgt.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen das entsprechende Volumen trypsin-EDTA hinzu und brüten Sie 5 min bei 37 °C. HINWEIS: Für größere Bildschirme wird empfohlen, die 24-Well-Platten zu versuchen und in Gruppen anstatt alle auf einmal neu zu verladen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten.</li>
		<li>Verwenden Sie während der obigen Inkubation eine Mehrkanalpipette, um 400 L puromycinhaltige komplette Wachstumsmedien zu den entsprechenden Brunnen auf einer neuen 24-Well-Platte hinzuzufügen.</li>
		<li>Übertragen Sie 100 l Zellsuspension (ca. 1 x 105 Zellen) von jedem Brunnen auf die entsprechende Position auf den neuen 24-Well-Platten, die in Schritt 4.1.7 vorbereitet sind.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1.6 bis 4.1.8 für alle Platten gruppierter Brunnen ab Schritt 4.1.1, jeweils eine Platte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.</li>
</ol>5. Transfektion von Dual-Luciferase-Reporter
<ol><li>Transfezieren Sie jeden Brunnen aus Schritt 4.2 mit dem Dual-Luciferase-Reporter wie folgt. HINWEIS: Die Gesamtmenge der DNA und das optimale Verhältnis des Renilla Gallegife-Reportervektors zur Kontrolle des Renilla-Luziferase-Vektors sollten vor Beginn dieses Tests bestimmt werden. Hier, 400 ng einer DNA-Mischung, die 20 Teile Gelfe Luziferase Reporter und 1 Teil Kontrolle Renilla Luciferase enthält verwendet.<ol>
<li>Machen Sie das Verdünnungsgemisch (Tube A) und das Verdünnungsgemisch des Reporters (Tube B) durch Mischen der angegebenen Volumina jedes Reagenzes (Tabelle 1) multipliziert mit der Gesamtzahl der Transfektionen (plus mehrere Extras). HINWEIS: Dieses Protokoll ist für transfektionsreagenz 2 optimiert (siehe Materialtabelle). Wenn ein anderes Transfektionsreagenz verwendet wird, sollte die Transfektion vor diesem Schritt optimiert werden.</li>
		<li>Mischen Sie das Transfektionsverdünnungsgemisch (Tube A) mit Reporterverdünnungsgemisch (Tube B) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 15 min, um Transfektionsgemische herzustellen.</li>
		<li>Während der obigen Inkubation spülen Sie jeden 24-Well aus Schritt 4.2 mit 0,25 ml Phosphatpufferkochin (PBS) ab und fügen Sie jedem Bohrwert 447 L vollständige Wachstumsmedien hinzu.</li>
		<li>Verwenden Sie nach der 15 min Inkubation eine Mehrkanalpipette, um 53 L Transfektionsmischung auf jeden Brunnen der 24-Well-Platten zu verteilen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 für 24 h.</li>
</ol>6. Quantifizierung der Dual-Luziferase-Aktivität
<ol><li>Messen Sie die Aktivität der Luziferase mit einem Plattenleser und einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit, wie unten beschrieben. HINWEIS: Dieses Protokoll ist für das angegebene Reporter-Assay-Kit optimiert (siehe Tabelle der Materialien) und folgt dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll.<ol>
<li>Bereiten Sie genügend 1x passive Lysepuffer für alle Brunnen plus mehrere zusätzliche (75 l wird pro Brunnen benötigt) durch Verdünnung 5x passive Lyse Puffer (im Kit) 1 bis 5 mit entionisiertem Wasser. Auch Taureagenz A und Reagenz B Puffer (im Kit zur Verfügung gestellt, 100 L von jedem wird für jeden Brunnen benötigt).</li>
		<li>Aspirieren Sie die Medien aus jedem Brunnen der 24-Well-Platte aus Schritt 5.2.</li>
		<li>Fügen Sie jedem Brunnen 75 l 1x passive Lysepuffer hinzu und brüten bei Raumtemperatur 30 min mit gelegentlichem Schütteln.</li>
		<li>Reagenz B durch Verdünnung von 50x Reagenz B Substrat (im Kit) 1:50 mit aufgetautem Reagenz B Puffer zubereiten.</li>
		<li>Fügen Sie 30 L des 1x passiven Lysepuffers zu 4 Bohrungen zum Ausblenden hinzu (siehe Zusatztabelle 2).</li>
		<li>Übertragen Sie 30 l Lysat aus Schritt 6.1.3 in doppelte Bohrungen einer 96-well flachen weißen Assayplatte.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um jedem Brunnen 50 l Reagenz A hinzuzufügen und das Gahnlien-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 L Reagenz B aus Schritt 6.1.4 zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Renilla-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Renilla</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verarbeiten Sie die Rohdaten wie folgt (eine ausführliche Beschreibung finden Sie unter Ergänzende Tabelle 2).<ol>
<li>Schließen Sie Proben mit sehr niedrigen Renilla-Luziferase-Signal aus, da niedrige Werte darauf hindeuten, dass das virale Konstrukt toxisch war oder dass zu wenige transfizierte Zellen untersucht wurden. HINWEIS: Wie in der Diskussion erläutert, kann deutlich "niedriges" Renilla-Luziferase-Signal zu anomalen Ergebnissen führen. Renilla Hier bei denen das Renilla-Luziferase-Signal mehr als 1 Standardabweichung unter dem Mittelwert lag, wurden Brunnen ausgeschlossen (siehe Zusatztabelle 2). Renilla Dies basierte auf früheren Studien, die mit diesem Reportersystem in diesen Zellen14durchgeführt wurden, kann sich aber in anderen Zelllinien unterscheiden.</li>
		<li>Normalisieren Sie den rohen Gallegifewert Renilla jedes Brunnens auf den rohen Renilla-Luziferase-Wert des gleichen Brunnens, um das Galle/Renilla-Verhältnis zu erhalten.Renilla</li>
		<li>Durchschnittlich die Firefly /Renilla Verhältnisse aller replizieren Kontrollbrunnen und dann teilen Sie das Firefly /Renilla Verhältnis von jedem anderen Brunnen durch diese Zahl, um eine Falte ändern zu erhalten.</li>
		<li>Weisen Sie die Kontrollprobe zuRenilla und setzen Sie ihren Firefly/Renilla-Verhältniswert auf 1.</li>
		<li>Durchschnittlich die Gupf-/Renilla-Verhältnisse der doppelten Brunnen und Plot mit der Standardabweichung.Renilla HINWEIS: Die Standardabweichung wird nicht für statistische Analysen verwendet, sondern als Mittel zur Identifizierung von Brunnen, in denen sich die Replikationen erheblich unterscheiden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

In dieser Studie zeigen wir einen Ansatz für das Medium-Throughput-Screening von arrayed viralen Bibliotheken in Kombination mit einem auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptionsreporter-Assay, der verwendet werden kann, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren und zu testen. Es ist wichtig, das Reportersystem für jede Zelllinie vor jedem Bildschirm zu charakterisieren und zu optimieren. Es sollten Experimente durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass der Reporter auf die veränderte Akti...

Der Zweck dieses Assays ist es, virale Bibliotheken zu verwenden, um Regulatoren von Transkriptionsfaktoren relativ schnell und kostengünstig zu identifizieren. Aberrante Transkriptionsaktivität ist mit Krebs und Metastasen1,2,3,4,5,6, so Targeting Transkriptionsfaktoren in Krebszellen ist ein vielversprechender therapeutischer Ansatz verbunden. Jedoch, Transkriptionsfaktoren sind oft schwierig, pharmakologisch7 und viele sind für die normale zelluläre Funktion in erwachsenen Geweben8,9,10erforderlich. Die Krebswege, die Abschreibfaktoren zur Krankheitsantrieb aktivieren, ist ein praktikablerer Ansatz mit dem Potenzial, weniger schwere Nebenwirkungen zu haben. Die kommerzielle Verfügbarkeit von arrayierten lentiviralen und retroviralen RNAi-, CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken ermöglicht es Forschern, die Bedeutung zahlreicher Gene in einem einzigen Experiment zu testen. Es ist jedoch eine zuverlässige Auslesung für geänderte Transkriptionsaktivitäten erforderlich.
Hier beschreiben wir die Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays und arrayed lentiviralen Bibliotheken, um Proteine zu identifizieren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen regulieren. In diesem Test werden shRNAs, die auf krebsassoziierte Gene abzielen, über lentivirale Transduktion an Säugetierkrebszellen abgegeben und Zellen für eine stabile Integration mit Puromycin ausgewählt. Die Zellen werden als nächstes mit einem Reporterkonstrukt transfiziert, das gnädige Luziferase ausdrückt, die von einem Promotor angetrieben wird, der spezifisch für den Transkriptionsfaktor ist, der untersucht wird, und einem Kontrollkonstrukt, das Renilla luziferase von einem konstitutiven aktiven Promotor ausdrückt, der nicht auf den untersuchten Transkriptionsfaktor reagiert. Wir demonstrieren diesen Ansatz mit einem Proof-of-Concept-Bildschirm für Diebesregler von YAP und TAZ, den kritischen Nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs8,10,11. Abnormale Aktivität von YAP und TAZ fördert mehrere Schritte der metastasierenden Kaskade11 und wird bei vielen Krebsarten beobachtet11,12,13. Wie YAP und TAZ in einigen Krebszellen abwegig aktiviert werden, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. YAP und TAZ binden keine DNA, sondern werden durch andere Transkriptionsfaktoren an Promoter rekrutiert. Mitglieder der TEA-Domain-Familie (TEAD) der Transkriptionsfaktoren sind die wichtigsten Bindungspartner für YAP und TAZ und für die meisten YAP- und TAZ-abhängigen Funktionen von entscheidender Bedeutung. Unser Reporterkonstrukt drückt Gofagifuifase aus einem YAP/TAZ-TEAD-responsiven Promotor aus und frühere Studien haben gezeigt, dass es Veränderungen in YAP-TEAD und TAZ-TEAD Transkriptionsaktivitätgetreuerkennt 2,14,15.
Unser Ansatz ist schnell, mittlerer Durchsatz und erfordert keine Screening-Einrichtungen, automatisierte Roboter oder eine tiefe Sequenzierung von gepoolten Bibliotheken. Die Kosten sind relativ gering und es gibt zahlreiche kommerziell verfügbare Bibliotheken zur Auswahl. Die erforderlichen Geräte und Reagenzien sind auch in den meisten Laboratorien relativ Standard. Es kann verwendet werden, um für Regulatoren von praktisch jedem Transkriptionsfaktor zu überprüfen, wenn ein luziferase-basierter Reporter existiert oder generiert wird. Wir verwenden diesen Ansatz, um shRNAs in Krebszellen zu überprüfen, aber jede Zelllinie, die mit angemessener Effizienz transfiziert werden kann, könnte mit jeder Art von arrayed Bibliothek verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>2,0 ml 96-Well-Deep-Well-Polypropylen-Platte</td><td>USA Scientific</td><td>1896-2000</td><td>Für bakterielle Mini-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Trypsin - 2,50 %</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>Komponente der Trypsin-EDTA</td></tr><tr><td>96-Well-Assay-Platte mit flachem Boden weiß</td><td>Corning</td><td>3922</td><td>Für Dual-Luciferase-Assay</td></tr><tr><td>Ampicillin - 100 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-10835242001-EA</td><td>Für bakterielle Mini-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Bacto-Trypton - Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95039</td><td>Bestandteil der LB-Bouillon</td></tr><tr><td>Dual-Luciferase Reporter Assay System, das LAR II Reagenz (Reagenz A), Stop & Glo-Substrat (Reagenz B-Substrat) und Stop & Glo-Puffer (Reagenz-B-Puffer) - Kit</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Für Dual-Luciferase-Assay</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium, Magnesium und Phenolrot - 9,6 g/L</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>Für PBS</td></tr><tr><td>EDTA - 0,5 M</td><td>VWR</td><td>97061-406</td><td>Bestandteil von Trypsin-EDTA-Ethanol</td></tr><tr><td>- 100%</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td>Für bakterielle Mini-Prep Feetal</td></tr><tr><td> Rinderserum - 100%</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Bestandteil des vollständigen Wachstumsmediums</td></tr><tr><td>Hexadimethrinbromid (Polybrene) - 8 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>Bei Virusinfektion</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/Hohe Glukose - 4 mM L-Glutamin; 4500 mg/L Glukose; Natriumpyruvat</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Bestandteil des vollständigen Wachstumsmediums</td></tr><tr><td>I3-P/i3 Multi-Mode Mikroplatte/EA</td><td>Molekulare Bauelemente</td><td></td><td>Für Dual-Luciferase-Assay</td></tr><tr><td>L-Glutamin - 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Bestandteil des kompletten Wachstumsmediums</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 (Transfection Reagenz 2) - 100%</td><td>Life Technologies</td><td>L3000008</td><td>Für Transfektionen</td></tr><tr><td>Molekularbiologie Wasser - 100%</td><td>VWR</td><td>02-0201-0500</td><td>Zur Verdünnung von shRNA-Vektoren für die Virusverpackung</td></tr><tr><td>NaCl - Pulver</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td>Bestandteil der LB-Bouillon</td></tr><tr><td>NanoDrop One Mikrovolumen UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermowissenschaftlich</td><td></td><td>Zur Messung der Vektor-DNA-Konzentration</td></tr><tr><td>Opti-MEM (Transfektionspuffer) - 100%</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Für Transfektionen</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin - 10.000 Einheit/ml (Penicillin); 10.000 & Mikro; g/ml (Streptomycin)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Bestandteil eines kompletten Wachstumsmediums</td></tr><tr><td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K210010</td><td>Für bakterielle Mini-Vorbereitung</td></tr><tr><td>Puromycin - 2,5 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>Für die Auswahl von Antibiotika nach einer Infektion</td></tr><tr><td>TC20 automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Für die Zellzählung</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA-Transfektionsreagenz (Transfektionsreagenz 1) - 100%</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Für die Verpackung</td></tr><tr><td>von Viren Hefeextrakt - Pulver</td><td>VWR</td><td>J850</td><td>Bestandteil der LB-Bouillon</td></tr><tr><td>P3000 (Transfektionsreagenz 3) - 100%</td><td>Life technologies</td><td>L3000008</td><td>Für Transfektionen</td></tr></tbody></table>

identifizierung von transkriptionsfaktor-regulierern mit medium-throughput-screening von arrayed libraries und einem dual-luciferase-basierten reporter

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transkriptionsfaktoren können die Expression zahlreicher Zielgene verändern, die eine Vielzahl von nachgelagerten Prozessen beeinflussen und sie zu guten Zielen für Krebstherapien machen. Jedoch, direkt auf Transkriptionsfaktoren ist oft schwierig und kann Nebenwirkungen verursachen, wenn der Transkriptionsfaktor in einem oder mehreren erwachsenen Geweben notwendig ist. Die Identifizierung vorgelagerter Regulatoren, die Transkriptionsfaktoren in Krebszellen abnorm aktivieren, bietet eine praktikablere Alternative, insbesondere wenn diese Proteine leicht zu medikamentieren sind. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um arrayed mittelgroße lentivirale Bibliotheken und eine dual-luciferase-basierte Transkriptionsreporter-Assay zu kombinieren, um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Unser Ansatz bietet eine schnelle, einfache und kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Genen in einem einzigen Experiment zu testen. Um die Verwendung dieses Ansatzes zu demonstrieren, führten wir einen Bildschirm einer arrayed lentiviralEN RNAi-Bibliothek durch, die mehrere Regulatoren von Yes-associated protein (YAP) und transkriptionskoaktivator mit PDZ-Bindungsmotiv (TAZ) enthält, zwei transkriptionelle Co-Aktivatoren, die die nachgeschalteten Effektoren des Hippo-Signalwegs sind. Dieser Ansatz könnte jedoch geändert werden, um regler für praktisch jeden Transkriptionsfaktor oder Co-Faktor zu überprüfen und könnte auch zum Screenen von CRISPR/CAS9-, cDNA- oder ORF-Bibliotheken verwendet werden.

Unser YAP/TAZ-TEAD Reporterkonstrukt (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) enthält einen minimalen SV-49 Promoter mit 5 Wiederholungen des kanonischen TEAD-Bindungselements (MCAT)15, das das Gahngluciferase-Gen antreibt ( Abbildung1). Es wird zusammen mit dem PRL-TK-Kontrollvektor (Promega), der Renilla luziferase aus dem konstitutiv aktiven H...

Um neue Regulatoren von Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, entwickelten wir einen Ansatz für die Bildschirmanordnung von lentiviralen oder retroviralen RNAi-Bibliotheken unter Verwendung eines auf Dual-Luciferase basierenden Transkriptions-Reporter-Assays. Dieser Ansatz bietet eine schnelle und relativ kostengünstige Möglichkeit, Hunderte von Kandidaten in einem einzigen Experiment zu überprüfen.

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um arrayed lentivirale oder retrovirale Assay-Bibliotheken zu überprüfen, um neuartige Regulatoren von Transkriptionsfaktoren in Krebszellen zu identifizieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie schnell, mittlerer Durchsatz und kostengünstig ist und geräte und Reagenzien verwendet, die für die meisten Forscher allgemein zugänglich sind. Um jeden lentiviralen Vektor in der Bibliothek zu erweitern und zu reinigen, fügen Sie zunächst 1,3 Milliliter Luria-Brühe hinzu, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin in jeden Brunnen einer 96-Well-Tiefenbrunnenplatte.Impfen Sie jeden Brunnen mit zwei Mikroliter Glyzerin-Lager für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 225 Umdrehungen pro Minute. Übertragen Sie am nächsten Tag jede Bakterienkultur in einzelne 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren zur Zentrifugation. Reinigen Sie jeden Vektor mit einem geeigneten bakteriellen Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.Für jeden Vektor in der vorbereiteten Bibliothek einen Brunnen einer 24-Well-Platte mit einem mal 10 bis fünften 293FT-Zellen säen und die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden inkubieren. Um ein Transfektionsgemisch vorzubereiten, das für jeden Vektor in der Bibliothek eingerichtet wird, wird zunächst jeder lentivirale Vektor zu einer Endkonzentration von 50 Nanogramm pro Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser deute. Übertragen Sie fünf Mikroliter jeder Verdünnung in einzelne Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte.Machen Sie eine Transfektion Super-Mix durch Mischen 1,25 Mikroliter mal x Transfektion Reagenz eins mit 23,75 Mikroliter mal x vorgewärmten Transfektionpuffer. Inkubieren Sie die Transfektion Super-Mix bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann fügen Sie 125 Nanogramm mal x psPAX2 und 125 Nanogramm mal x VSVG in den Supermix mit sanfter Pipettierung.Sofort aliquot die Super-Mix in jede Röhre eines PCR-Streifen und verwenden Sie eine Mehrkanal-Pipette, um 25 Mikroliter der Mischung in jeden Brunnen des verdünnten viralen Vektor zu übertragen. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit einer Mehrkanalpipette 30 Mikroliter jedes Transfektionsgemisches aus jedem Brunnen in einen entsprechenden Brunnen von 293FT-Zellen in der zuvor vorbereiteten 24-Well-Platte übertragen. Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden, bevor Sie das Medium in jedem Brunnen durch 500 Mikroliter frisches komplettes Wachstumsmedium für eine weitere 24-Stunden-Inkubation im Zellkultur-Inkubator ersetzen.Verwenden Sie am nächsten Tag eine Mehrkanalpipette, um den viralen Überstand aus jedem Brunnen zu sammeln und 220 Mikroliter jedes Überstands in zwei Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte zu sammeln, um eine angeordnete virale Überstandplatte zu erzeugen. Um A375-Zellen auf eine Infektion vorzubereiten, samen Sie einmal 10 bis fünf Zellen in einer 24-Well-Platte in 0,5 Milliliter vollständigem Wachstumsmedium pro Brunnen für jeden viralen Vektor in der Bibliothek. Fügen Sie einen zusätzlichen Brunnen, der nicht infiziert werden, um als Kontrolle für die Medikamentenauswahl dienen.Nach einer 24-stündigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator tauen Sie den gefrorenen, auf Raumtemperatur eingestellten lentierten Lentiviral-Überflieger auf, bevor das Wachstumsmedium aus jedem Brunnen der vorbereiteten Zellkulturplatte durch 200 Mikroliter Wachstumsmedium ersetzt wird, ergänzt um 20 Mikrogramm pro Milliliter Polybren. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 Mikroliter viralen Überstand von jedem 96-Brunnen auf jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Geben Sie die Zellen für 24 bis 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.Am Ende der Inkubation, ersetzen Sie das Medium in jedem Brunnen mit 500 Mikroliter Wachstumsmedium mit Puromycin ergänzt und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator für weitere 48 Stunden zurück. Nach der 48-stündigen Puromycin-Auswahl sortieren Sie die Zellen in drei oder vier Gruppen, so dass alle Brunnen in einer einzigen Gruppe eine ähnliche Zelldichte haben, und fügen Sie 200 Mikroliter Trypsin-EDTA zu einem repräsentativen Gut aus jeder Gruppe für eine fünfminütige Inkubation bei 37 Grad Celsius hinzu. Sobald sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 400 Mikroliter Wachstumsmedium mit Puromycin ergänzt und zählen die Anzahl der Zellen aus jedem Trypsinized gut.Verdünnen Sie jede Zellsuspension auf eine zwei mal 10 bis die fünfte Zelle pro Milliliter Konzentration mit Wachstumsmedium mit Puromycin und Samen 500 Mikroliter Zellen aus jedem Brunnen in die gleiche Brunnenposition in einer neuen 24-Well-Platte ergänzt. Nach der Verwendung der Zählungen aus jedem repräsentativen Brunnen, um die Zellzahl in jedem verbleibenden Brunnen in jeder Gruppe zu schätzen, fügen Sie das entsprechende Volumen von Trypsin-EDTA zu jedem Brunnen hinzu, um eine ein mal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration zu erreichen. Verwenden Sie während der Trypsinisierung eine Mehrkanalpipette, um 400 Mikroliter Wachstumsmedium, ergänzt mit Puromycin, in die entsprechenden brunnen in der neuen 24-Well-Platte hinzuzufügen.Sobald sich die Zellen gelöst haben, mischen Sie vorsichtig den Inhalt jedes Brunnens und übertragen Sie 100 Mikroliter jeder Zellsuspension in den entsprechenden Korbrunnen in der neuen 24-Well-Platte. Dann kehren Sie die Zellen für 24 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück. Um die Zellen mit den Dual-Luciferase-Reporterkonstrukten zu transfekieren, bereiten Sie die in der Tabelle angegebene Transfektionsverdünnungsmischung vor.Um die Verdünnungsmischung des Reporters vorzubereiten, mischen Sie die Volumina jedes Reagenzes multipliziert mit der Gesamtzahl der Transfektionen plus mehreren zusätzlichen Volumina. Als nächstes mischen Sie die Transfektionsverdünnungsmischung mit dem Reporter-Verdünnungsgemisch und inkubieren Sie die resultierende Lösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten, um die Transfektionsmischung zu produzieren. Während der Inkubation spülen Sie jeden Brunnen der Zellkulturplatte mit 250 Mikroliter PBS ab und fügen Sie jedem Brunnen 447 Mikroliter frisches komplettes Wachstumsmedium hinzu.Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 53 Mikroliter Transfektionsmischung auf jeden Brunnen der Zellkulturplatte zu verteilen. Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Um die Luziferaseaktivität zu messen, verdünnen Sie den 5X passiven Lysepuffer aus dem Luziferase-Aktivitätskit bei einer Ein-zu-Fünf-Verdünnung mit entionisiertem Wasser und tauen Sie die notwendigen Volumina von Reagenz A und Reagenz B-Puffer aus dem Kit auf.Wenn die Reagenzien fertig sind, ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen durch 75 Mikroliter passiver Lysepuffer und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln. Während der Inkubation das 50-fache Reagenz-B-Substrat aus dem Kit auf eine Ein-50-Konzentration mit aufgetautem Reagenz-B-Puffer verdünnen. Am Ende der Inkubation 30 Mikroliter passiver Lysepuffer zu vier leeren Kontrollbrunnen hinzufügen und 30 Mikroliter Lysat aus jedem Brunnen in doppelte Brunnen einer 96-well flachen weißen Arschplatte übertragen.Wenn das gesamte Lysat plattiert ist, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Reagenz A zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Firefly-Luzifferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um 50 Mikroliter Reagenz B zu jedem Brunnen hinzuzufügen und das Renilla-Luziferase-Signal mit einem Plattenleser zu lesen. Wie erwartet, YAP2SA erhöht Galleifeaktivität Aktivität, aber nicht Renilla Luziferase Aktivität im Vergleich zum Kontrollvektor.Im Gegensatz dazu erhöht YAP2SA S94A die Aktivität der Galleifeferase nicht. Wichtig ist, dass YAP2SA die Aktivität eines minimalen Promotorkonstrukts, dem die MCAT TEAD-Bindungselemente fehlen, nicht ändert. In Zellen, die mit dem YAP-TAZ-TEAD-Reporterkonstrukt transfiziert wurden, reduzierten die Tandem-Kurzhaarnadeln YAP und TAZ die Guplifly-Luziferase-Spiegel signifikant, die Kontrolle der kurzhaarigen Nicht-Targeting-Kontrolle jedoch nicht.Im Gegensatz dazu verändert die YAP-TAZ Kurzhaarnadel-RNA in Zellen, die mit dem minimalen Reporterkonstrukt transfiziert sind, den Galleifuifasespiegel nicht signifikant. Das Renilla-Signal in jedem Brunnen wird auch nicht signifikant durch die kurze Haarnadel-Nicht-Targeting-Kontrolle oder die YAP-TAZ-Kurzhaarnadel-RNA verändert. Wie erwartet reduzieren kurze Haarnadel-RNAs, die auf YAP und TAZ, SARC oder PI3-Kinase abzielen, die YAP-TAZ-TEAD-Aktivität erheblich.Kurze Haarnadel RNAs für ATM, CDH1, CSK, ERBB2, und Gelsolin jeweils erhöhte normalisierte Glühwürmchen Luziferase Spiegel im Einklang mit veröffentlichten Studien, die zeigen, dass diese Proteine YAP und /oder TAZ waren. Trotz etablierter Rollen für ATR, CCNE2 und ERBB4 in anderen Zelltypen, kurze Haarnadel-RNAs, die auf diese Gene abzielen, verändern nicht signifikant normalisierte Gob-Luziferase-Spiegel in A375-Zellen. Im Anschluss an diesen Bildschirm sollten die Identifizierungsregulatoren anhand anderer Auslesungen für ihre Transkriptionsfaktoraktivität validiert werden.Der effektive Abbau des identifizierten Reglers durch den Test sollte ebenfalls bestätigt werden. Denken Sie daran, Vorsicht walten zu lassen und Sicherheitsrichtlinien zu befolgen, wenn Sie mit infektiösen Lentiviren arbeiten, insbesondere wenn die Viren infektiös sind.

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Research

Forschung

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Krebsforschung

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Hier beschreiben wir eine Methode, um eine gezielte siRNA "ubiquitome"-Bildschirm, um neue Ubiquitin und Ubiquitin-ähnliche Regulatoren des HIF1A-vermittelte zelluläre Antwort auf Hypoxie zu identifizieren durchzuführen. Dies kann zu jedem biologischen Weg, wo ein robuster Auslesen der Reporteraktivität ist angepasst werden.

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Beschreiben ein Transkriptionsfaktor abhängige Regulation der MicroRNA Transkriptom

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Verbesserte Hefe One-Hybrid Screens, Transkriptionsfaktor Bindung an menschliche DNA-Sequenzen zu identifizieren

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Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter (Video) | JoVE Journal

Identifizierung von Transkriptionsfaktor-Regulierern mit Medium-Throughput-Screening von Arrayed Libraries und einem Dual-Luciferase-basierten Reporter

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