Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Das übergeordnete Ziel dieses Nachweises besteht darin, Protein-DNA-Wechselwirkungen unter Verwendung nicht-radioaktiver Sonden zu detektieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Molekularbiologie und Biochemie zu beantworten, beispielsweise die Ermittlung der DNA-Zielsequenz von Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache, sichere und zeitsparende Alternative zum Einsatz radioaktiver Sonden darstellt.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein fünfprozentiges natives Polyacrylamidgel mit 0,5x Tris-Borat-EDTA oder TBE und 2,5 % Glycerin unter Verwendung eines Mini-Proteingel-Systems vor. Um 30 Milliliter Gellösung für vier Gele herzustellen, mischen Sie destilliertes Wasser, TBE, Ammoniumpersulfat, TEMED, Acrylamid-Bis und Glycerin. Gießen Sie die Gellösung unverzüglich ein.

Nach der Polymerisation die Gele in klare Plastikfolie einwickeln, die zuvor mit 0,5x TBE vorgenässt wurde, und bei vier Grad Celsius lagern. Anschließend ein langes Oligonukleotid für etwa 51 Mere entwerfen. Komplementäre kurze Oligonukleotide für etwa 14 Mere mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffmodifikation am Fünf-Prim-Ende entwerfen.

Nachdem die Oligonukleotide hergestellt wurden, resuspendieren Sie diese in 1x Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar. Zum Anlassen mischen Sie 0,6 Mikroliter des 5'-Farbstoff-kurzen Oligonukleotids, 1,2 Mikroliter des langen Oligonukleotids und 28,2 Mikroliter Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang in siedendes Wasser, schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit den annullierten Oligonukleotiden über Nacht im Dunkeln abkühlen.

Um doppelsträngige DNA-Sonden herzustellen, mischen Sie 30 Mikroliter der annealeden Oligonukleotide mit dNTPs, Klenow-Puffer, Klenow-Fünf-Prime-Farbstoffmarke und doppelt destilliertem Wasser in einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer PCR-Maschine. Geben Sie anschließend 3,4 Mikroliter 0,5 M EDTA zu, um die Reaktion zu stoppen, und inaktivieren Sie durch Erhitzen bei 75 Grad Celsius für 20 Minuten in der PCR-Maschine.

Danach die gefüllten Sonden mit Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikromolar verdünnen. Die Oligonukleotide bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln lagern. Zum Herstellen unmarkierter Sonden 20 Mikroliter langes Oligonukleotid, 20 Mikroliter Long-R-Oligonukleotid und 60 Mikroliter Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mischen.

Stellen Sie das Reagenzglas fünf Minuten lang in siedendes Wasser, schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit den annealeden Oligos über Nacht abkühlen. Bereiten Sie ein Milliliter 5x Bindungspuffer durch Mischen von Tris HCl, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, EDTA, DTT, BSA und zweifach destilliertem Wasser vor. Bevor Sie die Bindungsreaktionen aufsetzen, führen Sie das 5% native Polyacrylamidgel in 0,5x TBE und 2,5% Glycerin zur Entfernung sämtlicher Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 Volt 30 Minuten bis eine Stunde vor, oder bis der Strom nicht mehr zeitabhängig variiert.

Mischen Sie anschließend vier Mikroliter 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 Nanogramm gereinigtes Protein A, ein Mikroliter 0,1 Mikromolar Farbstoff-gekoppelte Sonde und doppelt destilliertes Wasser. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation laden Sie die gesamte Bindungsreaktion auf das Gel auf und führen das Gel bei 10 Volt pro Zentimeter bis zur gewünschten Distanz durch.

Decken Sie die Gelelektrophoresevorrichtung mit Aluminium ab, um das Gel so gut wie möglich vor Licht zu schützen. Reinigen Sie das Scannerglas eines Infrarot-Bildgebungssystems mit destilliertem Wasser. Wischen Sie die Glasplatten, die das Gel enthalten, trocken und legen Sie sie auf das Scannerglas.

Öffnen Sie die Infrarot-Bildgebungssoftware, und klicken Sie auf den Reiter „Erfassen“. Verwenden Sie für dickere Platten die Einstellungen 700 für den Kanal, automatisch für die Intensität, 84 Mikrometer für die Auflösung, mittel für die Qualität und 3,5 Millimeter für die Fokusverschiebung. Wählen Sie den Bereich aus, den das Gel auf dem Scanner einnimmt.

Klicken Sie abschließend auf „Start“, um den Scan zu beginnen. Der Fortschritt der Elektrophorese kann mit dem Orange-G-Ladefarbstoff sichtbar gemacht werden, während Bromphenolblau während des Scannens detektiert wird und daher die Bildanalyse stört. Die Zugabe von dI-dC zur Bindungsreaktion unterband die Bindung des gereinigten 6xHis-SOX-2 an die mit Farbstoff markierten DNA-Proben am 5′-Ende.

Die LIM-4-Mutante und die kalte Sonde von SOX-2, die in der LIM-4-Bindungsstelle mutiert ist, wirkt ebenso effizient wie die Wildtyp-kalte Sonde bei der Konkurrenz mit der mit Infrarotfarbstoff markierten Sonde um die Bindung an 6xHis-SOX-2. Die Konkurrenzwirkung der kalten Sonde mit Mutationen in der SOX-2-Bindungsstelle hingegen ist jedoch deutlich geringer als die der Wildtyp-kalten Sonde bei der Bindung an 6xHis-SOX-2. Supershift-Assays des SOX-2-DNA-Komplexes unter Verwendung von 6xHis- und Flag-Epitopen führten zu einem supershifteten SOX-2-DNA-Band.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis vier Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Infrarotsonden im Dunkeln zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die CRISPR-Cas9-Genomeditierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Bedeutung einer bestimmten DNA-Bindesequenz.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biochemie den Weg, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in verschiedenen Modellorganismen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Protein-DNA-Wechselwirkungen mithilfe nicht-radioaktiver DNA-Markierungen bestimmt werden können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Acrylamid äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.