Ein universelles Protokoll für groß angelegte gRNA Bibliothek Produktion aus jeder DNA-Quelle

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, umfassende Guide-RNA-Bibliotheken aus gereinigter DNA aus beliebigen Quellen zu erstellen. gRNA-Bibliotheken sind Plasmidsammlungen, die in CRISPR-basierten Screenings verwendet werden. Die CORALINA-Methode nutzt den enzymatischen Verdau von gereinigter DNA, um die resultierenden Fragmente in ein Rückgrat der Guide-RNA-Bibliothek zu klonen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie alle möglichen Guide-RNAs aus der Eingangssequenz herstellt und sehr kostengünstig ist. Obwohl dieses Video den Schutz einer CORALINA-Bibliothek vor einem bakteriellen künstlichen Chromosom demonstriert, kann diese Methode im Prinzip auf jede Art von Eingangs-DNA aus jedem Organismus angewendet werden. Für jede neue Charge von Mikrokokken-Nuklease muss eine Optimierung des Mikrokokken-Nuklease-Verdaus durchgeführt werden.

Richten Sie für jede Reaktion Folgendes ein. Ein Mikroliter 10x Mikrokokken-Nuklease-Puffer, 1x Rinderserumalbumin, ein Mikrogramm Ziel-DNA, ein Mikroliter Mikrokokken-Nuklease und Wasser auf 10 Mikroliter. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Inaktivieren Sie das Enzym sofort, indem Sie einen Mikroliter 500 millimolare EGTA hinzufügen. Geben Sie Probenpuffer mit Gelladefarbstoff zu den DNA-Proben und laden Sie ein Mikrogramm DNA pro Vertiefung in ein 20%iges Polyacrylamidgel. Laden Sie eine geeignete DNA-Leiter für die Größenbestimmung.

Lassen Sie das Gel in 1x TBE-Laufpuffer bei 150 Volt für ca. 1,5 Stunden laufen oder bis die untere Farbstofffront das untere Ende des Gels erreicht. Färben Sie das Gel mit einem hochempfindlichen Nukleinsäure-Färbemittel und visualisieren Sie es unter UV-Licht. In diesem Beispiel betrug die optimale Konzentration der Mikrokokken-Nuklease für den Verdau der DNA bis zu einer Größe von 20 bis 30 Basenpaaren 10 Einheiten.

Verwenden Sie diese optimale Konzentration an Mikrokokken-Nuklease, um 10 bis 12 Mikrogramm Ziel-DNA auf die gleiche Weise zu verdauen, wie es für die Optimierungsreaktionen gezeigt wurde. Nach der Trennung der DNA-Fragmente mittels PAGE wird das Gel mit einem sterilen Skalpell neben der Markierungsspur geschnitten und nur der Teil des Gels, der die Leiter enthält, mit frischem 1x FSME-Laufpuffer gefärbt, der eine ultraempfindliche Nukleinsäurefärbung enthält. Visualisieren Sie die DNA-Leiter und verwenden Sie eine Rasierklinge, um mit Mikrokokken-Nuklease verdaute DNA-Fragmente im Größenbereich von etwa 18 bis 30 Basenpaaren zu entfernen.

Übertragen Sie die Gelscheibe in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Färben Sie den Rest des Gels mit Nukleinsäurefärbung, wie zuvor gezeigt. Setzen Sie das Gel UV-Licht aus und nehmen Sie ein Bild als Aufzeichnung des Gel-Exzisionsschritts auf.

Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die herausgeschnittene Gelscheibe mit einer sterilen Pipettenspitze gegen die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens drücken. Geben Sie zwei Gelvolumina PAGE-Solubilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf einer rotierenden Plattform. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Probe in einer Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für eine Minute.

Übertragen Sie die Überstände in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, dass keine zerkleinerten Gelstücke übertragen werden. Geben Sie 0,5 Volumen PAGE-Solubilisierungspuffer in das Gelpellet, wirbeln Sie es vor und wiederholen Sie die Zentrifugation. Kombinieren Sie die Überstände und extrahieren Sie die DNA-Fragmente unter Verwendung einer Standard-Phenol-Chloroform-Extraktionsmethode, wie im Textprotokoll beschrieben.

Parallel zur Isolierung von DNA-Fragmenten werden Linker aus dem Expressionsvektor der Leit-RNA mittels Standard-PCR amplifiziert. Um eine gerichtete Klonierung zu gewährleisten, werden die Linker dann mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen Sie den Restriktionsenzymverdau der Linker auf einem einprozentigen Agarosegel durch.

Schneiden Sie die richtigen Banden heraus und reinigen Sie die DNA aus den herausgeschnittenen Gelstücken mit einem Gelextraktionskit. Für die Endreparaturreaktion wird ein DNA-Abstumpfkit verwendet. Geben Sie Folgendes in ein Mikrofugenröhrchen.

10 Mikroliter gereinigte DNA, 1,5 Mikroliter 10x Abstumpfpuffer, 1,5 Mikroliter einer millimolaren dNTP-Mischung, 1,4 Mikroliter Wasser und 0,6 Mikroliter Abstumpfenzym. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 22 Grad Celsius und erhitzen und aktivieren Sie dann das Enzym durch Inkubation bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten. Fügen Sie 85 Mikroliter Wasser hinzu und führen Sie eine Reaktionsreinigung durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Richten Sie eine 14-Mikroliter-Ligationsreaktion mit gleichen molaren Mengen an Mikrokokken-Nuklease, verdauten und reparierten Fragmenten und Linkersequenzen ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Nick-Translation wird das Ligationsprodukt mittels PCR amplifiziert. Um Mikrokokken-Nuklease-Fragmente mit den korrekt angehängten fünf Prime- und drei Prime-Linkern von Fragmenten mit zwei Fünf-Prime- oder zwei Drei-Prime-Linkern zu trennen, kombinieren Sie alle 15-Zyklus-PCR-Reaktionen, fügen Sie einen DNA-Ladefarbstoff hinzu und führen Sie sie auf einem 0,8%-Agarose-Gel durch.

Exzitieren Sie die markante Bande bei 869 Basenpaaren und reinigen Sie die DNA mit einem Gel-Extraktionskit. Quantifizieren Sie die Menge an DNA mit einem Spektralphotometer. Klonieren Sie anschließend die PCR-amplifizierten Fragmente durch Gibson-Assemblierung in den Guide-RNA-Expressionsvektor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um dieses Verfahren zu starten, wird der aliquot gereinigte Vektoreinsatz in sterile und vorgekühlte PCR-Röhrchen gegossen und auf Eis aufbewahrt. Kühle Elektroporationsküvetten mit einem Abstand von einem Millimeter auf Eis. Geben Sie 25 Mikroliter frisch präparierte TG1-Zellen direkt zu einem DNA-Aliquot und überführen Sie das Gemisch sofort in eine Elektroporationsküvette.

Schnippen oder klopfen Sie auf die Küvette, um sicherzustellen, dass die Zell- und DNA-Mischung über die gesamte Länge der Küvettenkammer verteilt ist, ohne dass Luft oder Blasen eingeschlossen sind. Legen Sie die Küvette in die Objektträgerkammer und starten Sie das entsprechende Elektroporationsprogramm. Geben Sie sofort 475 Mikroliter Raumtemperatur 2TY in die Küvette.

Übertragen Sie die elektroporierten Bakterien in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie die einzelnen Elektroporationen, sammeln Sie alle mit einer Bibliothek transformierten Zellen in einem 50-Milliliter-Röhrchen und dokumentieren Sie das Gesamtvolumen. Um die Gesamtzahl der Kolonien für die gesamte Bibliothek zu schätzen, wird eine definierte kleine Menge von Bakterien, die mit der Bibliothek transformiert werden, auf eine 10 Zentimeter große Agarplatte mit der entsprechenden Antibiotikaauswahl plattiert.

Um das Volumen des restlichen Bakteriums zu reduzieren, zentrifugieren Sie bei etwa 4.000 g für 10 Minuten oder bis sich eine sichtbare Palette gebildet hat und der Überstand klar erscheint. Entfernen Sie alle bis auf wenige Milliliter des Überstands und resuspendieren Sie die Zellen. Verteilen Sie die Bakterien auf 2TY-Agar-beschichtete Bioassay-Schalen, die die entsprechende Antibiotikaauswahl enthalten.

Verteilen Sie ein angemessenes Volumen der pUC19-Kontroll-Elektroporationsreaktion auf eine zusätzliche 10 Zentimeter große Agarschale mit geeigneter Antibiotikaauswahl. Inkubieren Sie die Agarplatten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Anzahl der Kolonien auf den kontrollierten Platten, um die koloniebildende Einheit pro Mikrogramm DNA für die Bakterien sowie die Komplexität der Bibliothek zu schätzen.

Kratzen Sie zum Schluss die Bakterien von der Platte für die Plasmid-DNA-Extraktion. Nach der Gelaufreinigung wurden 1/6 der gereinigten Mikrokokken-Nukleasefragmente auf ein 20%PAGE-Gel geladen, um die erfolgreiche Größenauswahl und Aufreinigung zu bestätigen. Linker-Amplikons wurden mit Restriktionsenzymen verdaut, um sicherzustellen, dass Linker in der richtigen Ausrichtung an die Mikrokokken-Nuklease-verdauten Fragmente ligiert werden.

Die linke Seite dieses repräsentativen Gelbildes zeigt fünf Prime- und drei Prime-Linker vor bzw. nach der Verdauung mit HindIII und SacII, was auf einen vollständigen Verdau der Linker zu den prädiktiven 637 Basenpaaren und 295 Basenpaaren hinweist. Die rechte Seite des Gelbildes dokumentiert die Exzision der verdauten Linkerfragmente. Die erfolgreiche Ligation von Linkern zu DNA-Fragmenten wurde mittels PCR mit einer erhöhten Anzahl von PCR-Zyklen analysiert.

Zu den eingeschlossenen Kontrollen gehörten eine No-Template-Kontrolle, die die No-Template-Kontrolle aus dem vorherigen Nick-Translationsschritt als Eingabe verwendete, und eine No-Micrococcal-Nuklease-Fragment-Kontrolle. Nur Proben, in denen Mikrokokken-Nukleasefragmente mit Linker-DNA kombiniert wurden, ergaben das erwartete Amplikon von 869 Basenpaaren. Einmal gemeistert, kann diese Technik in fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Komplexität der Bibliothek beizubehalten und andere Kontrollreaktionen durchzuführen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine Leit-RNA-Bibliothek für CRISPR-basierte Bildschirme generieren können, indem Sie DNA in kleine Stücke zerlegen und diese in das Vektorrückgrat der Bibliothek klonen.