Name: Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie inkrementelle Temperaturprotokolle zur Maximierung der Laichzeit bei Astyanax mexicanus. Diese Methode unterstützt vergleichende Entwicklungsbiologie und evolutionäre Genetik.

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Wir danken David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote und Mandy Ng für wertvolle Beiträge zur Kultureinrichtung des Jeffery-Labors A. mexicanus. Die Forschung im Jeffery-Labor wird derzeit durch den NIH-Zuschuss EY024941 unterstützt.

Dieses Verfahren wurde von den Institutional Animal Care Guidelines der University of Maryland, College Park (derzeit IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projekt 1241065-1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61708/61708fig1.jpg"> Abbildung 1. Kalender während einer Brutwoche und einer Nichtbrutwoche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61708/61708fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
1. Montag
<ol><li>Führen Sie um 9-10 Uhr Wassertests und die Schritte 1.1.1-4 unten durch.<ol>
<li>Zeichnen Sie die Raum-, Tank- und Behältertemperaturen mit einem Thermometer auf.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Ammoniak-, Nitrat- und Nitratwerte mit einem kolorimetrischen Testkit auf.</li>
		<li>Erfassen Sie den pH-Wert aus dem Überwachungssystem sowie dem kolorimetrischen Testkit.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Leitfähigkeit vom Carboy-Monitor und dem Hauptsystemmonitor auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ab 10 Uhr alle Fische füttern.<ol>
<li>Füttern Sie alle Fische im Erwachsenensystem mit Tetraflocken und zerkleinern Sie die Flocken in den Tanks mit jungen Fischen. Füttern Sie nur so viele Flocken, wie ein Fischbecken in 3-5 Minuten vollständig verbrauchen kann, etwa eine "Fingerklemme".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überprüfen Sie den Inkubator, in dem Fingerschüsseln von sich entwickelnden Embryonen untergebracht sind, und wechseln Sie bei Bedarf das Wasser.<ol>
<li>Öffnen Sie den Embryo-Inkubator und überprüfen Sie den Wasserstand in allen Reservoirs. Wenn ihnen das Wasser ausgeht, fügen Sie Systemwasser hinzu. Überprüfen Sie die Einstellungen für die Inkubatortemperatur. Heben Sie die Embryonen bei 73-77 ° F (23-25 ° C) an.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sauberes Lebendfutter.<ol>
<li>Um die Schwarzwürmer zu reinigen, entfernen Sie die unbedeckten Tupperware-Becken mit ihren Kulturen aus dem Lebendfutterkühlschrank und gießen Sie das überschüssige Wasser über den Wurmhaufen in die Spüle. Suspendieren und spülen Sie die Würmer mit destilliertem Wasser wiederholt aus, bis das abgießende Wasser klar ist.</li>
		<li>Fügen Sie genügend sauberes Wasser hinzu, so dass die Wurmhaufen etwa zur Hälfte bedeckt sind. Ersetzen Sie die verbleibenden Würmer im Lebendfutterkühlschrank, unbedeckt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fische füttern.<ol>
<li>Füttern Sie mindestens 30 Minuten nach der ersten Fütterung Fische in den Becken, in denen die Zucht gewünscht wird, mit Eigelbflocken, Schwarzwürmern oder beidem. Fügen Sie einen "Fingerstift" von Eigelbflocken pro Tank hinzu. Fügen Sie genügend Schwarzwurmcluster hinzu, damit jeder Fisch im Aquarium etwa 5-10 Würmer verbrauchen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stellen Sie bei 10 am- 1 pm die Wassertemperatur auf 74 ° F ein.</li>
	<li>Schrubben Sie die Zuchtbecken nach Bedarf und stellen Sie die Zuchtnetze ein.</li>
	<li>Reinigen Sie die Tanks und legen Sie die Netze mindestens eine Stunde nach der letzten Fütterung auf. Reinigen Sie alle Tanks, in die die Netze gelegt werden, vorher. Stellen Sie die Zuchtnetze vorsichtig ein, um die Luftzufuhr zum Tank nicht zu stören.</li>
</ol>2. Dienstag
<ol><li>Sammeln Sie die Embryonen und waschen Sie alle Zuchtnetze.<ol>
<li>Entfernen Sie um 9-10 Uhr die Zuchtnetze vom Boden der Tanks des erwachsenen Systems. Spülen Sie die Embryonen vorsichtig mit dem am Carboy befestigten Schlauch in ein Handnetz und kehren Sie das Handnetz in eine Fingerschale mit sauberem Systemwasser um, um die Embryonen auszustoßen.</li>
		<li>Sammeln und waschen Sie jeden Satz Embryonen und legen Sie sie dann in eine Fingerschüssel mit sauberem Systemwasser mit 0,00003% Methylenblau (blaues Wasser). Wenn es eine außergewöhnlich große Anzahl von Embryonen aus einem einzigen Tank gibt, trennen Sie sie in mehrere Schüsseln. Die Konzentration lebender Embryonen sollte etwa 100 pro 200 ml blaues Wasser in jeder Fingerschüssel betragen.</li>
		<li>Schätzen Sie den Zeitpunkt der Befruchtung, indem Sie die Embryonen unter einem Mikroskop unter Verwendung des veröffentlichten A. mexicanus-Entwicklungszeittabellen17inszenieren. </li>
		<li>Überwachen Sie häufig die Fingerbowls, die Embryonen enthalten. Entfernen Sie tote oder deformierte Embryonen und Trümmer, wie nicht gesöhnte Lebensmittel oder Kot, mit einer Pasteur-Pipette. Wechseln Sie das blaue Wasser in Fingerbowls häufig.</li>
		<li>Legen Sie die Fingerbowls für 5-7 Tage in einen Inkubator. Zu diesem Zeitpunkt ist das Eigelb aufgebraucht und die Fütterung von Kulturen mit lebenden Solegarnelen ist für die weitere Entwicklung notwendig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie Spawning-Daten.<ol>
<li>Notieren Sie für jeden Tank, der Embryonen fallen lässt, die folgenden Informationen.<ol>
<li>Notieren Sie das Datum und die Tanknummer.</li>
			<li>Notieren Sie die ungefähre Anzahl der abgeworfenen Embryonen (Abbildung 2): Hoch (500+) Mittel (200-500) Niedrig(&lt;200)</li>
			<li>Aufzeichnung der Qualität der abgefallenen Embryonen (Abbildung 2): Hoch (&gt;75% lebend) Mittel (25-50% lebend) Niedrig (&lt;25% lebend)</li>
			<li>Schätzen Sie die ursprüngliche Laichzeit, indem Sie die Astyanax mexicanus Staging-Tabelle17 konsultieren.</li>
			<li>Notieren Sie die Temperatur, auf die das System eingestellt wurde, als der Fisch laichte.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füttern Sie alle Fische.</li>
	<li>Stellen Sie die Wassertemperatur auf 76 ° F ein.</li>
	<li>Bereiten Sie Live-Feed vor.</li>
	<li>Füttern Sie Fische #2.</li>
	<li>Überschüssige Nahrung und Schmutz aus Tanks schaufeln und vor dem Zurücksetzen der Netze schrubben.</li>
</ol>3. Mittwoch
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2. Sammeln Sie Embryonen und waschen Sie alle Zuchtnetze.</li>
	<li>Nehmen Sie spawnende Daten wie zuvor.</li>
	<li>Führen Sie wie zuvor Wassertests durch.</li>
	<li>Füttern Sie alle Fische.</li>
	<li>Stellen Sie die Wassertemperatur auf 78 ° F ein.</li>
	<li>Bereiten Sie den Live-Feed vor.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Embryonen im Inkubator.<ol>
<li>Reinigen und wechseln Sie das Wasser der Embryonen in Fingerbowls, die schließlich verwendet werden, um den allgemeinen erwachsenen Zuchtbestand aufzufüllen. Verwenden Sie methylenblau behandeltes Systemwasser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füttern Sie Fische wieder.</li>
	<li>Reinigen Sie die Tanks nach Bedarf und setzen Sie die Netze zurück.</li>
</ol>4. Donnerstag
<ol><li>Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2. Sammeln Sie Embryonen und waschen und lagern Sie Zuchtnetze.</li>
	<li>Nehmen Sie spawnende Daten wie zuvor.</li>
	<li>Stellen Sie die Wassertemperatur auf 76 ° F ein.</li>
	<li>Reinigen Sie den Live-Feed.</li>
	<li>Reinigen Sie alle einzelnen Tanks.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Embryonen im Inkubator.</li>
	<li>Füttern Sie Fische #2.</li>
</ol>5. Freitag
<ol><li>Füttern Sie alle Fische.</li>
	<li>Stellen Sie die Wassertemperatur auf 74 ° F ein.</li>
	<li>Reinigen Sie den Live-Feed.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Embryonen im Inkubator.</li>
</ol>6. Samstag
<ol><li>Fische füttern.</li>
</ol>7. Sonntag
<ol><li>Fische füttern.</li>
</ol>

<ol><li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavefish+as+a+model+system+in+evolutionary+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology.</a> Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+model+systems+in+evo-devo%3A+cavefish+and+mechanisms+of+microevolution%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution.</a> Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).</li>
<li>Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+development+in+the+cavefish+Astyanax%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and development in the cavefish Astyanax.</a> Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).</li>
<li>Protas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+cavefish+reveals+molecular+convergence+in+the+evolution+of+albinism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism.</a> Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).</li>
<li>Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regressive+evolution+in+the+Mexican+cave+tetra%2C+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus.</a> Current Biology. 17, 452-454 (2007).</li>
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<li>Yoshizawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+genetic+architecture+underlies+the+emergence+of+sleep+loss+and+prey-seeking+behavior+in+the+Mexican+cavefish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish.</a> BMC Biology. 13, 15(2015).</li>
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<li>Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+hardness+and+calcium%3Amagnesium+ratio+of+water+during+early+stages+of+rare+minnows+%28Gobiocypris+rarus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus).</a> Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).</li>
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<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22Determining+the+sex+of+adult+Astyanax+mexicanus%22">Determining the sex of adult Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
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<li>Hinaux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+staging+table+for+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Developmental staging table for Astyanax mexicanus.</a> Zebrafish. 8 (4), (2011).</li>
<li>Borowsky, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorowsky%2C+R+%22In+vitro+fertilization+of+Astyanax+mexicanus%22">In vitro fertilization of Astyanax mexicanus</a>. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).</li>
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<li>Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+a+lens+survival+pathway+including+sox2+and+aA-crystallin+in+the+evolution+of+cavefish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration.</a> EvoDevo. 5, 28(2014).</li>
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<li>Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+mutagenesis+confirms+the+role+of+oca2+in+melanin+pigmentation+in+Astyanax+mexicanus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus.</a> Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Astyanax mexicanus ist ein neuartiges biologisches Modell, das häufig laicht und leicht im Labor gezüchtet werden kann1,2. Da wir uns für die Entwicklungsmechanismen interessieren, die evolutionären Veränderungen bei A. mexicanus-Höhlenfischen zugrunde liegen, ist die Produktion und Verwendung von Embryonen für unsere Forschungsziele von entscheidender Bedeutung. Der Hauptzweck der Erhaltung eines erwachsenen Fischbestandes ist die Produktion vo...

Der Teleost Astyanax mexicanus hat eine augenbewohnende (Oberflächenfische) Form und viele verschiedene blinde Höhlenbewohner (Höhlenfische) Formen1,2. Höhlenfische haben sich in ständiger Dunkelheit und unter Nahrungsbeschränkungen entwickelt, was zum Auftreten neuartiger konstruktiver und regressiver Merkmale führt3. Zu den konstruktiven Merkmalen gehören eine Zunahme der Geschmacksknospen und der Kiefergröße, Sinnesorgane der Seitenlinie und Fettreserven. Zu den regressiven Merkmalen gehören der Verlust oder die Verringerung von Melaninpigmentierung, Augen und Verhaltensweisen wie Schlaf, Schulbildung und Aggression. Ein Attribut des Astyanax-Systems ist die vollständige Fruchtbarkeit zwischen den beiden Formen, die die Verwendung von quantitativen Trait Loci (QTL) ermöglicht, um die genomischen Regionen zu bestimmen, die mit der konstruktiven und regressiven Evolution verbunden sind4,5,6,7. A. mexicanus bietet ein vorteilhaftes System zur Untersuchung der Entwicklung, da es dazu gebracht werden kann, häufig im Labor zu laichen. Die Embryonen von A. mexicanus sind durchscheinend, etwas größer als die von Zebrafischen, werden in großen Mengen produziert und entwickeln sich in etwa 8-12 Monaten zu geschlechtsreifen Erwachsenen. Ihre Maximale Laichkapazität beträgt etwa 5 Jahre. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf, der in einer A. mexicanus-Kulturanlage während einer typischen Brutwoche benötigt wird, und enthält die Details der Wartung des Fischsystems und des Temperaturkontrollregimes für maximales Laichen.
A. mexicanus ist ein tropischer Fisch, der in Flüssen lebt, die in Kalksteinplateaus (Oberflächenfische) und in Pools in Kalksteinhöhlen (Höhlenfische)entstehen 8. Kalkstein löst sich auf, um hartes Wasser zu produzieren, und A. mexicanus gedeiht in hartem Wasser. Fische, die an harte Wasserbedingungen angepasst sind, können eine Reihe von salzigen Bedingungen tolerieren, brüten aber im Allgemeinen in bestimmten9. Die Induktion des Laichverhaltens wird durch eine Kombination von Faktoren erreicht. Da Fische kaltblütig sind und auf ihre Umgebung angewiesen sind, um die Homöostase aufrechtzuerhalten, reagiert ihr Stoffwechsel empfindlich auf Umweltveränderungen und sie reagieren schneller auf Stressoren10. A. mexicanus sollte in aquatischen Systemen unter sorgfältig regulierten Bedingungen von Wasserfluss, pH-Wert, Leitfähigkeit, osmotischem Druck, Beleuchtung und Wassertemperaturen kultiviert werden.
Im Jeffery-Labor werden Fische in zwei fließenden Wassersystemen gehalten: (1) einem "Babysystem" für junge erwachsene Fische vor der Geschlechtsreife und (2) einem erwachsenen (oder Haupt-) System für geschlechtsreife, brütende Erwachsene. Das "Babysystem" besteht aus 8 L und 15 L Tanks, die mit fließendem Wasser versorgt werden. Das "Babysystem" wird von Jungfischen und jungen metamorphosisierten Jungtieren ausgesät, die aus Larven in kleineren (1-10 L) Tanks gezüchtet werden, in denen wöchentlich Wasser ausgetauscht wird. Larven, Jungtiere und Jungtiere sind extrem nahrungsabhängig und müssen einmal täglich mit Lebendfutter (Solegarnelen) gefüttert werden, um eine hohe Überlebensrate zu gewährleisten. Junge Jungtiere aus dem "Babysystem" werden nach etwa 1-1,5 Jahren in das Erwachsenensystem eingeordnet. Zuerst werden sie mit pulverisierten Tetraflocken gefüttert und nach weiterem Wachstum in das reguläre Fütterungsregime für Erwachsene überführt. Die Geschlechtsreife kann durch das Bauchvolumen bei Frauen beurteilt werden, und Methoden zur Bestimmung des Geschlechts wurden beschrieben11. Im Erwachsenensystem wird das Wasser automatisch in 42-L-Tanks 3 Mal pro 24-Stunden-Zeitraum ausgetauscht. Das Erwachsenensystem wird täglich durch visuelle Inspektion und automatische Temperatur-, pH- und Leitfähigkeitswerte von Sonden überwacht. Der optimale pH-Wert liegt bei etwa 7,4 und kann zwischen 6,8 und 7,5 liegen, die Basistemperatur des Systems beträgt 72/73 ° F und die ideale Leitfähigkeit liegt zwischen 600 und 800 mS. Automatische Messwerte werden auf einem Controller-Bildschirm angezeigt, und visuelle Überprüfungen des Wasserdrucks werden an Imgühlungsmessern abgelesen, die im gesamten System verteilt sind. Unabhängige Überprüfungen der Wasserqualität werden wöchentlich durchgeführt, indem die Temperatur getestet und die Wasserqualitätsparameter für pH-Wert, Ammoniak und Nitrat mit einem kolorimetrischen Test gemessen werden. Der Ammoniak- und Nitratgehalt wird auf oder nahe Null gehalten, indem dem System nützliche Bakterien (z. B. Nutafin Cycle) hinzugefügt werden. Die Raumbeleuchtung wird über einen Timer gesteuert, der auf 14-Stunden-Licht und 10-Stunden-Dunkelzeiten eingestellt ist. Zusätzlich zu den oben genannten allgemeinen Wasserqualitätsparametern müssen die folgenden Überlegungen während einer Brutwoche besonders beachtet werden.
Die erste Überlegung ist die Photoperiode, da Fische (sogar Höhlenfische im Labor) auf Lichtzyklen angewiesen sind, um ihre zirkadiane Uhr einzustellen. Circadiane Rhythmen können alles von der Zucht und Fütterung bis hin zur Gesundheit des Immunsystemsbeeinflussen 12,13 und müssen für maximale gesundheitliche Vorteile konsistent sein. Fische werden in einem Flaufwassersystem auf einer 14-stündigen hellen und 10-stündigen dunklen Fotoperiode gehalten. Die Oberflächenfische beginnen im Allgemeinen eine Stunde nach der Verdunkelung des Systems mit dem Laichen, und das während dieser Zeit eingebrachte Licht kann das Laichen stören und beenden. Das Laichen blinder Höhlenfische wird weniger durch Licht gestört. Im Vergleich zum Laichen von Oberflächenfischen verzögert sich das Laichen von Höhlenfischen und beginnt in der Regel vier bis fünf Stunden nach der Verdunkelung des Systems.
Die zweite Überlegung ist die Ernährung. Erwachsene Fische werden normalerweise einmal täglich mit Tetraflocken gefüttert. Vor dem Laichen werden Fische mit einer proteinreichen Diät gefüttert, die mit zusätzlichen Mengen an Tetraflocken und anderen Lebensmitteln ergänzt wird: Eigelbflocken und gelegentlich lebende kalifornische Schwarzwürmer (Lumbriculus variegatus), um den Proteinverlust aufgrund der Eierproduktion während des vorherigen Laichzyklus auszugleichen. Während der Brutwoche werden die Fische zweimal täglich gefüttert, einmal morgens und wieder nachmittags/abends. Fischfütterung nur einmal täglich, aber mit einer einzigen sehr großen Portion Futter sollte vermieden werden, da dies zu Unterernährung führen kann14.
Die dritte Überlegung ist der Raum. Der Platzbedarf basiert auf der durchschnittlichen Körpermasse eines Erwachsenen sowie Verhaltensüberlegungen, z. B. ob die Fische Schwarmverhalten oder aggressives Verhalten haben. Über- oder unterfüllte Tanks können zu erhöhter Aggression und ständigem Stress führen, was Fische anfällig für Verletzungen durch ihre Tankkameraden macht und nur ungern am Laichen teilnimmt15. Wir beherbergen normalerweise 10-20 Fische pro 42 L Tank.
Die vierte Überlegung ist die Temperatur. Wie oben erwähnt, sind Fische kaltblütige Tiere und auf die Umwelt angewiesen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Da die Temperatur einen direkten Einfluss auf Stoffwechselprozesse hat, können Temperaturänderungen Verhaltensänderungen bei Fischen auslösen16. Dieses Zuchtprogramm besteht aus zweiwöchigen Temperaturzyklen: Die erste Woche führt zu einem Temperaturanstieg von 78 ° F und die nächste Woche zu einer statischen Temperatur von 72 ° F. Während der ersten (Brut-)Woche werden jeden Abend kunststoffumrandige Zuchtnetze am Boden der Becken platziert. Die Brutnetze dienen als Barriere zwischen den Fischen in den Becken und den laichen Eiern, die sonst verzehrt würden. Die Temperatur wird bis Mitte der Woche um 2 ° F pro Tag auf maximal 78 ° F erhöht, und das Laichen wird entsprechend dem Lichtzyklus in den ersten 2-3 Abenden dieser Woche induziert. Die Temperatur wird dann an den verbleibenden Tagen der Woche um 2 ° F auf 72 ° F gesenkt, und die Basistemperatur wird bis zum Beginn der nächsten Brutwoche beibehalten. Die Zucht wird in der Regel nicht mehr als zweimal im Monat stimuliert, damit sich die Fische erholen können.
Insgesamt ermöglicht diese Methode das Laichen großer Mengen hochwertigster Embryonen über einen längeren Zeitraum.

<table><tbody><tr><td>Blackworms</td><td>Eastern Aquatics, Lancaster, PA</td><td>Keine</td><td></td></tr><tr><td>Zuchtnetze</td><td>Maßgeschneiderte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia-Garneleneier</td><td>AquaCave Lake Forest, IL.</td><td>Keine</td><td></td></tr><tr><td>Kolorimetrisches Testkit</td><td>Petco</td><td>SKU:11916</td><td>API Süßwasser pH Test Kit</td></tr><tr><td>Eigelbflocken</td><td>Pentair, Minneapolis, MN</td><td>Keine</td><td></td></tr><tr><td>Fingerschalen</td><td>Carolina Biological Supply 741004</td><td></td><td>Kulturschalen, 4,5 Zoll, 250 mL</td></tr><tr><td>Handnetze</td><td>Any Pet Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator für Embryonen</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-029-321HPM</td><td>405 L</td></tr><tr><td>Instant Ocean Meersalze</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>Keine</td><td></td></tr><tr><td>Methylenblau</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20</td><td>5,75 Zoll</td></tr><tr><td>Net-Einweichlösung</td><td>Jede Tierhandlung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutrafin Cycle</td><td>Amazon</td><td>Keine</td><td>Bakterielle</td></tr><tr><td>Verstärkung Kühlschrank für Lebendfutter</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermometer</td><td>Jede Quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetra Tropical Crisps</td><td>Spectrum Brands, Blacksburg, VA</td><td>Keine</td><td></td></tr></tbody></table>

inkrementelle temperaturänderungen für maximale brut und laichzeit bei astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Der mexikanische Salmler Astyanax mexicanusist ein aufstrebendes Modellsystem für Entwicklungs- und Evolutionsstudien. Die Existenz von Augenoberflächen- (Oberflächenfischen) und blinden Höhlenmorphen (Höhlenfische) in dieser Art bietet die Möglichkeit, die Mechanismen zu hinterfragen, die der morphologischen und Verhaltensevolution zugrunde liegen. Höhlenfische haben neuartige konstruktive und regressive Eigenschaften entwickelt. Zu den konstruktiven Veränderungen gehören Eine Zunahme der Geschmacksknospen und Kiefer, der Sinnesorgane der Seitenlinie und des Körperfetts. Die regressiven Veränderungen umfassen den Verlust oder die Verringerung der Augen. Melaninpigmentierung, Schulverhalten, Aggression und Schlaf. Um diese Veränderungen experimentell zu untersuchen, ist es entscheidend, eine große Anzahl von erzeugten Embryonen zu erhalten. Seit die ursprünglichen A. mexicanus Oberflächenfische und Höhlenfische in den 1990er Jahren in Texas und Mexiko gesammelt wurden, wurden ihre Nachkommen routinemäßig dazu angeregt, zweimonatlich im Jeffery-Labor eine große Anzahl von Embryonen zu züchten und zu laichen. Obwohl die Zucht durch Nahrungsfülle und -qualität, Hell-Dunkel-Zyklen und Temperatur gesteuert wird, haben wir festgestellt, dass inkrementelle Temperaturänderungen eine Schlüsselrolle bei der Stimulierung des maximalen Laichens spielen. Der allmähliche Temperaturanstieg von 72 ° F auf 78 ° F in den ersten drei Tagen einer Brutwoche bietet zwei bis drei aufeinanderfolgende Laichtage mit einer maximalen Anzahl hochwertiger Embryonen, gefolgt von einem allmählichen Temperaturabfall von 78 ° F auf 72 ° F während der letzten drei Tage der Laichwoche. Die in diesem Video gezeigten Verfahren beschreiben den Arbeitsablauf vor und während einer Laborzuchtwoche für ein inkrementelles temperaturstimuliertes Laichen.

Wir züchten und laichen im Allgemeinen die Nachkommen von Oberflächenfischen, die ursprünglich im Nacimiento del Rio Choy in San Luis Potosi, Mexiko (Rio Choy Oberflächenfisch) und San Solomon Springs im Balmorhea State Park, Texas (Texas Oberflächenfisch) und Höhlenfischen aus Cueva de El Pachón (Pachón Höhlenfisch) in Tamaulipas, Mexiko, und Cueva de los Sabinos (Los Sabinos Höhlenfisch) und Sotano de la Tinaja (Tinaja Höhlenfisch) in San Luis Potosi gesammelt wurden Mexiko.
Während einer Br...

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Laborbedingungen und Protokolle für ein inkrementelles Temperaturregime zur Stimulierung des maximalen Laichens beim mexikanischen Salmler Astyanax mexicanus, einem aufstrebenden Modell für Entwicklungs- und Evolutionsstudien.

Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...

So wie der Astyanax mexicanas ein kleiner Fisch ist. Sie ist im Nordosten Mexikos und im Süden von Texas beheimheimischt. Das Wichtige daran ist, dass es in zwei Formen existiert.Eine Form ist ein oberflächenbewohnender Fisch mit großen Augen und Pigmentierung, und die andere Form ist ein höhlenbewohnender Fisch, der seine Augen und seine Pigmentierung verloren hat. Sie sind immer noch in der Lage, zu laichen, miteinander zu hybridisieren, so dass sie in einer vorwärts gerichteten genetischen Analyse verwendet werden können, um Genetik und Entwicklung zu studieren. Haben auch große Embryonen, die transparent sind, und sie können verwendet werden, um vergleichende Entwicklungsbiologie zu studieren.Sie werden also seit vielen Jahren als System verwendet, um die Entwicklung der Entwicklung zu verstehen. Einige Tage bevor das Laichen gewünscht wird, beginnen wir, die Fische besser zu füttern. Wir erhöhen auch die Temperatur schrittweise, so dass sie innerhalb der Zeit, in der wir sie laichen sollen, etwa zwei oder drei Tage übermäßig laichen und eine große Anzahl befruchteter Embryonen produzieren, die sich gut und durch die Larvenstadien zu Erwachsenen entwickeln.Nachdem Sie den Fisch

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Gene-Targeting-Mutagenese ist nun möglich, in einem breiten Spektrum von Organismen unter Verwendung von Genom Bearbeitungstechniken. Hier zeigen wir ein Protokoll für eine gezielte Genmutagenese mit Talens (Talens) in Astyanax mexicanus, Fischarten , die Oberflächenfische und cavefish enthält.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Eine Reihe von grundlegenden Methoden, um das Studium der Fortpflanzungsökologie von Fisch, die in Aquarien gehalten werden, zu ermöglichen, werden beschrieben. Dies sind nützliche Protokolle für das Sammeln von Fischen mit SCUBA, den Transport von lebenden Fischen und die Beobachtung des Fortpflanzungsverhaltens von wild gefangenen Fischen, die in Aquarien gehalten werden.

Grundlegende Methoden für die Untersuchung der Fortpflanzungsökologie von Fischen in Aquarien

Langzeitstudien sind unerlässlich, um den Prozess der Evolution und die Mechanismen der Anpassung zu verstehen. Diese Studien erfordern in der Regel, Verpflichtungen über die Lebensdauer der Forscher. Hier ist eine leistungsfähige Methode beschrieben, die State-of-the-Art-Datensammlung zum Generieren von Längsschnittdaten in natürlichen Systemen erheblich Fortschritte.

Auferstehung des ruhenden Daphnia Magna: Protokoll und Anwendungen

In dieser Arbeit beschreiben wir eine akute, chronische und Mehrgenerationen Bioassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Einzel- und kombinierte Stressoren auf die türkisfarbene Killifische Nothobranchius Furzeri. Dieses Protokoll dient zur Lebensgeschichte Züge (Mortalität, Wachstum, Fruchtbarkeit, Gewicht) und kritische thermische Maximum zu studieren.

Protokoll für akute und chronische Ökotoxizität Prüfung von Türkis Killifische Nothobranchius furzeri

In diesem Protokoll wir zeigen, wie Astyanax Mexicanus Erwachsene zu züchten, die Larven zu erhöhen, und ganze-Mount Immunohistochemistry auf Post-Larven Fische zu vergleichen die Phänotypen der Oberfläche und Höhle Morphotypen führen.

Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry

Wir beschreiben Ansätze für die Manipulation von Genen im evolutionären Modellsystem Astyanax Mexicanus. Drei verschiedene Techniken beschrieben: Tol2-vermittelte Transgenese, gezielte Manipulation des Genoms mit CRISPR/Cas9 und Zuschlag des Ausdrucks mit Morpholinos. Diese Tools sollten die direkte Untersuchung von Genen zugrunde liegen die Unterschiede zwischen Oberfläche und höhlenbewohnenden Formen erleichtern.

Manipulation der Genfunktion in mexikanischen Cavefish

Hier präsentieren wir Methoden für Hochdurchsatz-Studie eine Reihe von mexikanischen Cavefish, Verhaltensweisen und lebenswichtigen Färbung eines Mechanosensory-Systems. Diese Methoden nutzen freier Software und kundenspezifische Skripte, bietet eine praktische und kostengünstige Methode für das Studium des Verhaltens.

Verhaltens-Tracking und Neuromast Darstellung der mexikanischen Cavefish

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

Die In-vitro-Fertilisation ist eine häufig verwendete Technik mit einer Vielzahl von Modellorganismen, um Laborpopulationen zu erhalten und synchronisierte Embryonen für nachgelagerte Anwendungen zu produzieren. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das diese Technik für verschiedene Populationen des mexikanischen Tetrafisches Astyanax mexicanusumsetzt.

Gamete Collection und In-Vitro-Fertilisation von Astyanax mexicanus

Dieses Ziel dieses Protokolls ist es, chimäre Axolotle mit haploiden Vorderbeinen aus Cas9-mutagenisiertem Spendergewebe unter Verwendung embryonaler Gewebetransplantationstechniken zu produzieren.

Generation von Chimeric Axolotls mit Mutant Haploid Limbs Durch Embryonale Grafting

Das vorliegende Protokoll veranschaulicht die Verwendung kommerziell erhältlicher Komponenten zur Erzeugung eines stabilen und linearen thermischen Gradienten. Ein solcher Gradient kann dann verwendet werden, um die obere thermische Grenze von Planktonorganismen, insbesondere wirbellosen Larven, zu bestimmen.

Bestimmung der thermischen Grenzen für Zooplankton mit einem Wärmeblock

Erfahren Sie inkrementelle Temperaturprotokolle zur Maximierung der Laichzeit bei Astyanax mexicanus. Diese Methode unterstützt vergleichende Entwicklungsbiologie und evolutionäre Genetik.

Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus

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