Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Dieser Bericht liefert den experimentellen Nachweis für die Dokumentation, dass ein Galectin-3 U1 snRNP-Komplex an das prä-mRNA-Substrat bindet, einen funktionellen Komplex bildet und zu Produkten der Spleißreaktion führt. Dieses Protokoll verwendet das Galectin-3 U1 snRNP-Immunselektion auf Kügelchen, die kovalent an Anti-Gal3-Antikörper gekoppelt sind, um die Spleißreaktion zu initiieren, die bis zum Abschluss fortschreiten kann. Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die vorsichtige Entfernung der Flüssigkeit nach dem Pelletieren der Kügelchen, die den Galectin-3 U1 snRNP-Komplex enthalten, und seine sofortige Verwendung bei der Einleitung der Spleißreaktion.

Um U1 snRNPs aus dem Kernextrakt zu erschöpfen, inkubieren Sie 200 Mikroliter Kernextrakt mit 100 Mikrolitern Anti-U1-Kügelchen. Geben Sie fünf Mikroliter RNAs in die Mischung und drehen Sie das Mikroröhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit dem Kopf über den Schwanz. Das Gemisch wird durch Zentrifugation pelletiert und das ungebundene Material mit einer Hamilton-Spritze aufgefangen.

Dialysieren Sie das gesamte Volumen des U1-abgereicherten Kernextrakts zusammen mit einem separaten 50-Mikroliter-Aliquot des ursprünglichen nicht abgereicherten Kernextrakts in getrennten Kompartimenten eines Mikrodialysators unter Rühren für 75 Minuten gegen 60 % Puffer D bei vier Grad Celsius. Verwenden Sie eine Dialysemembran mit einem abgeschnittenen Molekulargewicht von 8K. Unmittelbar nach der Dialyse die Präparate in 20 Mikroliter Aliquot aufteilen, anschließend in einem Trockeneis-Ethanolbad einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Waschen Sie die Anti-Gal3-Kügelchen kurz vor dem Gebrauch zweimal mit 0,5 Millilitern TX-Waschpuffer. Für jede Wäsche den Waschpuffer und die Zentrifuge hinzufügen. Entfernen Sie den Überstand zuerst mit einer Mikropipette und dann mit einer Hamilton-Spritze, um die Flüssigkeit aus den Kügelchen zu entfernen.

Fraktionieren Sie den Kernextrakt über einen Glycerolgradienten von 12 % bis 32 %. Kombinieren und mischen Sie die Glyceringradientenfraktionen drei, vier und fünf, die sich in der Nähe des 10S-Bereichs befinden. Bereiten Sie zwei 150-Mikroliter-Aliquots der kombinierten Gradientenfraktionen drei bis fünf vor und legen Sie sie in 50 Mikroliter Anti-Gal3-Kügelchen.

Bereiten Sie parallel zwei Proben mit je 150 Mikrolitern der ersten Fraktion vor und legen Sie sie in 50 Mikroliter Anti-Gal3-Kügelchen. Geben Sie zur Kontrolle 150 Mikroliter 60%Puffer D in 50 Mikroliter Anti-Gal3-Kügelchen. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf die Röhrchen klopfen, und drehen Sie sie dann eine Stunde lang bei vier Grad Celsius mit dem Kopf über den Schwanz.

Pelletieren Sie die Proben mit schonender Zentrifugation. Entfernen Sie den größten Teil des Überstands mit einer Mikropipette. Entfernen Sie den Überstand mit einer Hamilton-Spritze, indem Sie die Nadelspitze vorsichtig an die Unterseite der Kügelchen einführen.

Verwenden Sie die Kügelchen sofort für die Spleißreaktionen. Assemblieren Sie die Spleißreaktion wie im Textmanuskript beschrieben und fügen Sie sie zu einem Satz der Bead-Proben hinzu. Assemblieren Sie einen identischen Satz von Spleißreaktionen in einem Gesamtvolumen von 24 Mikrolitern, jedoch ohne U1-abgereicherten Kernextrakt, und fügen Sie ihn dem anderen Satz von Kügelchen hinzu.

Bereiten Sie eine Kontrollspleißreaktion vor, die in Abwesenheit von Kügelchen in einem Gesamtvolumen von 12 Mikrolitern durchgeführt werden soll. Diese Kontrollreaktion enthält Kernextrakt, 60%Puffer D und radioaktives Spleißsubstrat. Mischen Sie die Röhrchen vorsichtig durch Klopfen und drehen Sie sie 90 Minuten lang bei 30 Grad Celsius mit dem Kopf über den Schwanz, dann pelletieren Sie die Mischung durch sanfte Zentrifugation.

Stoppen Sie die Reaktion und eluieren Sie die Proteine von den Kügelchen, indem Sie 24 Mikroliter 2X SDS-Probenpuffer in die Röhrchen mit den Kügelchen und 12 Mikroliter 2X SDS-Probenpuffer in das Kontrollröhrchen mit Kernextrakt, aber ohne Kügelchen geben. Wirbeln Sie jedes Rohr ein. Erhitzen Sie die Röhren sieben Minuten lang bei 100 Grad Celsius.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 1.000 mal G in einem schwingenden Schaufelrotor bei Raumtemperatur für 10 bis 15 Sekunden. Die Überstände in frische Mikroröhrchen umfüllen. Fügen Sie 20 Milligramm Proteinase K pro Milliliter hinzu, um die Proteine zu verdauen und zu lösen.

Inkubieren Sie die Röhrchen 40 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie die Röhrchen nach der Inkubation vorsichtig. Verdünnen Sie die Kügelchenelungen mit 39,5 Mikrolitern TE und 10 Mikrolitern drei molaren Natriumacetat.

Die Kontrolle des Kernextrakts wird mit 63,5 Mikrolitern TE und 10 Mikrolitern Natriumacetat verdünnt. Extrahieren und analysieren Sie die RNA, wie im Textmanuskript beschrieben. Kernextrakte, die von U1 snRNP- und gal3 U1 snRNP-Komplexen aus der 10S-Region der Glyceringradienten-Immunpräzipitation durch Anti-Gal3 abgereichert wurden, wurden in einer Spleißreaktion gemischt.

Dieses Reaktionsgemisch enthielt U1 snRNA sowie das U1-spezifische Protein U1-70K. Wie erwartet fiel das Anti-Gal3 Gal3 aus. U1 snRNA, U1-70K Protein und gal3 wurden in der präimmunen Kontrollpräzipitation nicht gefunden.

Im Vergleich zu einem nicht abgereicherten Kernextrakt, der als Positivkontrolle durchgeführt wurde, zeigte der von U1 snRNP abgereicherte Kernextrakt keine Spleißaktivität. Die Spleißaktivität im U1-abgereicherten Kernextrakt konnte durch den bead-gebundenen gal3 U1 snRNP-Komplex rekonstituiert werden. Es wurden sowohl Produkte der Spleißreaktion, ligierte Exons und exzidiertes Intron-Lariat als auch in Zwischenprodukten gefunden.

Die Komponenten der Fraktionen drei bis fünf waren entscheidend für die Wiederherstellung des Spleißens des U1-abgereicherten Kernextrakts. Wenn diese Fraktionen durch Puffer allein ersetzt wurden, konnte keine Spleißaktivität beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass die Anti-Gal3-Kügelchen nicht für die Wiederherstellung der Spleißaktivität in Kernextrakten verantwortlich waren, die von U1 abgereichert wurden. Noch überzeugender ist, dass bei der Ersetzung der Fraktionen drei bis fünf durch die erste Fraktion im Immunpräzipitationsverfahren und dann die Zugabe zum U1-abgereicherten Kernextrakt keine Zwischenprodukte oder Produkte der Spleißreaktion gefunden wurden. Beim Versuch dieses Protokolls sollte eine Person die Immunpräzipitation abschließen, während die andere Person die Spleißreaktion mit so wenig Verzögerung wie möglich vorbereitet.

proteomische Analyse der Polypeptidzusammensetzung des Galectin-3 U1 SNRP, die die Spleißaktivität eines U1-abgereicherten Kernextrakts wiederherstellt, wäre von großem Interesse.