Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Das übergeordnete Ziel dieser Clearing-Technik ist es, eine Gewebe-Clearing-Methode für das Rattengehirn zu etablieren. Dieses Protokoll kann auch für die HIV-1-transgene Ratte verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Hirngewebe der Ratte für die Reinigung intakt gelassen werden kann, was eine vollständige Analyse auf Schaltkreisebene ermöglicht.

Kristin Kirchner, eine Doktorandin aus meinem Labor, und auch Hailong Li, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Nachdem Sie eine transkardiale Perfusion bei einer drei bis sechs Wochen alten Ratte durchgeführt haben, entfernen Sie das Gehirn mit einer Zange aus dem Schädel. Platzieren Sie es dann in einer sagittalen Position und schneiden Sie es mit einer Rasierklinge und einer Rattenhirnmatrix in vier gleich drei Millimeter breite Abschnitte.

Fixieren Sie jeden Abschnitt mit vier Prozent PFA in einem versiegelten Fünf-Milliliter-Plastikröhrchen über Nacht auf einem Schüttler bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag setzen Sie die Fixierung bei Raumtemperatur eine Stunde lang fort. Waschen Sie jeden Abschnitt dreimal etwa 30 Minuten lang pro Waschgang mit PBS.

Inkubieren Sie die gewaschenen Abschnitte seriell jeweils eine Stunde lang in 20-, 40-, 60-, 80- und 100%iger Methanollösung. Wiederholen Sie die Dehydrierung mit 100%Methanol. Anschließend werden die Proben in 100%igem Methanol bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang gekühlt.

Eine Lösung mit 66 % DCM und 33 % Methanol wird hergestellt und die gekühlten Teile in dieser Lösung über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Waschen Sie die Probe am nächsten Tag zweimal 30 Minuten lang mit Methanol und kühlen Sie sie 10 Minuten lang in 100 % Methanol bei vier Grad Celsius. Zum Bleichen legen Sie die Probe in frisches fünfprozentiges Wasserstoffperoxid in Methanol und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius.

Nach der Inkubation über Nacht inkubieren Sie die Probe seriell in 80-, 60-, 40- und 20%igen Methanollösungen für jeweils eine Stunde bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie dann die Probe eine Stunde lang in PBS und waschen Sie sie zweimal in Lösung, einmal eine Stunde lang pro Waschgang. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 2,5 Mikrolitern einem Prozent Biotin-CTB und injizieren Sie es langsam über 20 Sekunden in die Stelle des Nucleus accumbens.

Lassen Sie die Nadelspitze eine Minute lang an Ort und Stelle und entfernen Sie sie langsam über 10 Sekunden, um ein Auslaufen zu vermeiden. Inkubieren Sie die Probe in Lösung drei und dann Lösung vier für jeweils zwei Tage in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Fügen Sie dann den primären Antikörper hinzu und setzen Sie die Inkubation sieben Tage lang fort.

Waschen Sie die Probe fünfmal eine Stunde lang pro Waschgang in Lösung zwei und lagern Sie sie über Nacht in Lösung zwei bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie die Probe mit einem Sekundärantikörper sieben Tage lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Zum Schluss waschen Sie es eine Stunde lang pro Waschgang fünfmal in Lösung zwei und lagern Sie es in Lösung zwei bei Raumtemperatur über Nacht bei schwachem Licht.

Inkubieren Sie die Probe seriell in 20, 40, 60, 80 und 100 % Methanol für jeweils eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann über Nacht in frischem 100%igen Methanol inkubieren. Am nächsten Tag wird die Probe in frisch zubereiteten 66 % DCM in 33 % Methanol drei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert.

Nach drei Stunden wird die Probe in Dibenzylether ohne Schütteln inkubiert, bis sie klar ist. Bewahren Sie es dann bis zur Bildgebung in Dibenzylether auf. Besorgen Sie sich eine 3D-Druckerkammer und befestigen Sie sie mit Epoxidharz an einem Objektträger.

Legen Sie die Probe in den quadratischen Raum in der Mitte der Kammer und füllen Sie die Kammer vollständig mit Dibenzylether. Legen Sie einen 0,17 Millimeter dicken Deckslip über die Kammer und üben Sie Druck aus, um sicherzustellen, dass er in vollem Kontakt mit den Kammerwänden steht. Anschließend versiegeln Sie die Ränder mit Epoxidharz.

Achten Sie darauf, die Kammer zu drehen, damit Luftblasen aus dem Einfüllstutzen entweichen können. Füllen Sie die Kammer mit zusätzlichem Dibenzylether. Anschließend den Einfülleinlauf mit Epoxidharz verschließen und aushärten lassen.

Beobachten Sie die Probe mit einem konfokalen Mikroskopsystem, um einen Z-Scan mit vierfacher Vergrößerung durchzuführen. Das konfokale Bild einer hydrophob geklärten Gewebeprobe bei vierfacher Vergrößerung zeigt eine dichte TH-Färbung im Bereich der Substantia nigra, spärliche TH-Neuronen neben der Substantia nigra und einen dunkelschwarzen Bereich des Gewebes ohne TH-Neuronen. Die typische Morphologie eines TH-positiven Neurons bei 20-facher Vergrößerung weist ein großes Soma und mehrere Verzweigungsfortsätze auf.

Während IBA1-gefärbte Mikroglia kleine Zellkörper und kürzere Verlängerungsprozesse aufweisen. Das ideale konfokale Bild zeigt eine positive und dichte TH-Färbung im Bereich der Substantia nigra mit geeigneter Fluoreszenzverstärkung. Beispiele für schlechte konfokale Bilder sind ein falsch fokussiertes Bild mit zu viel Fluoreszenzgewinn, eine falsch positive Färbung mit hellen Flecken, die nicht mit dem Rest des Gewebes übereinstimmen, und eine hohe Hintergrundfärbung als Folge der Verwendung eines blockierenden Serums, das nicht mit einem Sekundärantikörper übereinstimmt.

Hier ist eine positive CTB-Färbung im Rattengehirn dargestellt. Die langen, dünnen Fasern sind afferente Projektionen entlang des dopaminergen Signalwegs. Die Kolokalisation von TH und CTB ermöglicht es, die Injektionsstelle im Bereich des Nucleus accumbens sichtbar zu machen, die als dicht fluoreszierender grüner Kreis erscheint.

Kolokalisation von TH und CTB in der Substantia nigra ist hier dargestellt. Die wichtigsten Dinge, die Sie bei diesem Verfahren beachten sollten, sind, dass die Probe genügend Zeit hat, in allen Antikörperlösungen zu inkubieren, und genügend Zeit, um sich vor der Bildgebung vollständig zu reinigen. Die Probe sollte nur begrenzt mit Luft in Berührung kommen, da dies die Probe beschädigen kann.

Diese Technik ist sehr vielseitig und kann verwendet werden, um viele verschiedene interessante Proteine in verschiedenen Regionen des Gehirns zu untersuchen. Die vorliegende Technik ebnet den Neurowissenschaftlern den Weg, das Gehirn von Ratten auf der Ebene der Schaltkreise zu untersuchen, was für die Erforschung des Gehirns als Gesamtsystem unerlässlich ist.