Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Die Gradientenfixierungsmethode, bei der eine Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers durchgeführt wird, hilft dabei, Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu identifizieren, die vorübergehend an Komplexe aus mehreren Untereinheiten binden. Die Verwendung von Fixierungsreagenzien im Glyceringradienten stabilisiert die Bindung loser Faktoren ohne die Bildung von Ausfällungen und ermöglicht die Identifizierung der Wechselwirkungen spezifischer Proteine mit gespleißten Halbkomplexen. Die Demonstration des Endprotokolls hilft Erstbenutzern, Informationen zu lernen, die allein aus geschriebenem Text schwer zu verstehen sind.

Für die Herstellung des Hefe-Gesamtextrakts züchten Sie die Hefezellen, die einen der Spleißfaktoren exprimieren, die mit dem Zapfhahn-Tag fusioniert sind, und einen Liter Y- und B-Glukosemedium, ergänzt mit den entsprechenden Aminosäuren oder Nukleinbasen. Wenn die Kultur eine optische Dichte von 600 Nanometern erreicht, sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation in drei 500-Milliliter-Zentrifugenflaschen und waschen Sie die Zellen zweimal in 10 Millilitern kaltem, sterilem Wasser pro Waschgang. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Zellen in einem Zehntel des Zellvolumens des kalten Puffers A und frieren Sie 50 Mikroliter der Hefezellsuspension in flüssigem Stickstoff ein.

Nach dem Einfrieren mahlen Sie die gefrorenen Zellpellets drei Minuten lang in einer Kugelmühle durch sechs Zyklen bei 20 Hertz und tauchen Sie den Behälter mit den gefrorenen Zellen am Ende jedes Zyklus in flüssigen Stickstoff. Legen Sie nach dem letzten Zyklus die Röhrchen mit den Extrakten unter gelegentlichem Schütteln in Wasser bei Raumtemperatur. Nach dem Schmelzen zentrifugieren, um die Extrakte zu sammeln.

Und quantifizieren Sie das Protein, das die Überstände mit der BCA-Methode beseitigt haben. Anschließend die Aliquote der Extrakte in flüssigem Stickstoff für eine Lagerung bei minus 80 Grad Celsius schnell einfrieren. Um einen Glyceringradienten herzustellen, fügen Sie eine Endkonzentration des Vernetzungsmittels Glutaraldehyd von 0,1 % zu einer 30%igen Glycerin- und Puffer-A-Lösung hinzu und mischen Sie sie, um sie zu homogenisieren.

Geben Sie sechs Milliliter kalte 10%ige Glycerin- und Puffer-A-Lösung in ein 12-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine Gradienten-Master-Gerätespritze, die mit einer langen Nadel ausgestattet ist, um die 30%ige Glycerin-Glutaraldehyd-Lösung am Boden des Röhrchens zu schichten. Verwenden Sie ein Gradienten-Master-Gerät, um einen linearen Glyceringradienten gemäß den Herstellerangaben zu erstellen. Schichten Sie vorsichtig 200 Mikroliter eines 7%igen Glycerins und eines Puffer-A-Kissens auf den oberen Rand des Gradienten, bevor Sie etwa zwei Milligramm Zellextrakt auf die Oberseite des Röhrchens geben.

Nach der Erzeugung des Glyceringradienten wird die Probe in einen vorgekühlten Ausschwingrotor gegeben und der Extrakt durch Zentrifugation gesammelt. Aliquotieren Sie die Probe aus jedem 12-Milliliter-Probenröhrchen in 24 500-Mikroliter-Fraktionen und drücken Sie mit einer Peristaltikpumpe eine 40%ige Glycerinlösung durch den 10- bis 30%igen Gradienten vom Röhrchen zur Fraktionssammlung. Laden Sie dann 50 Mikroliter jeder Fraktion direkt auf die Nitrozellulosemembranen auf einem Dot-Blot, gefolgt von der Zugabe eines Blockierungspuffers, und verwenden Sie einen primären Antikörper gegen CBP, um das Protein auf dem Immunblot nachzuweisen, und bei Bedarf einen geeigneten sekundären Antikörper.

In Abwesenheit des Vernetzers ist CWC 24 zwischen den Fraktionen fünf und 13 konzentriert, was Komplexen von etwa 80 bis 200 Megadalton entspricht. In Gegenwart des Vernetzers verschiebt sich jedoch die Position von CWC 24 auf dem Gradienten zu Fraktionen am unteren Rand des Gradienten, die größeren Komplexen entsprechen. Vergleicht man die Sedimentation von CWC 24 mit der der U5 snRNP-Untereinheit Prp8 und der NTC-Untereinheit zeigt Prp19, dass CWC 24 in den gleichen Fraktionen konzentriert ist.

Da es jedoch vorübergehend mit dem Spleißosom assoziiert, ist es auch in den leichteren Fraktionen vorhanden. Interessanterweise sind die Fraktionen 11 und 12 diejenigen, in denen Prp8 und 19 beginnen, sich zu konzentrieren, was darauf hindeutet, dass dies der Teil des Gradienten ist, in dem der B-Act-Komplex zu sedimentieren beginnt. Die Western-Blot-Analyse der Fraktionen 11 und 12 zeigt Prp8- und 19-Signale als Abstriche, die kaum in ein 8%iges Acrylamid-Gel eindringen, was zeigt, dass sie tatsächlich Teil großer Komplexe sind.

CWC 24 ist auch in Fraktion 12 vorhanden, jedoch in einer viel geringeren Konzentration, was mit seiner vorübergehenden Bindung an den B-Act-Komplex übereinstimmt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Glutaraldehyd als Vernetzer verwendet werden kann, um die Bindung transienter Faktoren an Spleiß-Subkomplexe zu stabilisieren. Diese Methode kann auf die Untersuchung dynamischer motorischer Untereinheitenkomplexe angewendet werden, die vorübergehend mit einigen ihrer Komponenten, wie z. B. dem Spleißosom, assoziiert sind.