Name: Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Hirnmikrogefäßen aus Rattenhirn für biochemische Studien zur Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht hochwertige Proteinanalysen von Einzeltieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01-NS084941) und die Arizona biomedizinische Forschungskommission (ADHS16-162406), PTR. WA erhielt vorbei an Unterstützung von Pre-doc Termin für eine nationale Institute der Gesundheit Ausbildung Grant (T32-HL007249).

Alle unten beschriebene Verfahren durch eine institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden und entsprechen den National Institutes of Health (NIH) und Animal Research: In Vivo Experimente (Ankunft) Richtlinien zum Berichten. Der verfahrenstechnische Ablauf für das Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Set-up für das Verfahren
<ol><li>Bereiten Sie den Gehirn kapilläre Puffer (BMB). Starten Sie durch mit einem Gewicht von 54,66 g D-Mannit, 1,90 g EGTA und 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (d. h. Tris) Basis in ein sauberes Becherglas. 1,0 L entionisiertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie die Komponenten des Puffers BMB mit einem Magnetrührer. Sobald die Lösung gründlich vermischt worden ist, passen Sie den pH auf 7,4 mit 1,0 M HCl.</li>
	<li>Bereiten Sie 26 % Dextran (75.000 MW) Lösung (w/V) vor der Tiere zu betäuben. Bereiten Sie die Dextran-Lösung, wie in den folgenden Schritten beschrieben. Hinweis: Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Lösung vor der Zeit vorzubereiten, da Dextran aufzulösen in wässrigen Puffer ca. 1,5-2 h dauern kann.<ol>
<li>Die pulverförmigen Dextran (26 g pro 100 mL Puffer) in ein sauberes Becherglas abwiegen.</li>
		<li>Das entsprechende Volumen der BMB abmessen und in eine separate, sauberes Becherglas zu verzichten.</li>
		<li>Gießen Sie langsam BMB in das Becherglas mit pulverförmigen Dextran. Manuell mischen Sie die pulverisierte Dextran in Gießen von BMB mit einem Glasstab umrühren.</li>
		<li>Anpassen des pH-Werts 7,4 mit 1,0 M HCl unmittelbar vor, zu verwenden. Hinweis: Eine typische Isolation des Gehirns mikrogefäßen aus 12 einzelnen Sprague-Dawley Ratten (männlich oder weiblich; 3 Monate alt, 200-250 g) 200 mL Dextran-Lösung (d. h. 52 g Dextran in 200 mL BMB) erfordert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Gewinnung von Hirngewebe aus Sprague-Dawley Ratten
<ol><li>Nach der gewünschten experimentelle Behandlung betäuben Sprague-Dawley Ratten mit Ketamin (50 mg/kg; 2,5 mL/kg kg i.p.) und Xylazin (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Verdünnen Sie Ketamin und Xylazin in 0,9 % Kochsalzlösung zur endgültigen Konzentrationen von 20 mg/mL und 4,0 mg/mL bzw.. Einschläfern von Tieren durch Enthauptung mit einem geschärften Guillotine nach IACUC Richtlinien. Verwenden Sie das gleiche Verfahren für sowohl weibliche als auch männliche Sprague-Dawley Ratten.</li>
	<li>Resezieren Sie die Haut von der Ratte-Schädel mit einem quer-Schnitt mit einer chirurgischen Schere.</li>
	<li>Mit Rongeurs, sorgfältig entfernen Sie die schädelplatte und setzen Sie des Gehirns aus.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn mit einem Spachtel. Lösen Sie das Großhirn und legen Sie das isolierte Hirngewebe in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL der BMB. Fügen Sie 1,0 μL der Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer unmittelbar vor Gebrauch.</li>
</ol>(3) Gehirn Verarbeitung
<ol><li>Übertragen Sie das Hirngewebe aus dem 50 mL konische Röhrchen auf eine saubere Petrischale.</li>
	<li>Rollen Sie mit Pinzette, vorsichtig das Gehirn auf 12,5 cm Durchmesser Filterpapier äußeren Hirnhaut zu entfernen, die Lose der Großhirnrinde eingehalten werden. Sanft drücken Sie das Hirngewebe gegen Filterpapier und Rollen Sie das Gewebe wieder. Schalten Sie das Filterpapier häufig während dieser Schritt.</li>
	<li>Der zerebralen Hemisphären mit Pinzette trennen Sie choroid Plexus. Hinweis: Das choroid Plexus erscheint als eine klare häutigen Gewebe an die Oberfläche der zerebralen Ventrikel lokalisiert.</li>
	<li>Sanft glätten Sie das Hirngewebe und entfernen Sie verbleibenden Meningen und olfaktorischen Birnen mit Pinzette.</li>
	<li>Legen Sie die kortikalen Hirngewebe in ein gekühltes Glas-Mörtel. Der Mörtel 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen.</li>
	<li>Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie das Hirngewebe mit 15 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.700 u/min. Führen Sie Homogenisierung mit 10 mL Mörser und Stößel-Gewebe-Mahlwerk. Zwischen jeder einzelnen Probe Homogenisierung reinigen Sie die Stößel mit 70 % Ethanol. Hinweis: Homogenisierung Striche in Bezug auf Tempo entsprechen müssen und Größenordnung.</li>
	<li>Gießen Sie das Homogenat in beschrifteten Zentrifuge Röhren.</li>
</ol>4. Zentrifugation Schritte
<ol><li>Jede beschriftete Zentrifugenröhrchen mit Gehirn Homogenat fügen Sie 8,0 mL 26 % Dextran-Lösung hinzu.</li>
	<li>Invertieren die Röhre zweimal und dann gründlich Wirbel der Probe. Führen Sie den Vortexen jeder Probe mit mehreren Winkeln, gewährleisten eine gute Durchmischung des Gehirns Homogenat Lösung mit 26 % Dextran-Lösung.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C. Hinweis: Für einige Analysen ist es sinnvoll, Gehirn mikrogefäßen mit in Anwesenheit von vergleichen. Die Beurteilung der Proteinexpression in Anwesenheit von sein sollte kann erforderlich, überstand aus dieser Zentrifugationsschritt (z. B. Gehirn parenchymatösen Bruch) werden gesammelt und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand mit einer Vakuum-Sauger und Glas Pasteurpipette. Hinweis: Vorsicht muss genommen werden, um die Pellets nicht zu stören. Andernfalls wird Menge an das Gehirn mikrogefäßen gesammelt die verringert deutlich der Proteinausbeute aus diesem Verfahren reduziert werden.</li>
	<li>Das Pellet in 5,0 mL BMB enthaltenden Proteaseinhibitor cocktail (d. h. 1,0 μl Protease-Inhibitor cocktail pro 1,0 mL BMB Puffer) aufzuwirbeln. Wirbel der Pellet um gute Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	<li>8,0 mL 26 % Dextran hinzu kommen jedem Zentrifugenröhrchen und Wirbel wie 4.1-4.2 dieses Protokolls beschrieben.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 5.000 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Mit einer Thermoskanne und Glaspipette, Aspirieren überstand und stellen Sie sicher, dass Pellet mit Gehirn kapilläre nicht gestört wird. Hinweis: Überschüssige Material, das an der Rohrwand gehalten hat mikrogefäßen nicht enthalten und sollten sorgfältig gereinigt und entfernt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritte 4,5 bis 4,8 eine zusätzliche zwei Mal.</li>
	<li>Einmal 4 Dextran Zentrifugation Schritte abgeschlossen wurden, 5,0 mL BMB zu jeder Pellet und Wirbel um die Probe erneut hinzufügen. Hinweis: Nach Abschluss von Schritt 4.10, können ganze mikrogefäßen für Analyse von Protein-Lokalisierung gesammelt werden. Dies kann erreicht werden, indem man eine 50 μL aliquoten neu suspendierten kapilläre Pellet und Verschmieren auf einen Glas-Objektträger. Mikrogefäßen sind dann Hitze fixiert, bei 95 ° C für 10 min auf einem Heizblock gefolgt von Fixierung in eiskaltem Ethanol für eine zusätzliche 10 min. Rutschen dann bei 4 ° C bis zur bildgebenden Verfahren erforderlich gespeichert werden können.</li>
</ol>5. Ultrazentrifugation, Proben von insgesamt mikrovaskuläre Hirnhäute vorzubereiten
<ol><li>Übertragen Sie Proben auf den gekühlten Glas-Homogenisator.</li>
	<li>Mit einer Oberleitung Homogenisator, Homogenisieren Sie Hirngewebe mit 8-10 nach oben und unten Schlaganfälle bei 3.000 u/min. Homogenisierung erfolgt mittels einer 10 mL-Mörser und Stößel Gewebe-Schleifmaschine. Reinigen Sie den Stößel mit 70 % Ethanol nach Homogenisierung jeder einzelnen Probe.</li>
	<li>Übertragen Sie Proben Ultrazentrifugen Rohre zu reinigen. Nummer und wiegen jedes einzelne Rohr. Auszugleichen und die Rohre vor der Verladung in den Ultrazentrifugen Rotor zu koppeln. Hinweis: Alle wiegen und Paarung von Ultrazentrifugen Rohre müssen mit den Kappen auf durchgeführt werden um genaue Messung der Röhre Gewichte zu gewährleisten.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 150.000 X g für 1 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Mit einer Thermoskanne und Glas Pasteurpipette, Aspirieren überstand mit sorgen die Kapillare Membran Pellet zu stören.</li>
	<li>Basierend auf der Größe der Pellets, fügen Sie eine entsprechende Volumen der Puffer speichern, die im Verhältnis 1:1 (V/V) von entionisiertem Wasser und BMB besteht. Pellets sind in der Regel in 400-500 μL der Puffer speichern Nukleinsäuretablette. Der Speicher-Puffer in einem Verhältnis von 1,0 μl pro 1,0 mL Puffer speichern Protease Inhibitor Cocktail hinzufügen.</li>
	<li>Vortex Proben zu Pellets im Puffer speichern aufzuwirbeln.</li>
	<li>Mit ein Glas Pasteurpipette übertragen Sie Kapillare Membran Proben zu einem beschrifteten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Pass-Probe durch eine Nadel Spritze 5 X, damit die Probe gut durchmischt ist und keine zelluläre Aggregate vorhanden sind.</li>
	<li>Speichern Sie die Proben bei-80 ° C bis zur Analyse erforderlich. Hinweis: Proteingehalt der Samples kapilläre Membran bemisst sich nach der Methode von Bradford.</li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Transporters+in+Central+Nervous+System+Drug+Delivery+and+Blood-Brain+Barrier+Protection%3A+Relevance+to+Treatment+of+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cent+Nerv+Syst+Dis%22%5BJournal%5D)">Role of Transporters in Central Nervous System Drug Delivery and Blood-Brain Barrier Protection: Relevance to Treatment of Stroke.</a> J Cent Nerv Syst Dis. 9, 1179573517693802(2017).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+transporters%3A+promoting+blood-brain+barrier+repair+in+response+to+oxidative+stress+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting transporters: promoting blood-brain barrier repair in response to oxidative stress injury.</a> Brain Res. 1623, 39-52 (2015).</li>
<li>Witt, K. A., Mark, K. S., Hom, S., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypoxia-reoxygenation+on+rat+blood-brain+barrier+permeability+and+tight+junctional+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of hypoxia-reoxygenation on rat blood-brain barrier permeability and tight junctional protein expression.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285 (6), H2820-H2831 (2003).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+oligomeric+assemblies+at+tight+junctions+of+the+blood-brain+barrier+are+altered+by+hypoxia+and+reoxygenation+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Occludin oligomeric assemblies at tight junctions of the blood-brain barrier are altered by hypoxia and reoxygenation stress.</a> J Neurochem. 110 (1), 58-71 (2009).</li>
<li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li>
<li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li>
<li>Campos, C. R., Ocheltree, S. M., Hom, S., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+inhibition+prevents+inflammatory+pain+induced+changes+in+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Nociceptive inhibition prevents inflammatory pain induced changes in the blood-brain barrier.</a> Brain Res. , 6-13 (2008).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+alters+substrate+permeability+and+tight+junction+protein+expression+at+the+blood-brain+barrier+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).</li>
<li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain%3A+a+role+for+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Finch, J. D., Demarco, K. M., Quigley, C. E., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+pain+signals+an+increase+in+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammatory pain signals an increase in functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier.</a> J Pharmacol Exp Ther. 336 (3), 827-839 (2011).</li>
<li>Pop, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+brain+injury+alters+the+blood-brain+barrier+phenotype+in+parallel+with+beta-amyloid+and+cognitive+changes+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Early brain injury alters the blood-brain barrier phenotype in parallel with beta-amyloid and cognitive changes in adulthood.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33 (2), 205-214 (2013).</li>
<li>Thompson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stress+signals+an+increase+in+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+%28Oatp1a4%29+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+to+CNS+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stress signals an increase in organic anion transporting polypeptide 1a4 (Oatp1a4) at the blood-brain barrier: relevance to CNS drug delivery.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 699-707 (2014).</li>
<li>Tome, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-glycoprotein+traffics+from+the+nucleus+to+the+plasma+membrane+in+rat+brain+endothelium+during+inflammatory+pain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">P-glycoprotein traffics from the nucleus to the plasma membrane in rat brain endothelium during inflammatory pain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1913-1928 (2016).</li>
<li>Slosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetaminophen+modulates+P-glycoprotein+functional+expression+at+the+blood-brain+barrier+by+a+constitutive+androstane+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Acetaminophen modulates P-glycoprotein functional expression at the blood-brain barrier by a constitutive androstane receptor-dependent mechanism.</a> Mol Pharmacol. 84 (5), 774-786 (2013).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+exposure+to+ethanol+downregulates+tight+junction+proteins+through+the+protein+kinase+Calpha+signaling+pathway+in+human+cerebral+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term exposure to ethanol downregulates tight junction proteins through the protein kinase Calpha signaling pathway in human cerebral microvascular endothelial cells.</a> Exp Ther Med. 14 (5), 4789-4796 (2017).</li>
<li>Abdullahi, W., Brzica, H., Ibbotson, K., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-9+increases+the+functional+expression+of+organic+anion+transporting+polypeptide+1a4+at+the+blood-brain+barrier+via+the+activin+receptor-like+kinase-1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-9 increases the functional expression of organic anion transporting polypeptide 1a4 at the blood-brain barrier via the activin receptor-like kinase-1 receptor.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 37 (7), 2340-2345 (2017).</li>
<li>Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+1-Phosphate+Increases+P-Glycoprotein+Transport+Activity+at+the+Blood-Brain+Barrier+via+Prostaglandin+E2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling.</a> Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).</li>
<li>Betz, A. L., Csejtey, J., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexose+transport+and+phosphorylation+by+capillaries+isolated+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hexose transport and phosphorylation by capillaries isolated from rat brain.</a> Am J Physiol. 236 (1), C96-C102 (1979).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. M., Decleves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Res. 1134 (1), 1-11 (2007).</li>
<li>McCaffrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+contain+oligomeric+protein+assembly+critical+for+maintaining+blood-brain+barrier+integrity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Tight junctions contain oligomeric protein assembly critical for maintaining blood-brain barrier integrity in vivo.</a> J Neurochem. 103 (6), 2540-2555 (2007).</li>
<li>Brzica, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+and+kidney+expression+of+sulfate+anion+transporter+sat-1+in+rats+exhibits+male-dominant+gender+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The liver and kidney expression of sulfate anion transporter sat-1 in rats exhibits male-dominant gender differences.</a> Pflugers Arch. 457 (6), 1381-1392 (2009).</li>
<li>Ronaldson, P. T., Bendayan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+viral+envelope+glycoprotein+gp120+produces+oxidative+stress+and+regulates+the+functional+expression+of+multidrug+resistance+protein-1+%28Mrp1%29+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HIV-1 viral envelope glycoprotein gp120 produces oxidative stress and regulates the functional expression of multidrug resistance protein-1 (Mrp1) in glial cells.</a> J Neurochem. 106 (3), 1298-1313 (2008).</li>
<li>Pustylnikov, S., Sagar, D., Jain, P., Khan, Z. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+C-type+lectins-mediated+host-pathogen+interactions+with+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting the C-type lectins-mediated host-pathogen interactions with dextran.</a> J Pharm Pharm Sci. 17 (3), 371-392 (2014).</li>
<li>Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+maintenance+and+disruption+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier.</a> Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).</li>
<li>Abdullahi, W., Davis, T. P., Ronaldson, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+P-glycoprotein+and+Organic+Anion+Transporting+Polypeptides+at+the+Blood-Brain+Barrier%3A+Understanding+Transport+Mechanisms+for+Improved+CNS+Drug+Delivery%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+J%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of P-glycoprotein and Organic Anion Transporting Polypeptides at the Blood-Brain Barrier: Understanding Transport Mechanisms for Improved CNS Drug Delivery?</a> AAPS J. 19 (4), 931-939 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel wird eine einfache und effektive Methode der Membrane Protein Probenvorbereitung von mikrogefäßen frisch von Ratte Gehirngewebe isoliert beschrieben. In der Literatur13,20,21,22 wurden mehrere Ansätze zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen oder Generierung von Membran-Zubereitungen aus isolierten Microvasculature gemeldet. , 24. zwar di...

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist an der Schnittstelle zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und die systemische Zirkulation vorhanden und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns. Insbesondere die BBB-Funktionen, um präzise Kontrolle gelösten Konzentrationen im Gehirn extrazellulären Flüssigkeit und effizient diese Nährstoffe liefern, die von Hirngewebe benötigt werden, um die erheblichen metabolischen Anforderungen der CNS1zu erfüllen. Diese Rollen implizieren, dass die BBB, die in erster Linie auf der Ebene der mikrovaskuläre Endothelzellen existiert, diskrete Mechanismen besitzen muss, die es einige Substanzen in Anwesenheit von ermöglichen gleichzeitig sicherstellen, dass potenziell schädliche XENOBIOTIKA können nicht zugreifen akkumulieren. In der Tat Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen sind nicht gefenstert und begrenzten Pinozytose, sorgt für einen Mangel an nicht-selektive Durchlässigkeit2weisen. Darüber hinaus äußern Gehirn kapilläre Endothelzellen engen Kreuzung und Adherens Junction Proteine, die handeln in Form eine körperlichen "Siegel" zwischen benachbarten endothelial Zellen und parazellulär Diffusion von Blut übertragbare Substanzen ins Gehirn stark einschränken Parenchym. In der Tat erfordert selektive Durchlässigkeit der endogene und exogene Stoffe funktionelle Expression von Aufnahme und Efflux-Transporter3. Insgesamt, engen Kreuzungen, Adherens Junctions und Transportern arbeiten gemeinsam, um die einzigartige Barriereeigenschaften der BBB zu pflegen.
Die BBB ist eine dynamische Barriere, die auf physiologischen, pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Z. B. Hypoxie/flussbettfilters Stress erwiesenermaßen modulieren Ausdruck der kritischen tight Junction-Proteine (z.B. occludin, Zonulae Occluden-1 (ZO-1)), die erhöhte parazellulär Durchlässigkeit für solche vaskuläre Marker zugeordnet ist als Saccharose4,5,6. Ähnliche Beobachtungen wurden an der BBB in der Umgebung von Schädel-Hirn-Verletzung-7 und peripheren entzündliche Schmerzen8,9. Diese gleichen Krankheiten können auch Transportmechanismen an der BBB10,11,12,13,14modulieren. In der Tat, Hypoxie/flussbettfilters Verletzungen verbessert funktionelle Expression von Bio Anion Transport Polypeptid 1a4 (Oatp1a4) an der BBB führen kann zu einem signifikanten Anstieg in der Blut-Hirn-Transport von bestimmten Oatp Transport Substrate wie Taurocholate und Atorvastatin13. BBB-Eigenschaften können auch durch Pharmakotherapie selbst, einen Mechanismus geändert werden, die eine Grundlage für beide tief greifende Veränderungen in der Wirksamkeit der Droge im Gehirn und Wechselwirkungen bilden können. Z.B. Paracetamol Ziele nuklearen Rezeptoren Signalisierung Mechanismen im Gehirn der mikrovaskuläre Endothelzellen, erhöht die funktionelle Expression der kritischen Efflux-Transporter P-Glykoprotein (P-Gp), und ändert zeitabhängige Analgesie Übertragen von Morphin, transportieren ein opioid-Analgetikum und etablierten P-Gp Substrat15. Ein gründliches Verständnis der BBB-Änderungen, die durch Krankheiten oder durch Drogen induziert werden kann, erfordert auch die Identifizierung und Charakterisierung der spezifischen regulatorischen Mechanismen, die diese Änderungen zu kontrollieren. In der Tat, diskrete Signalwege wurden im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen, die Steuern, die molekulare Ausdruck der engen Kreuzung Proteine16,17 und Transporter15, 18,19. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen, dass komplexe Molekulare Signalwege in der Verordnung von BBB tight Junctions und Transporter in Gesundheit und Krankheit beteiligt sind.
Eine große Herausforderung in der Studie der BBB ist die absolute Voraussetzung für eine einfache und effektive Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren und anschließende Aufbereitung der Membran Proben abgeleitet. Diese Proben müssen vorbereitet werden, so dass sie sowohl im Gehirn mikrovaskuläre Endothelzellen angereichert und in Anwesenheit von anderen Zelltypen begrenzt. In den vergangenen Jahren wurden mehrere Methoden zur Isolierung von Microvasculature von Nagetier Gehirn in der wissenschaftlichen Literatur13,20,21,22beschrieben. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, robuste, und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus rattengehirn und zur Vorbereitung von endothelialen Membran angereicherten Proben, die für die Analyse der Proteinexpression verwendet werden können. Vorteil dieses Protokolls kapilläre Isolierung ist die Fähigkeit, eine einzelne Versuchstier Probe Vorbereitungen von hoher Qualität und mit ausreichend Proteinausbeute einzuholen. Dies ermöglicht die Berücksichtigung der Inter Tier Variabilität der Proteinexpression. Solch ein Fortschritt in diesem Protokoll hat die Robustheit des BBB Studien erheblich verbessert, weil Überbewertung oder Unterbewertung das wahre Ausmaß der Protein Veränderungen an der BBB jetzt vermieden werden kann. Darüber hinaus ermöglicht die Aufnahme von mehreren Schritten der Zentrifugation mit Dextran verbesserte Anreicherung von mikrogefäßen im experimentellen Proben und erleichtert die Entfernung von unerwünschten zelluläre Bestandteile wie Neuronen.

<table><tbody><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P8340</td><td>Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#M4125</td><td>Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#E3889</td><td>Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T1503</td><td>Bestandteil des Mikrogefäßpuffers des Gehirns</td></tr><tr><td>Dextran (MW 75.000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>Dextran wird in Zentrifugationsschritten verwendet, um Mikrogefäße vom Hirnparenchym zu trennen</td></tr><tr><td>Zetamin</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>Allgemeinanästhetikum</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>Allgemeinanästhetikum</td></tr><tr><td>0,9% ige Kochsalzlösung</td><td>Western Medical Supply</td><td>N/A</td><td>Allgemeinanästhetikum </td></tr><tr><td>Verdünnungsmittel-Filterpapier (12,5 cm Durchmesser)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>Wird zur Entfernung von Hirnhäuten aus Hirngewebe</td></tr><tr><td>verwendet Zentrifugenröhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>Einwegröhrchen für Dextran-Zentrifugationsschritte</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Coomassie Plus (Bradford) Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>Messung der Proteinkonzentration in Membranpräparaten</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>Erforderlich für die Homogenisierung von Proben</td></tr><tr><td>10,0 ml Glasmörser und Stößel Tissue-Mühle</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#358039</td><td>Erforderlich für die Homogenisierung von</td></tr><tr><td>Proben Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>Erforderlich für die pH-Einstellung von Puffern</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Proteinstandard für Bradford Assay</td></tr><tr><td>Standard Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>Wird für die Dissektion von Hirngewebe</td></tr><tr><td>verwendet Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>Wird zum Öffnen des Schädels verwendet, um das Gehirn zu isolieren</td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>Wird zur Entnahme von Hirngewebe nach der Isolierung</td></tr> verwendet <tr><td>Glaspasteurpipetten</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>Wird zur Aspiration von Zelltrümmern nach Dextran-Spins verwendet</td></tr><tr><td>Ethanol, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>Wird zur Reinigung von Gewebeschleifmaschinen verwendet; auf 70% mit destilliertem Wasser</td></tr> <tr><td>verdünntUltrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>Wird für die Ultrazentrifugation von Proben verwendet</td></tr></tbody></table>

eine einfache und reproduzierbare methode, membran-proben von frisch isolierte ratte gehirn mikrogefäßen vorzubereiten

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische Barriere-Gewebe, die auf verschiedenen pathophysiologischen und pharmakologische Reize reagiert. Solche Veränderungen, die durch diese Reize können stark modulieren Drug-Delivery zum Gehirn und durch Verlängerung, erhebliche Herausforderungen bei der Behandlung des zentralen Nervensystems (ZNS) Krankheiten verursachen. Viele BBB-Veränderungen, die Pharmakotherapie, beeinflussen beinhalten Proteine, die lokalisiert und auf der Ebene der Endothelzellen ausgedrückt. In der Tat hat dieses Wissen über die Physiologie der BBB in Gesundheit und Krankheit erhebliches Interesse an der Erforschung dieser Membran Proteine ausgelöst. Aus Sicht der wissenschaftlichen Grundlagen-Forschung bedeutet dies eine Anforderung für eine einfache, aber robuste und reproduzierbare Methode zur Isolierung von mikrogefäßen aus Hirngewebe von Versuchstieren geerntet. Um Membran Proben aus frisch isolierte mikrogefäßen vorzubereiten, ist es wichtig, dass Probe Vorbereitungen in Endothelzellen bereichert aber in Gegenwart von anderen Zelltypen der Neurovaskuläre Einheit (z.B. Astrozyten, Mikroglia, Neuronen begrenzt, perizyten). Ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit, Proben von einzelnen Tieren vorzubereiten, um die wahre Variabilität der Proteinexpression in einer experimentellen Bevölkerung zu erfassen. In dieser Handschrift sind Einzelheiten über eine Methode, die verwendet wird für die Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und Vorbereitung der Membran-Proben zur Verfügung gestellt. Kapilläre Anreicherung von Proben abgeleitet, ist erreicht, indem vier Zentrifugation Schritte wo Dextran in den Probenpuffer aufgenommen. Dieses Protokoll kann leicht durch andere Labore für ihre eigenen spezifischen Anwendungen angepasst werden. Proben aus diesem Protokoll generiert wurden gezeigt, robuste Versuchsdaten aus Protein-Analyse Experimente liefern, die das Verständnis der BBB Reaktionen auf physiologische und pathophysiologische pharmakologische Reize sehr helfen können.

Der experimentelle Fluss zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Probenpräparation kapilläre Membran ist in Abbildung 1dargestellt. Bei der hier vorgestellten Verfahren erfolgreich Isolation intakt mikrogefäßen aus rattengehirn zeigt (Abbildung 2A). Diese Schiffe wurden nach Abschluss der Zentrifugation mit Dextran und unmittelbar vor Beginn der Ultrazentrifugation, Membran-Proben (d. h. nach Abschluss von Schrit...

Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zerebrale Mikrogefäße aus dem Rattengehirn für biochemische Studien zu isolieren, die darauf abzielen, die molekularen Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke von Säugetieren zu verstehen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der Physiologie der Blut-Hirn-Schranke und der Neuropharmakologie zu beantworten, wie z.B. die Regulation, Lokalisierung und Expression von Tight-Junction-Proteinen und endogenen Transportern in Gesundheit und Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir eine ausreichende Anzahl hochwertiger Mikrogefäße aus einem einzelnen Tier isolieren können, wobei die natürliche Variabilität der Proteinexpression zwischen den einzelnen Tieren berücksichtigt wird.Bianca Reilly, eine herausragende Studentin aus meinem Labor, wird diese Technik vorführen. Nachdem Sie eine Sprague-Dawley-Ratte gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert und geköpft haben, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut vom Rattenschädel zu entfernen, indem Sie einen einzigen Querschnitt machen. Entfernen Sie mit Rongeuren vorsichtig die Schädelplatte und legen Sie das Gehirn frei.Entfernen Sie dann mit einem Spate

a-simple-reproducible-method-to-prepare-membrane-samples-from-freshly

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Injizieren Sie intravenös Fluorophor-markiertes Albumin, das die geschädigte BHS durchquert und das Gehirn erreicht.

Vorbereitung von Schnitten des Rattenhirns für die elektronenmikroskopische Analyse der Integrität der Blut-Hirn-Schranke

Dieses Video zeigt die Isolierung von Mikrogefäßen aus einem Rattengehirn mit einer Kombination aus Dichtegradientenzentrifugation und enzymatischen Verdauungsmethoden. Die isolierten Mikrogefäße können in einem Kulturkolben kultiviert werden, der mit Kollagen- und Fibronektinmatrix vorbeschichtet ist, um Endothelzellkolonien zu erhalten.

Endothelzellkultur aus Mikrogefäßen des Rattengehirns: Ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus Mikrogefäßen des Rattengehirns

Dieses Video zeigt die Isolierung intakter Gefäße aus dem Gehirn einer Maus, die zusammen mit Neuronen und Gliazellen die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bilden. Die isolierten Gefäße können als In-vitro-Modell verwendet werden, um ihre Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns zu untersuchen.

Isolierung von Hirngefäßen von Mäusen: Ein Protokoll zur Isolierung intakter Gefäße aus einer Gehirnprobe von Mäusen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen. Dabei werden Mikroglia von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen mit Hilfe von Platten getrennt, die mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet sind, der spezifisch für Mikroglia ist.

Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

Dieses Video zeigt den Prozess der Isolierung von Gehirn-Mikrogefäßen von euthanasierten Ratten. Es umfasst die Dissektion des Gehirns, die Reinigung des Gewebes und die mechanische Verdauung, gefolgt von einer wiederholten Zentrifugation, um die reine Fraktion der Mikrogefäße zu isolieren.

Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

Dieses Video zeigt die Dissoziation von gefrorenem Rattenhirngewebe in eine einzellige Suspension durch enzymatische Verdauung und mechanische Verreibung. Die präparierten Zellen werden fixiert und mit Ethanol für nachgelagerte Anwendungen wie Durchflusszytometrie oder Genexpressionsanalyse permeabilisiert.

Gewinnung einer Einzelzellsuspension aus gefrorenem Hirngewebe von Ratten

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Wir beschreiben ein Protokoll, das die Reinigung des Gefäßkompartiments des Mäusegehirns ermöglicht. Zu den isolierten Hirngefäßen gehören Endothelzellen, die durch Tight Junctions verbunden und von einer durchgehenden Basallamina umgeben sind, Perizyten, vaskuläre glatte Muskelzellen sowie perivaskuläre Astrogliamembranen.

Reinigung von Maus-Hirngefäße

Hier demonstriert werden Protokolle zur intakten zerebralen Endothelzellen "Röhren" und (2) die gleichzeitige Messung von endothelialen Kalzium und Membranpotential im Endothel-derived Hyperpolarisation (1) frisch zu isolieren. Des weiteren können diese Methoden für die pharmakologische Optimierung von Endothelzellen Kalzium und elektrische Signalisierung als Einzel- oder interaktive experimentellen Variablen.

Gleichzeitige Messung von intrazellulären Calcium und Membrane Potential in frisch isolierte und intakte Maus zerebralen Endothel

Wir beschreiben Verfahren zur Verarbeitung von Neugeborenen-Ratten-Hirngewebe, um hochauflösende Elektronenmikrogramme für die morphometrische Analyse der synaptischen Vesikelverteilung an Nerventerminals zu erhalten. Die mit diesen Methoden gewonnenen Mikrographen können auch verwendet werden, um die Morphologie einer Reihe anderer zellulärer Komponenten und deren dimensionale strukturelle Zusammenhänge zu untersuchen.

Vorbereitung des Neugeborenen Ratsprofels für die ultrastrukturelle Morphometrische Analyse der Verbreitung synaptischer Bläschen an Nerven-Terminals

Wir präsentieren ein Protokoll zur Extraktion von murinen hirnebralen Pericyten. Basierend auf einer antibiotikafreien Anreicherungs-orientierten Pericyt-Extraktion ist dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug für In-vitro-Studien, die eine hohe Reinheit und hohe Ausbeute bieten und somit die Anzahl der verwendeten Versuchstiere verringern.

Eine High Output-Methode zum Isolieren von zerebralen Pericyten von der Maus

Lernen Sie die Isolierung von Hirnmikrogefäßen aus Rattenhirn für biochemische Studien zur Blut-Hirn-Schranke. Diese Methode ermöglicht hochwertige Proteinanalysen von Einzeltieren.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

Weitere Videos entdecken