Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist es, Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nicht-radioaktiven Sonden zu detektieren. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Molekularbiologie und Biochemie zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der DNA-Zielsequenz von Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine einfache, sichere und zeitsparende Alternative zur Verwendung radioaktiver Sonden darstellt.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein fünfprozentiges natives Polyacrylamid-Gel her, das 0,5x Trisborat EDTA oder FSME und 2,5% Glycerin unter Verwendung eines Mini-Protein-Gel-Systems enthält. Um 30 Milliliter Gellösung für vier Gele herzustellen, mischen Sie destilliertes Wasser, FSME, Ammoniumpersulfat, TEMED, Acrylamid bis und Glycerin. Geben Sie die Gellösung sofort weiter.

Wickeln Sie die Gele nach der Polymerisation in klare, mit 0,5x FSME vorbenetzte Frischhaltefolie ein und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Entwerfen Sie als Nächstes ein langes Oligonukleotid für etwa 51 mer. Design komplementärer kurzer Oligonukleotide für etwa 14 mere mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffmodifikation an den fünf Primzahlen.

Sobald die Oligonukleotide hergestellt wurden, resuspendieren Sie sie in 1x Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolaren. Mischen Sie zum Glühen 0,6 Mikroliter des kurzen Oligonukleotids mit fünf Hauptfarbstoffen, 1,2 Mikroliter des langen Oligonukleotids und 28,2 Mikroliter Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang in kochendes Wasser, schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit den geglühten Oligonukleotiden über Nacht im Dunkeln abkühlen.

Um doppelsträngige DNA-Sonden herzustellen, mischen Sie 30 Mikroliter der getemperten Oligonukleotide mit DNTPs, Klenow-Puffer, Klenow-Fünf-Prime-Farbstoff-Tag und doppelt destilliertem Wasser in einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer PCR-Maschine. Fügen Sie dann 3,4 Mikroliter 0,5 molare EDTA hinzu, um die Reaktion zu stoppen, und inaktivieren Sie sie 20 Minuten lang bei 75 Grad Celsius in der PCR-Maschine.

Anschließend verdünnen Sie die eingefüllten Sonden mit Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 μmolaren Molekülen. Lagern Sie die Oligonukleotide bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln. Um unmarkierte Sonden herzustellen, mischen Sie 20 Mikroliter langes Oligonukleotid, 20 Mikroliter langes R-Oligonukleotid und 60 Mikroliter Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Legen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang in kochendes Wasser, schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit den geglühten Oligos über Nacht abkühlen. Bereiten Sie einen Milliliter 5x Bindungspuffer vor, indem Sie Tris HCl, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, EDTA, DTT, BSA und doppelt destilliertes Wasser mischen. Bevor Sie die Bindungsreaktionen in Gang setzen, führen Sie das 5%ige Polyacrylamid-Gel in 0,5x FSME und 2,5% Glycerin vor, um alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 Volt für 30 Minuten bis zu einer Stunde zu entfernen, oder bis der Strom nicht mehr mit der Zeit variiert.

Mischen Sie als Nächstes vier Mikroliter 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 Nanogramm gereinigtes Protein A, einen Mikroliter 0,1 Mikromolar Farbstoff konjugierte Sonde und doppelt destilliertes Wasser. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur im Dunkeln 15 Minuten lang. Laden Sie nach der Inkubation die gesamte Bindungsreaktion auf das Gel und lassen Sie das Gel mit 10 Volt pro Zentimeter auf den gewünschten Abstand laufen.

Decken Sie das Gelgerät mit Aluminium ab, um das Gel so weit wie möglich im Dunkeln zu halten. Reinigen Sie das Scannerbett eines Infrarot-Bildgebungssystems mit destilliertem Wasser. Wischen Sie die Glasplatten mit dem Gel trocken und legen Sie sie auf das Scannerbett.

Öffnen Sie die Infrarot-Bildgebungssoftware und klicken Sie auf die Registerkarte Erfassen. Verwenden Sie für dickere Platten die Einstellungen von 700 für Kanal, Auto für Intensität, 84 Mikrometer für die Auflösung, Mittel für die Qualität und 3,5 Millimeter für den Fokusversatz. Wählen Sie den Bereich aus, den das Gel auf dem Scanner einnimmt.

Klicken Sie abschließend auf Start, um den Scan zu starten. Der Fortschritt der Elektrophorese kann mit dem Beladungsfarbstoff Orange G sichtbar gemacht werden, während Bromophenolblau beim Scannen erkannt wird und daher die Bildanalyse stört. Durch die Zugabe von dI-dC zur Bindungsreaktion wurde die Bindung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 an die fünf Prime-Farbstoff-DNA-Sonden aufgehoben.

Die LIM-4-Mutante und die SOX-2-Kaltsonde, die an der LIM-4-Bindungsstelle mutiert sind, konkurrieren genauso effizient wie die Wildtyp-Kaltsonde mit der mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff markierten Sonde um die Bindung an 6xHis-SOX-2. Die Konkurrenzeffizienz der LIM-4- und SOX-2-mutierten Kaltsonde, die an der SOX-2-Bindungsstelle mutiert ist, ist jedoch viel geringer als die der Wildtyp-Kaltsonde für die Bindung an 6xHis-SOX-2. Supershift-Assays des SOX-2-DNA-Komplexes unter Verwendung von 6xHis- und Flag-Epitopen führten zu einer superverschobenen SOX-2-DNA-Bande.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Infrarotsonden im Dunkeln zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die CRISPR-Cas9-Genom-Editierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bedeutung einer bestimmten DNA-Bindungssequenz zu beantworten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern im Bereich der Biochemie den Weg, Protein-DNA-Wechselwirkungen in verschiedenen Modellorganismen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Protein-DNA-Wechselwirkungen mithilfe von nicht-radioaktiven DNA-Markierungen bestimmt werden können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Acrylamid äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung getroffen werden sollten.