Verwendung von Grafix zum Nachweis transienter Interaktoren von Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes
9. November 2020
Hier beschreiben wir die Verwendung von Grafix (Gradient Fixation), einer Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers, um Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren zu identifizieren, die vorübergehend an den Spleißosomkomplex binden.
Die Gradientenfixierungsmethode, bei der eine Glyceringradientenzentrifugation in Gegenwart eines Vernetzers durchgeführt wird, hilft dabei, Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu identifizieren, die vorübergehend an Komplexe aus mehreren Untereinheiten binden. Die Verwendung von Fixierungsreagenzien im Glyceringradienten stabilisiert die Bindung loser Faktoren ohne die Bildung von Ausfällungen und ermöglicht die Identifizierung der Wechselwirkungen spezifischer Proteine mit gespleißten Halbkomplexen. Die Demonstration des Endprotokolls hilft Erstbenutzern, Informationen zu lernen, die allein aus geschriebenem Text schwer zu verstehen sind.
Für die Herstellung des Hefe-Gesamtextrakts züchten Sie die Hefezellen, die einen der Spleißfaktoren exprimieren, die mit dem Zapfhahn-Tag fusioniert sind, und einen Liter Y- und B-Glukosemedium, ergänzt mit den entsprechenden Aminosäuren oder Nukleinbasen. Wenn die Kultur eine optische Dichte von 600 Nanometern erreicht, sammeln Sie die Hefezellen durch Zentrifugation in drei 500-Milliliter-Zentrifugenflaschen und waschen Sie die Zellen zweimal in 10 Millilitern kaltem, sterilem Wasser pro Waschgang. Nach dem zweiten Waschen resuspendieren Sie die Zellen in einem Zehntel des Zellvolumens des kalten Puffers A und frieren Sie 50 Mikroliter der Hefezellsuspension in flüssigem Stickstoff ein.
Nach dem Einfrieren mahlen Sie die gefrorenen Zellpellets drei Minuten lang in einer Kugelmühle durch sechs Zyklen bei 20 Hertz und tauchen Sie den Behälter mit den gefrorenen Zellen am Ende jedes Zyklus in flüssigen Stickstoff. Legen Sie nach dem letzten Zyklus die Röhrchen mit den Extrakten unter gelegentlichem Schütteln in Wasser bei Raumtemperatur. Nach dem Schmelzen zentrifugieren, um die Extrakte zu sammeln.
Und quantifizieren Sie das Protein, das die Überstände mit der BCA-Methode beseitigt haben. Anschließend die Aliquote der Extrakte in flüssigem Stickstoff für eine Lagerung bei minus 80 Grad Celsius schnell einfrieren. Um einen Glyceringradienten herzustellen, fügen Sie eine Endkonzentration des Vernetzungsmittels Glutaraldehyd von 0,1 % zu einer 30%igen Glycerin- und Puffer-A-Lösung hinzu und mischen Sie sie, um sie zu homogenisieren.
Geben Sie sechs Milliliter kalte 10%ige Glycerin- und Puffer-A-Lösung in ein 12-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine Gradienten-Master-Gerätespritze, die mit einer langen Nadel ausgestattet ist, um die 30%ige Glycerin-Glutaraldehyd-Lösung am Boden des Röhrchens zu schichten. Verwenden Sie ein Gradienten-Master-Gerät, um einen linearen Glyceringradienten gemäß den Herstellerangaben zu erstellen. Schichten Sie vorsichtig 200 Mikroliter eines 7%igen Glycerins und eines Puffer-A-Kissens auf den oberen Rand des Gradienten, bevor Sie etwa zwei Milligramm Zellextrakt auf die Oberseite des Röhrchens geben.
Nach der Erzeugung des Glyceringradienten wird die Probe in einen vorgekühlten Ausschwingrotor gegeben und der Extrakt durch Zentrifugation gesammelt. Aliquotieren Sie die Probe aus jedem 12-Milliliter-Probenröhrchen in 24 500-Mikroliter-Fraktionen und drücken Sie mit einer Peristaltikpumpe eine 40%ige Glycerinlösung durch den 10- bis 30%igen Gradienten vom Röhrchen zur Fraktionssammlung. Laden Sie dann 50 Mikroliter jeder Fraktion direkt auf die Nitrozellulosemembranen auf einem Dot-Blot, gefolgt von der Zugabe eines Blockierungspuffers, und verwenden Sie einen primären Antikörper gegen CBP, um das Protein auf dem Immunblot nachzuweisen, und bei Bedarf einen geeigneten sekundären Antikörper.
In Abwesenheit des Vernetzers ist CWC 24 zwischen den Fraktionen fünf und 13 konzentriert, was Komplexen von etwa 80 bis 200 Megadalton entspricht. In Gegenwart des Vernetzers verschiebt sich jedoch die Position von CWC 24 auf dem Gradienten zu Fraktionen am unteren Rand des Gradienten, die größeren Komplexen entsprechen. Vergleicht man die Sedimentation von CWC 24 mit der der U5 snRNP-Untereinheit Prp8 und der NTC-Untereinheit zeigt Prp19, dass CWC 24 in den gleichen Fraktionen konzentriert ist.
Da es jedoch vorübergehend mit dem Spleißosom assoziiert, ist es auch in den leichteren Fraktionen vorhanden. Interessanterweise sind die Fraktionen 11 und 12 diejenigen, in denen Prp8 und 19 beginnen, sich zu konzentrieren, was darauf hindeutet, dass dies der Teil des Gradienten ist, in dem der B-Act-Komplex zu sedimentieren beginnt. Die Western-Blot-Analyse der Fraktionen 11 und 12 zeigt Prp8- und 19-Signale als Abstriche, die kaum in ein 8%iges Acrylamid-Gel eindringen, was zeigt, dass sie tatsächlich Teil großer Komplexe sind.
CWC 24 ist auch in Fraktion 12 vorhanden, jedoch in einer viel geringeren Konzentration, was mit seiner vorübergehenden Bindung an den B-Act-Komplex übereinstimmt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Glutaraldehyd als Vernetzer verwendet werden kann, um die Bindung transienter Faktoren an Spleiß-Subkomplexe zu stabilisieren. Diese Methode kann auf die Untersuchung dynamischer motorischer Untereinheitenkomplexe angewendet werden, die vorübergehend mit einigen ihrer Komponenten, wie z. B. dem Spleißosom, assoziiert sind.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt die Gradientenfixierungsmethode, bei der eine Glycerol-Gradientenzentrifugation mit einem Vernetzer verwendet wird, um vorübergehende Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren und dem Spleißosomenkomplex nachzuweisen. Die Methode stabilisiert lockere Proteinwechselwirkungen, ohne dass eine Ausfällung erfolgt, und erleichtert so die Untersuchung spezifischer Proteinwechselwirkungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Die Gradientenfixierung ist eine Technik, die zur Untersuchung von Proteinwechselwirkungen eingesetzt wird.
- Sie hilft dabei, vorübergehende Wechselwirkungen innerhalb von Multisubkomplexen zu identifizieren.
- Die Verwendung von Vernetzern erhöht die Stabilität dieser Wechselwirkungen.
- Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Spleißfaktoren.
Zweck der Studie
- Die Gradientenfixierungsmethode zur Identifizierung von Proteinwechselwirkungen demonstrieren.
- Einen Protokoll bereitstellen, der Erstanwendern hilft, die Technik zu verstehen.
- Die Untersuchung von Spleißfaktoren in Hefe erleichtern.
Verwendete Methoden
- Zentrifugation in einem Glycerol-Gradienten mit einem Vernetzer.
- Herstellung von Gesamtextrakten aus Hefe, die Spleißfaktoren exprimieren.
- Sammlung und Waschen von Hefezellen.
- Einfrieren der Zellsuspensionen für weitere Analysen.
Hauptergebnisse
- Die Methode stabilisiert erfolgreich vorübergehende Proteinwechselwirkungen.
- Spezifische Wechselwirkungen zwischen Spleißfaktoren und dem Spleißosom wurden identifiziert.
- Das Protokoll ist für Forscher zugänglich, die neu in der Technik sind.
- Die Demonstration des Endprotokolls trägt zum praktischen Verständnis bei.
Schlussfolgerungen
- Die Gradientenfixierung ist eine wirksame Methode zur Untersuchung vorübergehender Proteinwechselwirkungen.
- Diese Technik kann unser Verständnis von Spleißmechanismen verbessern.
- Sie stellt ein wertvolles Werkzeug für Forscher in der Molekularbiologie dar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Identifizierung transiente Proteinwechselwirkungen ist entscheidend für die Target-Validierung in dynamischen Komplexen wie dem Spleißosom, da schwache oder kurzlebige Assoziationen mit herkömmlichen Methoden übersehen werden können. Die Grafix-Methode (Gradient Fixation) stabilisiert diese Wechselwirkungen mittels Glycerin-Gradientenzentrifugation in Anwesenheit eines Vernetzers und ermöglicht so deren Nachweis, ohne dass Niederschläge entstehen. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken, indem er Bindungspartner in krankheitsrelevanten Systemen klärt und das Vorhersagevertrauen in frühen Entwicklungsphasen verbessert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung vorübergehender Wechselwirkungen von Spleißfaktoren, die möglicherweise therapeutische Zielstrukturen in RNA-Verarbeitungswegen darstellen.
- Operativer Wert: Stabilisiert schwache Bindungspartner für den Nachweis und verringert dadurch falsch-negative Ergebnisse in Target-Validierungsassays.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Aufklärung von Wegen durch die Kartierung der Mitpräzipitation von Faktoren wie CWC 24 mit U5 snRNP und NTC-Untereinheiten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet fraktionierte Komplexe für die nachgeschaltete Analyse mittels Dot-Blot auf, wodurch eine quantitative Beurteilung des Vorhandenseins von Spleißfaktoren ermöglicht wird.
- Operativer Wert: Erzeugt reproduzierbare Sedimentationsprofile, die über verschiedene Durchläufe hinweg standardisiert werden können, um die Konsistenz des Assays sicherzustellen.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Bereitschaft für die Screening-Analyse, indem Subkomplexe in definierten Gradientenfraktionen zur gezielten Untersuchung isoliert werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert krankheitsrelevante Erkenntnisse über die Dynamik des Spleißosoms, die bei Krebserkrankungen und neurodegenerativen Störungen eine Rolle spielt.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die kontinuierliche Weiterführung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem vorübergehende Wechselwirkungen für funktionelle Nachuntersuchungen stabilisiert werden.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem stabile und vorübergehende Assoziationen in makromolekularen Komplexen unterschieden werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Grafix-Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die Hypothesenprüfung vorübergehender Wechselwirkungen, bevor mit der Identifizierung von Leitstrukturen und der präklinischen Validierung fortgefahren wird.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft Hypothesen über vorübergehende Bindungen von Spleißfaktoren, indem Interaktionen stabilisiert werden, um ihre Detektion in Gradientenfraktionen zu ermöglichen.
- Screening: Erzeugt assaysfertige Fraktionen mittels standardisierter Glycerolgradienten, wodurch reproduzierbare Tests für Wirkstoffe oder Faktoren ermöglicht werden.
- Analytik: Liefert quantitative Sedimentationsdaten und Ergebnisse zur räumlichen Koinzidenz (z. B. CWC24 mit Prp8/Prp19), um verschiedene Bedingungen zu vergleichen und Bindungsverschiebungen zu bewerten.
- Translationale Forschung: Schafft einen Bezug zur präklinischen Forschung, indem Faktoren identifiziert werden, deren vorübergehende Bindung in Krankheitszuständen moduliert sein könnte.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung beliebiger dynamischer Untereinheitenkomplexe mit vorübergehenden Komponenten, nicht beschränkt auf das Spleißosom.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem vorübergehende Interaktoren aufgedeckt werden, die andernfalls in Standard-Lysaten verloren gingen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Gradientenerzeugung und Fraktionierung und verringert so die Variabilität zwischen verschiedenen Laboren.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung zwischen Weiterverfolgung oder Einstellung von Projekten, indem mechanistische Unklarheiten in mehrteiligen Zielkomplexen geklärt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf validierten Interaktionsnetzwerken in für die Krankheit relevanten Systemen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Hefezelllyse, der Herstellung von Dichtegradienten und Fraktionierungstechniken.
- Hängt vom Zugang zu Gradientenherstellungsgeräten, Schwenkköpfen für Ultrazentrifugen und Fraktionierungsapparaturen ab.
- Erfordert die Standardisierung der Konzentration von Vernetzern (z. B. Glutaraldehyd), um eine Überstabilisierung oder Ausfällung zu vermeiden.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen bei der Anwendung auf Nicht-Hefe-Systeme oder alternative Komplexe.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie eine mögliche Maskierung von Epitopen durch die Vernetzung, weshalb die Zugänglichkeit von Antikörpern nach der Fixierung validiert werden muss.
