Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten
7. Mai 2018
Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zerebrale Mikrogefäße aus dem Rattengehirn für biochemische Studien zu isolieren, die darauf abzielen, die molekularen Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke von Säugetieren zu verstehen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen der Physiologie der Blut-Hirn-Schranke und der Neuropharmakologie zu beantworten, wie z.B. die Regulation, Lokalisierung und Expression von Tight-Junction-Proteinen und endogenen Transportern in Gesundheit und Krankheit. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir eine ausreichende Anzahl hochwertiger Mikrogefäße aus einem einzelnen Tier isolieren können, wobei die natürliche Variabilität der Proteinexpression zwischen den einzelnen Tieren berücksichtigt wird.
Bianca Reilly, eine herausragende Studentin aus meinem Labor, wird diese Technik vorführen. Nachdem Sie eine Sprague-Dawley-Ratte gemäß dem Textprotokoll eingeschläfert und geköpft haben, verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut vom Rattenschädel zu entfernen, indem Sie einen einzigen Querschnitt machen. Entfernen Sie mit Rongeuren vorsichtig die Schädelplatte und legen Sie das Gehirn frei.
Entfernen Sie dann mit einem Spatel das Organ. Lösen Sie das Großhirn und geben Sie das isolierte Hirngewebe in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern BMB und 5,0 Mikrolitern Proteasehemmer-Cocktail. Um das Gewebe zu verarbeiten, geben Sie es in eine saubere Petrischale.
Rollen Sie dann das Gehirn mit einer Pinzette vorsichtig auf ein Filterpapier mit einem Durchmesser von 12,5 Zentimetern, um die äußeren Hirnhäute zu entfernen, die lose an der Großhirnrinde befestigt sind. Während dieses Schritts sollte darauf geachtet werden, dass das gesamte Hirnhautgewebe aus der Hirngewebeprobe entfernt wurde. Die Hirnhäute können als klares membranöses Gewebe dargestellt werden, das sich leicht vom Hirngewebe abziehen lässt.
Drücken Sie das Gehirngewebe vorsichtig gegen das Filterpapier und rollen Sie das Taschentuch erneut, wobei Sie das Filterpapier während dieses Schritts häufig wenden. Trennen Sie dann mit einer Pinzette den Plexus choroideus von den Gehirnhälften. Glätten Sie dann das Hirngewebe wieder vorsichtig und entfernen Sie mit einer Pinzette die Riechkolben, die an die weiße Substanz angrenzen.
Legen Sie das kortikale Hirngewebe in einen gekühlten Glasmörser. Fügen Sie dann fünf Milliliter BMB mit Proteasehemmer-Cocktail hinzu. Führen Sie mit einem Überkopf-Homogenisator einen Stößel in den Mörser ein und homogenisieren Sie das Hirngewebe mit 15 Auf- und Abbewegungen bei 3.700 U/min.
Gießen Sie dann das Homogenat in beschriftete Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie zwischen den Proben 70 % Ethanol, um den Stößel zu reinigen. Um die Zentrifugation durchzuführen, geben Sie 8,0 Milliliter 26%ige Dextranlösung in jedes markierte Zentrifugenröhrchen, das das Gehirnhomogenat enthält.
Drehen Sie das Röhrchen zweimal um und wirbeln Sie die Probe dann gründlich ein. Führen Sie das Vortexen jeder Probe aus mehreren Winkeln durch, um ein gründliches Mischen der Gehirnhomogenatlösung mit 26%iger Dextranlösung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 g und vier Grad Celsius für 15 Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5,0 Millilitern BMB mit Proteasehemmer-Cocktail. Wirbeln Sie dann das Pellet vortexen, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Geben Sie anschließend 8,0 Milliliter 26%iges Dextran in jedes Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es wie gerade gezeigt auf.
Zentrifugieren Sie die Proben dann erneut. Aspirieren Sie den Überstand mit einer Isolierflasche und einer Glaspipette und stellen Sie sicher, dass das Pellet, das das Mikrogefäß des Gehirns enthält, nicht gestört wird. Resuspendieren Sie das Pellet in BMB mit Proteaseinhibitor und dann zwei weitere Male mit 26%Dextran.
Nach der abschließenden Zentrifugation geben Sie 5,0 Milliliter BMB zu jedem Pellet und Vortex, um die Probe wieder zu suspendieren. Unter Verwendung des in diesem Video gezeigten Protokolls wurde die erfolgreiche Isolierung intakter Mikrogefäße aus dem Rattengehirn durchgeführt. In diesem Bild wird das Mikrogefäß mit einem Antikörper gegen Oatp1a4 gefärbt, einen Transporter, der an der Plasmamembran von mikrovaskulären Endothelzellen des Gehirns gut exprimiert wird.
Wie der Western Blot zeigte, waren Membranpräparate aus Mikrogefäßen, die von weiblichen Sprague-Dawley-Ratten entnommen wurden, mit PECAM-1, auch bekannt als CD31, angereichert, einem Markerprotein für Mikrogefäße des Gehirns. Bei der Optimierung dieses Protokolls wurde eine PECAM-Anreicherung in Membranproben beobachtet, die mit zwei und vier Dextran-Zentrifugationsschritten hergestellt wurden. Wie durch den Bradford-Protein-Assay bestimmt und in dieser Tabelle aufgeführt, ergeben Membranpräparate typischerweise Proteinkonzentrationen zwischen 5,0 Milligramm pro Milliliter und 10,0 Milligramm pro Milliliter.
Die Proteinwerte wurden auf Basis einer Standardkurve bestimmt, die mit BSA als Standard erstellt wurde. Hier ist ein Western Blot für das BHS-Transportprotein Glut1 zu sehen. Für dieses hochexprimierte BHS-Protein wurden in jeder Membranprobe klare Einzelbanden von 54 Kilodalton nachgewiesen.
Diese Grafik zeigt eine höhere Expression von Glut1 an der BHS bei männlichen im Vergleich zu weiblichen Ratten. Es wurde kein Unterschied in der Expression der Natrium/Kalium-ATPase zwischen männlichen und weiblichen Tieren beobachtet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis 2 1/2 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, alle Proben während des gesamten Protokolls auf Eis zu halten und beim Aspirieren des Überstands aus dem Mikrogefäßpellet nach den Zentrifugationsschritten vorsichtig zu sein. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Co-Immunpräzipitationsanalyse, an Mikrogefäßproben durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Assoziation verschiedener Proteine innerhalb desselben Proteinkomplexes an der Blut-Hirn-Schranke. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Physiologie der Blut-Hirn-Schranke und der Neuropharmakologie, um die molekularen Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke in der Gesundheit und in Nagetiermodellen für neurologische Erkrankungen zu erforschen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie hochwertige Mikrogefäße aus dem Rattenhirn für Ihre eigenen Studien zur Biologie der Blut-Hirn-Schranke bei Gesundheit und Krankheit isolieren können.
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Übersicht
Diese Studie präsentiert ein Protokoll zur Isolierung von Mikrogefäßen aus Rattengehirnen zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranke (BBB). Die Methode ermöglicht hochwertige Proteinanalysen von einzelnen Tieren und erleichtert die Untersuchung von Tight Junction Proteinen und Transportern im Zusammenhang mit Neuropharmakologie und Physiologie.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Proteinanalyse
- Physiologie der Blut-Hirn-Schranke
Hintergrund
- Die Blut-Hirn-Schranke spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des zentralen Nervensystems.
- Das Verständnis der molekularen Eigenschaften der BBB kann Studien zu neurologischen Erkrankungen unterstützen.
- Diese Methode berücksichtigt die Variabilität der Proteinexpression bei verschiedenen Ratten.
- Angereichte Mikrogefäßproben sind für die Weiterentwicklung der neuropharmakologischen Forschung unerlässlich.
Zweck der Studie
- Zur Isolierung zerebraler Mikrogefäße aus Rattengehirnen für biochemische Studien.
- Zur Analyse molekularer Komponenten, die mit der BBB unter verschiedenen physiologischen Bedingungen assoziiert sind.
- Zur Bewertung der Expression und Regulation spezifischer Proteine im Zusammenhang mit der BBB-Funktion.
Verwendete Methoden
- Die Hauptplattform umfasst chirurgische Techniken gefolgt von Homogenisierung und Zentrifugation von Hirngewebe.
- Das biologische Modell besteht aus Sprague-Dawley Ratten, was eine individuelle Analyse der Mikrogefäßeigenschaften ermöglicht.
- Es wurde kein Multiomics-Workflow erwähnt.
- Schlüsselschritte umfassen Geweberesektion, Homogenisierung und mehrere Zentrifugationszyklen zur Isolierung von Mikrogefäßen.
- Der Proteinertrag und die Reinigung werden durch Western Blotting und Bradford Protein Assays bewertet.
Hauptergebnisse
- Intakte Mikrogefäße wurden erfolgreich isoliert und auf Proteinexpression charakterisiert.
- Die Anreicherung von PECAM-1 (CD31) und Glut1 wurde in Mikrogefäßpräparationen bestätigt.
- Die Proteinkonzentrationen lagen nach dem Protokoll typischerweise zwischen 5 und 10 mg/mL.
- Ein bemerkenswerter Unterschied in der Glut1-Expression zwischen männlichen und weiblichen Ratten wurde beobachtet.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie bietet eine zuverlässige Methode zur Isolierung von Gehirnmikrogefäßen und ebnet den Weg für zukünftige Forschungen zur Blut-Hirn-Schranke.
- Das Protokoll verbessert das Verständnis der neuropharmakologischen Dynamik und der BBB-Physiologie.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können bessere therapeutische Ansätze für neurologische Erkrankungen unterstützen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating brain microvessels enables mechanistic de-risking of CNS drug targets by providing endothelial-enriched samples that reflect physiological variability. This method supports target validation and assay development for blood-brain barrier penetration studies, improving predictive confidence in lead identification. Reproducible membrane preparation from individual animals enhances translational biomarker alignment and portfolio triage in neuropharmacology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of endothelial-specific targets like transporters and tight junction proteins in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides reproducible microvessel isolation from individual rats to capture inter-animal variability in target expression.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing and biological de-risking of CNS targets prior to lead optimization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields membrane samples suitable for quantitative analysis of BBB protein expression and function.
- Operational Value: Delivers consistent protein yields (5–10 mg/mL) enabling standardized assay inputs for screening campaigns.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness for evaluating compound effects on endothelial targets in a scalable format.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by isolating microvessels from rodent models to study BBB responses to pharmacological stimuli.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation using matched biological systems.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by confirming target engagement at the BBB.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing endothelial-enriched samples for mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target confirmation through enrichment of microvascular markers like PECAM-1 and Glut1.
- Screening: Delivers reproducible samples with quantifiable protein outputs for compound screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables Western blot and Bradford assay readouts to compare protein expression across conditions and sexes.
- Translational Research: Connects to preclinical work by using rat brain microvessels as a disease-relevant system for BBB-targeted therapeutics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for multiple projects targeting CNS drug delivery and BBB modulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in BBB target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined centrifugation and dextran-based enrichment steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing endothelial-specific data that reduces late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated expression in brain microvessels.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and tissue handling to isolate cerebral microvessels without contamination.
- Needs access to homogenization equipment, centrifuges capable of 5,000 g at 4°C, and dextran preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample processing to maintain consistency in protein yield and purity.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other species or disease models beyond rat brain.
- Includes practical limitations such as the need to keep samples on ice and avoid pellet disruption during supernatant aspiration.
