Name: Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Lernen Sie eine hydrophobe Gewebeklärung für Rattenhirngewebe. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung neuronaler Schaltkreise bei intakter Gewebeintegrität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse finanziert: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & durch T32 Training Grant 5T32GM081740

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung der Lagerlösung
<ol><li>Lösung 1 (1 L): Zu 900 ml entionisiertemH2Owerden 100 mL 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 2 ml Triton X-100 hinzugefügt.</li>
	<li>Lösung 2 (1 L): Zu 900 ml entionisiertemH2Owerden 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 und 1 ml 10 mg/ml Heparin-Stammlösung hinzugefügt.</li>
	<li>Lösung 3 (500 ml): Zu 400 ml Lösung 11,5 g Glycin und 100 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen.</li>
	<li>Lösung 4 (50 ml): Zu 42 ml Lösung 1 werden 3 ml entsprechendes Serum und 5 ml DMSO hinzugefügt.</li>
	<li>Primäre Antikörperlösung (50 ml): Zu 46 ml Lösung 2 werden 2,5 ml DMSO und 1,5 ml entsprechendes Serum hinzugefügt.</li>
	<li>Sekundäre Antikörperlösung (50 ml): Zu 48,5 ml Lösung 2 werden 1,5 ml entsprechendes Serum hinzugefügt. HINWEIS: Verwenden Sie für Lösung 4, Primärlösung und Sekundärlösung ein Serum, das dem sekundären Antikörper (z. B. Ziege, Pferd, Rind) entspricht.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7 in einem Abzug aus, um die Exposition gegenüber PFA zu begrenzen.
<ol><li>Junge (3-6 Wochen) Ratten mit Sevofluran tief betäuben; Fahren Sie mit 2.2 fort, wenn die Ratte nicht anspricht und nicht auf Zehen- und Schwanzklemmen reagiert.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in Rückenlage und machen Sie mit einer Irisschere einen Schnitt durch die Bauchdecke.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Mayo-Schere durch den Boden des Brustkorbs bis zum Schlüsselbein auf beiden Seiten des Brustkorbs.</li>
	<li>Befestigen Sie das Brustbein und die Rippen weg vom Herzen und der Lunge mit einem Hämostat.</li>
	<li>Durchbohren Sie den linken Ventrikel mit einer 23 G Nadel, die an einer Perfusionspumpe befestigt ist, und schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Irisschere.</li>
	<li>Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit ca. 75 ml 100 mM (1x) PBS durch.</li>
	<li>Setzen Sie die transkardiale Perfusion mit etwa 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) fort, das in 1x PBS gepuffert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vom Schädel.</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn in sagittale Position und schneiden Sie es mit einer Rasierklinge und einer Rattenhirnmatrix in 4 gleiche Abschnitte (ca. 3 mm breit).</li>
	<li>Fixieren Sie jeden Abschnitt in 4% PFA in 1x PBS in einem versiegelten, 5mL Kunststoffrohr über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.</li>
	<li>Fixieren Sie weiterhin 4% PFA in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker für 1 h.</li>
	<li>Waschen Sie jeden Abschnitt mit 1x PBS bei RT für 30 min, 3 mal.</li>
</ol>3. Dehydrierung und Depigmentierung
<ol><li>Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 100% Methanol für 1 h bei RT. Wiederholen Sie mit mehr 100% Methanol und inkubieren Sie für 1 h bei RT.</li>
	<li>Kühlen Sie die Probe in 100% Methanol bei 4° C für ca. 10 min.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 66% ige Dichlormethan (DCM)/33% ige Methanollösung vor.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe über Nacht in der DCM/Methanol-Lösung bei RT unter Schütteln.</li>
	<li>Mit Methanol bei RT 30 min, 2 mal waschen.</li>
	<li>Kühlen Sie die Probe in 100% Methanol bei 4° C für ca. 10 min.</li>
	<li>Bleiche in gekühltem, frisch zubereitetem 5% Wasserstoffperoxid in Methanol über Nacht bei 4° C.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 1x PBS für 1 h bei RT.</li>
	<li>In Lösung 1 für 1 h bei RT 2 mal waschen.</li>
</ol>4. Choleratoxin-Untereinheit B-Kennzeichnung
<ol><li>Führen Sie die Nadelspitze der 1 ml Spritze in die Nucleus accumbens-Stelle ein.</li>
	<li>Langsam 2,5 μL 1% Biotin-CTB über 20 s injizieren.</li>
	<li>Lassen Sie die Nadelspitze für 1 Minute an Ort und Stelle und entfernen Sie langsam über 10 s, um ein Auslaufen zu vermeiden.</li>
</ol>5. Antikörper-Anwendung
<ol><li>Die Probe in Lösung 3 für 2 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>Die Probe in Lösung 4 für 2 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>Mit primärem Antikörper 7 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>In Lösung 2 5 mal waschen und 1 h pro Waschgang inkubieren. Speichern Sie lösungsweise in Lösung 2 bei RT.</li>
	<li>Mit sekundären Antikörpern 7 Tage bei 37 °C im Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>In Lösung 2 5 Mal waschen und 1 h pro Waschgang inkubieren; über Nacht in Lösung 2 bei RT speichern. HINWEIS: Alle Schritte ab 5.6, einschließlich der Endlagerung, sollten bei schlechten Lichtverhältnissen erfolgen. Die Probenröhrchen können mit Aluminiumfolie abgeschirmt werden. Die für die Antikörper in diesem Protokoll verwendeten Konzentrationen waren: TH bei 1:100, Iba1 bei 1:200 und der sekundäre Antikörper bei 1:100. Fügen Sie den Schritten 5.1-5.6 zusätzliche Lösung 2 hinzu, um sicherzustellen, dass die Röhrchen vollständig gefüllt sind.</li>
</ol>6. Gewebereinigung
<ol><li>Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 100% Methanol für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie in frischem 100% Methanol über Nacht bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie in 66% DCM / 33% Methanol für 3 h, mit Schütteln, bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie dibenzylether (DBE) ohne zu schütteln. Lassen Sie das Beispiel in DBE, bis es klar ist, und speichern Sie es in DBE bis zur Bildgebung.</li>
</ol>7. Montage
<ol><li>Erhalten Sie eine 3D-gedruckte Kammer aus Visijet M3 Crystal Harz (Vorlagen auf der idisco.info Website verfügbar).</li>
	<li>Befestigen Sie die Kammer mit einem Epoxidharz an einem Objektträger.</li>
	<li>Platzieren Sie die Probe in dem quadratischen Raum in der Mitte der Kammer.</li>
	<li>Füllen Sie die Kammer vollständig mit DBE.</li>
	<li>Legen Sie einen 0,17 mm dicken Abdeckrlip über die Kammer und drücken Sie Druck aus, bis der Abdeckripp vollen Kontakt mit den Kammerwänden hat.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Kanten des Abdecklippes mit dem Epoxidharz zur Kammer.</li>
	<li>Drehen Sie die Kammer, damit Luftblasen aus dem Fülleinlass entweichen können.</li>
	<li>Füllen Sie die Kammer mit zusätzlichem DBE.</li>
	<li>Den Fülleinlass mit Epoxidharz verschließen und aushärten lassen. HINWEIS: Überschüssiges DBE wird während der Montage auslaufen.</li>
</ol>8. Bildgebung
<ol><li>Verwenden Sie ein konfokales Mikroskopsystem, um einen Z-Scan mit 4-facher Vergrößerung durchzuführen (siehe das beigefügte 3D-Video).</li>
	<li>Erreichen Sie eine fluoreszierende Anregung der Probe mit einem Lasersatz, der bei einer Wellenlänge emittiert, die der vom sekundären Antikörper angegebenen Wellenlänge ähnelt. Die TH-Anregung wurde mit einem HeNe-Lasersatz erreicht, der bei 632 nm emittiert.</li>
	<li>Stellen Sie den Detektor auf eine Wellenlänge in der Nähe der Laseremission ein. Für das vorliegende Protokoll wurde der Detektor für TH auf 650 nm eingestellt.</li>
	<li>Erhöhen Sie die Verstärkung des Detektors, bis ein sichtbares Signal vorhanden ist. Die Verstärkung von 650LP für Bilder wurde auf 7,50 B eingestellt.</li>
	<li>Bewegen Sie mit der Scan-Option in der konfokalen Bildgebungssoftware den Mikroskopstand, bis die Probe in den Fokus gehoben wird.</li>
	<li>Navigieren Sie in allen Ebenen durch das Gewebe und erhalten Sie entweder Einzelbilder oder Z-Stack-Bilder mit der konfokalen Bildgebungssoftware.</li>
	<li>Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe aus der Kammer. Legen Sie es wieder in ein vollständig mit DBE gefülltes Rohr und lagern Sie es bei RT an einem dunklen Ort, vorzugsweise mit Aluminiumfolie bedeckt. HINWEIS: Proben können wieder montiert und abgebildet werden, solange das Blütenstandssignal noch stark ist.</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li>
<li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li>
<li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens%3A+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).</li>
<li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins%2C+Tat+and+gp120%2C+target+the+developing+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li>
<li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+One%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404(2017).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152(2018).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurovirology%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li>
<li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li>
<li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braking+dopamine+systems%3A+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscienc%22%5BJournal%5D)">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li>
<li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).</li>
<li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li>
<li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy%3A+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
</ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

Tissue Clearing bietet eine Lösung für die Einschränkungen des traditionellen IHC-Protokolls. Eine transparente Probe minimiert die Streuung und Absorption von Licht, was auf zellulärer Ebene einen optischen Zugang zu intaktem Gewebebietet 18,19. Gewebereinigungstechniken machen ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung mit der Verabreichung von Lösungsmitteln transparent. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten...

Mehrere Gewebereinigungstechniken wurden für den Einsatz im Gehirn validiert: Hydrogel, hydrophil und hydrophob. Diese Techniken zielen darauf ab, ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung durch die Verabreichung von Lösungsmitteln transparent zu machen. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten Bildgebungsmediums übereinstimmt, kann ein klares Bild der Probe erhalten werden. Hydrogel-basierte Techniken wie CLARITY sichern Biomoleküle im Gewebe, indem sie mit Hydrogelen auf Acrylbasis verbunden werden, was strukturelle Schäden und den Verlust von Proteinen verhindert1. Hydrogel-Techniken verwenden jedoch aggressive Chemikalien, die das Potenzial haben, zerbrechlichere Gewebe zu schädigen, und dichtere Gewebeproben sind möglicherweise nicht mit dem Hydrogel-Protokoll kompatibel. Bestimmte Hydrogeltechniken können teure Geräte erfordern oder zu einer Gewebeausdehnung führen. Hydrophile Techniken, wie CUBIC, bewahren die 3D-Struktur durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen im Gewebe2. Gewebeerweiterung kann auch in bestimmten hydrophilen Protokollen auftreten. Die Clearingfähigkeit hydrophiler Techniken entspricht oft nicht der Fähigkeit hydrophober Techniken, die für dichtere und dickere Gewebe wichtig ist3.
Hydrophobe Techniken sind in der Regel schnell, erfordern keine spezielle Ausrüstung und produzieren eine Probe, die einfach zu handhaben und zu lagern ist. iDISCO ist eine hydrophobe Technik, die die Schrumpfung beseitigt, die in anderen hydrophoben Protokollen auftreten kann. Ursprünglich wurde die iDISCO Gewebereinigungstechnik von Renier et al.4 für die Embryonen und dichten, adulten Organe von Mäusen beschrieben. Diese Technik entfernt dem Gewebe im ersten Austrocknungsschritt Wasser und reduziert so die Lichtstreuung. Gewebe wird während der Vorbehandlung permeabilisiert, um eine tiefe Antikörperpenetration zu ermöglichen. Alexa Fluor Farbstoffe im fernroten Spektrum werden zur Immunmarkierung verwendet, um autofluoreszenz des Gewebes bei niedrigeren Wellenlängen zu vermeiden5. Gewebe, das hydrophoben Clearing-Protokollen unterzogen wurde, kann leicht gehandhabt und aufgrund der Langlebigkeit der Alexa Fluor-Farbstoffe mehrmals abgebildet werden. Bei richtiger Lagerung können Gewebe nach der ersten Verarbeitung Monate bis zu einem Jahr lang Bilder liefern.
Im vorliegenden Protokoll wurden Tyrosinhydroxylase (TH) Antikörper, Iba1 Antikörper und Cholera Toxin Subunit B (CTB) sowohl bei männlichen und weiblichen Kontroll- als auch bei HIV-1 transgenen (Tg) Rattengehirnen eingesetzt. Die HIV-1 Tg-Ratte besitzt sieben der neun Gene, aus denen das HIV-1-Virusgenom besteht, was zu einem nicht-infektiösen Modell der langfristigen HIV-1-Proteinexposition führt6,7,8. Dopaminerge Veränderungen wurden zuvor bei der HIV-1 Tg-Ratte nachgewiesen, und HIV-1 selbst ist eine entzündliche Erkrankung, so dass die Antikörperwahl für das experimentelle Design relevant war9,10,11,12. CTB ist ein Tracer, der über Gangliosidbindung an Neuronen bindet und verwendet werden kann, um affelinete Projektionen im Gehirn zu verfolgen. CTB wurde zuvor verwendet, um Projektionen vom Nucleus accumbens bis zum Substantia nigra-Bereich zu untersuchen, zwei Bereichen des Gehirns, die stark an dopaminergen Signalwegen beteiligt sind13,14,15.
In diesem Protokoll wird TH als Marker für die Dopaminproduktion dienen, und Iba1 wird aktivierte Mikroglia markieren. Der verwendete TH-Antikörper kennzeichnet selektiv ein einzelnes Band bei etwa 62 kDa, das der Tyrosinhydroxylase entspricht. Der Iba1-Antikörper entspricht der Iba1-Carboxy-terminalen Sequenz. Beide Antikörper wurden bei Kaninchen aufgezogen und waren polyklonal. CTB wird zur retrograden Rückverfolgung von Neuronen vom Nucleus accumbens-Bereich bis zum Substantia nigra-Bereich verwendet. Das aktuelle Protokoll bietet auch eine Richtlinie für die Anpassung des ursprünglichen iDISCO-Protokolls auf zwei verschiedene Arten: 1) Gesamtreduktion der Hintergrundfärbung durch Änderung der Serumreagenzien in den Blockierungsschritten und 2) Skalierung der Inkubationszeit, um für größere Gewebeproben geeignet zu sein. Insgesamt liefert das vorliegende Protokoll weiterhin Beweise dafür, dass hydrophobe Clearing-Techniken im Gehirngewebe der Ratte durchführbar sind, keine erkennbaren schädlichen Wechselwirkungen mit HIV-1-Virusproteinen aufweisen und mit TH-Antikörpern, Iba1-Antikörpern und CTB kompatibel sind.

<table><tbody><tr><td>Choleratoxin Untereinheit B (rekombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DCM Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 primärer Antikörper</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil Epoxid</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionsmaschine</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>Minipumpe mit variablem Durchfluss</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH Primärantikörper</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>Nr. BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

eine hydrophobe gewebereinigungsmethode für rattenhirngewebe

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobe Gewebereinigungsmethoden sind leicht einstellbare, schnelle und kostengünstige Verfahren, die die Untersuchung eines Moleküls von Interesse in unveränderten Gewebeproben ermöglichen. Herkömmliche Immunmarkierungsverfahren erfordern das Schneiden der Probe in dünne Abschnitte, was die Fähigkeit einschränkt, intakte Strukturen zu kennzeichnen und zu untersuchen. Wenn jedoch Hirngewebe während der Verarbeitung intakt bleiben kann, können Strukturen und Schaltkreise für die Analyse intakt bleiben. Zuvor etablierte Clearing-Methoden brauchen viel Zeit, um das Gewebe vollständig zu reinigen, und die aggressiven Chemikalien können oft empfindliche Antikörper schädigen. Die iDISCO-Methode räumt Gewebe schnell und vollständig, ist mit vielen Antikörpern kompatibel und erfordert keine spezielle Laborausrüstung. Diese Technik wurde ursprünglich für den Einsatz in Mäusegewebe validiert, aber das aktuelle Protokoll passt diese Methode an die Abbildung von Hemisphären von Kontroll- und transgenen Rattengehirnen an. Darüber hinaus nimmt das vorliegende Protokoll auch mehrere Anpassungen am bereits vorhandenen Protokoll vor, um klarere Bilder mit weniger Hintergrundflecken zu liefern. Antikörper gegen Iba-1 und Tyrosinhydroxylase wurden bei der transgenen HIV-1-Ratte und bei F344/N-Kontrollratten mit der vorliegenden hydrophoben Gewebereinigungsmethode validiert. Das Gehirn ist ein verwobenes Netzwerk, in dem Strukturen häufiger zusammenarbeiten als getrennt voneinander. Die Analyse des Gehirns als Gesamtsystem im Gegensatz zu einer Kombination einzelner Teile ist der größte Vorteil dieser gesamten Gehirnreinigungsmethode.

Die vollständige Beseitigung großer Abschnitte von F344/N- und HIV-1-Rattenhirngewebe wurde mit diesem modifizierten hydrophoben Gewebereinigungsprotokoll erreicht. Abbildung 1 zeigt ein typisches konfokales Bild für TH im Bereich substantia nigra. Abbildung 1A stellt eine dichte, positive Färbung dar. Dichte Bereiche wie diese können durch Fokussierung durch die "Z" -Ebene analysiert werden, um eine positive Färbung und die richtige Zellmorphologie zu bestätige...

Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Das übergeordnete Ziel dieser Clearing-Technik ist es, eine Gewebe-Clearing-Methode für das Rattengehirn zu etablieren. Dieses Protokoll kann auch für die HIV-1-transgene Ratte verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Hirngewebe der Ratte für die Reinigung intakt gelassen werden kann, was eine vollständige Analyse auf Schaltkreisebene ermöglicht.Kristin Kirchner, eine Doktorandin aus meinem Labor, und auch Hailong Li, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Nachdem Sie eine transkardiale Perfusion bei einer drei bis sechs Wochen alten Ratte durchgeführt haben, entfernen Sie das Gehirn mit einer Zange aus dem Schädel. Platzieren Sie es dann in einer sagittalen Position und schneiden Sie es mit einer Rasierklinge und einer Rattenhirnmatrix in vier gleich drei Millimeter breite Abschnitte.Fixieren Sie jeden Abschnitt mit vier Prozent PFA in einem versiegelten Fünf-Milliliter-Plastikröhrchen über Nacht auf einem Schüttler bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag setzen Sie die Fixierung bei Raumtemperatur eine Stunde lang fort. Waschen Sie jeden Abschnitt dreimal etwa 30 Minuten lang pro Waschgang mit PBS.Inkubieren Sie die gewaschenen Abschnitte seriell jeweils eine Stunde lang in 20-, 40-, 60-, 80- und 100%iger Methanollösung. Wiederholen Sie die Dehydrierung mit 100%Methanol. Anschließend werden die Proben in 100%igem Methanol bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang gekühlt.Eine Lösung mit 66 % DCM und 33 % Methanol wird hergestellt und die gekühlten Teile in dieser Lösung über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Waschen Sie die Probe am nächsten Tag zweimal 30 Minuten lang mit Methanol und kühlen Sie sie 10 Minuten lang in 100 % Methanol bei vier Grad Celsius. Zum Bleichen legen Sie die Probe in frisches fünfprozentiges Wasserstoffperoxid in Methanol und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius.Nach der Inkubation über Nacht inkubieren Sie die Probe seriell in 80-, 60-, 40- und 20%igen Methanollösungen für jeweils eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie dann die Probe eine Stunde lang in PBS und waschen Sie sie zweimal in Lösung, einmal eine Stunde lang pro Waschgang. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 2,5 Mikrolitern einem Prozent Biotin-CTB und injizieren Sie es langsam über 20 Sekunden in die Stelle des Nucleus accumbens.Lassen Sie die Nadelspitze eine Minute lang an Ort und Stelle und entfernen Sie sie langsam über 10 Sekunden, um ein Auslaufen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Probe in Lösung drei und dann Lösung vier für jeweils zwei Tage in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Fügen Sie dann den primären Antikörper hinzu und setzen Sie die Inkubation sieben Tage lang fort.Waschen Sie die Probe fünfmal eine Stunde lang pro Waschgang in Lösung zwei und lagern Sie sie über Nacht in Lösung zwei bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Probe mit einem Sekundärantikörper sieben Tage lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Zum Schluss waschen Sie es eine Stunde lang pro Waschgang fünfmal in Lösung zwei und lagern Sie es in Lösung zwei bei Raumtemperatur über Nacht bei schwachem Licht.Inkubieren Sie die Probe seriell in 20, 40, 60, 80 und 100 % Methanol für jeweils eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann über Nacht in frischem 100%igen Methanol inkubieren. Am nächsten Tag wird die Probe in frisch zubereiteten 66 % DCM in 33 % Methanol drei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.Nach drei Stunden wird die Probe in Dibenzylether ohne Schütteln inkubiert, bis sie klar ist. Bewahren Sie es dann bis zur Bildgebung in Dibenzylether auf. Besorgen Sie sich eine 3D-Druckerkammer und befestigen Sie sie mit Epoxidharz an einem Objektträger.Legen Sie die Probe in den quadratischen Raum in der Mitte der Kammer und füllen Sie die Kammer vollständig mit Dibenzylether. Legen Sie einen 0,17 Millimeter dicken Deckslip über die Kammer und üben Sie Druck aus, um sicherzustellen, dass er in vollem Kontakt mit den Kammerwänden steht. Anschließend versiegeln Sie die Ränder mit Epoxidharz.Achten Sie darauf, die Kammer zu drehen, damit Luftblasen aus dem Einfüllstutzen entweichen können. Füllen Sie die Kammer mit zusätzlichem Dibenzylether. Anschließend den Einfülleinlauf mit Epoxidharz verschließen und aushärten lassen.Beobachten Sie die Probe mit einem konfokalen Mikroskopsystem, um einen Z-Scan mit vierfacher Vergrößerung durchzuführen. Das konfokale Bild einer hydrophob geklärten Gewebeprobe bei vierfacher Vergrößerung zeigt eine dichte TH-Färbung im Bereich der Substantia nigra, spärliche TH-Neuronen neben der Substantia nigra und einen dunkelschwarzen Bereich des Gewebes ohne TH-Neuronen. Die typische Morphologie eines TH-positiven Neurons bei 20-facher Vergrößerung weist ein großes Soma und mehrere Verzweigungsfortsätze auf.Während IBA1-gefärbte Mikroglia kleine Zellkörper und kürzere Verlängerungsprozesse aufweisen. Das ideale konfokale Bild zeigt eine positive und dichte TH-Färbung im Bereich der Substantia nigra mit geeigneter Fluoreszenzverstärkung. Beispiele für schlechte konfokale Bilder sind ein falsch fokussiertes Bild mit zu viel Fluoreszenzgewinn, eine falsch positive Färbung mit hellen Flecken, die nicht mit dem Rest des Gewebes übereinstimmen, und eine hohe Hintergrundfärbung als Folge der Verwendung eines blockierenden Serums, das nicht mit einem Sekundärantikörper übereinstimmt.Hier ist eine positive CTB-Färbung im Rattengehirn dargestellt. Die langen, dünnen Fasern sind afferente Projektionen entlang des dopaminergen Signalwegs. Die Kolokalisation von TH und CTB ermöglicht es, die Injektionsstelle im Bereich des Nucleus accumbens sichtbar zu machen, die als dicht fluoreszierender grüner Kreis erscheint.Die Kolokalisation von TH und CTB in der Substantia nigra ist hier dargestellt. Die wichtigsten Dinge, die Sie bei diesem Verfahren beachten sollten, sind, dass die Probe genügend Zeit hat, in allen Antikörperlösungen zu inkubieren, und genügend Zeit, um sich vor der Bildgebung vollständig zu reinigen. Die Probe sollte nur begrenzt mit Luft in Berührung kommen, da dies die Probe beschädigen kann.Diese Technik ist sehr vielseitig und kann verwendet werden, um viele verschiedene interessante Proteine in verschiedenen Regionen des Gehirns zu untersuchen. Die vorliegende Technik ebnet den Neurowissenschaftlern den Weg, das Gehirn von Ratten auf der Ebene der Schaltkreise zu untersuchen, was für die Erforschung des Gehirns als Gesamtsystem unerlässlich ist.

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Video beschreibt das 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid-Färbeverfahren zur Visualisierung von Gewebeschnitten des Rattenhirns und zur Unterscheidung von lebensfähigem und geschädigtem Gewebe nach Verschluss und Reperfusion der mittleren Hirnarterie.

TTC-Färbung von Gewebeschnitten aus dem Hirngewebe der Ratte: Ein Färbeverfahren zur Unterscheidung von lebensfähigem und nekrotischem Gewebe in Gewebeschnitten nach Ischämie-Reperfusionsschäden

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Gehirn-Mikrogefäßen von euthanasierten Ratten. Es umfasst die Dissektion des Gehirns, die Reinigung des Gewebes und die mechanische Verdauung, gefolgt von einer wiederholten Zentrifugation, um die reine Fraktion der Mikrogefäße zu isolieren.

Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

Quelle: Kirchner, K.N., et al., Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Hirngewebe von Ratten. J. Vis. Exp. (2020). Dieses Video zeigt die Methode der hydrophoben Gewebereinigung einer Gewebeprobe des Rattenhirns. Die Probe wird sequentiell in Methanol dehydriert, mit einem Dichlormethan-Methanol-Gemisch behandelt, um Lipide und Pigmente aufzulösen, und zur vollständigen Gewebereinigung auf Dibenzylether übertragen, was eine detaillierte Bildgebung ohne Dünnschnitte ermöglicht.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für eine Gewebeprobe aus dem Gehirn einer Ratte

Bilaterale Carotisokklusion mit systemischer Hypotonie gekoppelt produziert globales Gehirn Ischämie bei der Ratte, was zu einer Beschädigung des Hippocampus mit reproduzierbaren Schwere. Tier Probanden mit vorhersagbaren Mustern der Hirnschädigung beeinträchtigt sind, erholen sie zweckmäßig und Mortalitätsraten sind vergleichsweise gering.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

Wir präsentieren hier ein optimiertes, detailliertes Protokoll für die Doppelimmunfärbung in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten des Zentralnervensystems (ZNS) und des peripheren Lymphknotens (LN) von Ratten.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Um die Struktur neuronaler Netze zu verstehen, funktionellen und morphologischen Charakterisierung der einzelnen Neuronen notwendig. Hier zeigen wir, juxtasomal Biocytin Etikettierung, die elektrophysiologischen Ableitungen in der extrazellulären Konfiguration ermöglicht, aber die Aufrechterhaltung der Fähigkeit, intrazellulär beschriften Sie die Neuron für Post-hoc-Rekonstruktion von dendritischen und axonalen Architektur.

Juxtasomal Biocytin Labeling, um die Struktur-Funktions-Beziehung der einzelnen kortikalen Neuronen Studieren

Ein Protokoll für die Sublimation der DAN-Matrix auf Rattenhirngewebe zum Nachweis von Gangliosiden mittels MALDI Imaging Massenspektrometrie wird vorgestellt.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

Wir präsentieren ein Protokoll zur Etablierung eines massiven pontinen Blutungsmodells bei einer Ratte durch doppelte Injektion von Eigenblut.

Massive Pontinenblutung durch Doppelinjektion von Eigenblut

Neuronale dendritische Morphologie liegt oft der Funktion zugrunde. Tatsächlich manifestieren sich viele Krankheitsprozesse, die die Entwicklung von Neuronen beeinflussen, mit einem morphologischen Phänotyp. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und leistungsfähige Methode zur Analyse intakter dendritischer Dornen und der dazugehörigen Stacheln.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Diese Studie stellt ein Protokoll für die Extraktion und Aufbereitung von geklärten Ganzhirn- und Rückenmarksproben mit konservierten Fluoreszenzsignalen vor, das die experimentelle Effizienz und Datenintegrität verbessert, um die neurowissenschaftliche Forschung voranzutreiben.

Extraktion und Gewebereinigung Aufbereitung von Proben aus dem Gehirn und dem Rückenmark der Maus

Lernen Sie eine hydrophobe Gewebeklärung für Rattenhirngewebe. Diese Methode ermöglicht hochauflösende Bildgebung neuronaler Schaltkreise bei intakter Gewebeintegrität.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Weitere Videos entdecken