Name: Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Lernen Sie ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay mit infrarot-fluoreszierenden Oligonukleotiden. Diese nicht-radioaktive Methode ermöglicht sichere und effiziente Analysen von Protein-DNA-Interaktionen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Alfred P. Sloan Research Fellowship (an C.-F.C.) und ein NIH R01 Stipendium (5R01GM098026-05 an C.-F.C.). Wir danken David Crowe für den Zugang zu dem fortschrittlichen Infrarot-Bildgebungssystem.

HINWEIS: EMSAs fluoreszenzmarkierten DNA - Sonden oder andere Formen von markierten DNA die gleichen Protokolle für Protein oder Zellextraktzubereitung, Protein-DNA - Bindungsreaktion und PAGE Gelzubereitung und Ausführen (1A) verwendet wird . Die wichtigsten Unterschiede sind DNA-Markierungsverfahren, post-run Gel Verarbeitungsschritte und Nachweismethoden. 1. Gel Zubereitung <ol><li> Bereiten 5% nativen Polyacrylamidgel, enthaltend 0,5 × TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA) und 2,5% Glycerin, ein Mini-Protein-Gel-System (8,3 cm Breite x 7,3 cm Länge x 0,75 mm Dicke). <ol><li> Zur Herstellung von 30 ml Gel-Lösung für 4 Gele, mischen 5 ml 30% Acrylamid / Bis (37,5: 1), 3 ml 5-fach TBE (0,45 M Tris-Borat, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% Glycerol, 300 &amp; mgr; l von 10% Ammoniumpersulfat, 15 &amp; mgr; l TEMED und 20,2 ml ddH 2 O gründlich. HINWEIS: Acrylamid schädlich und giftig ist, Griff mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. </li&gt; </ol></li><li> Cast der Gel-Lösung sofort. Nach der Polymerisation wickeln die Gele in klaren Plastikfolie mit 0,5x TBE vorbenetzt und lagern Sie sie bei 4 ° C. </li></ol> 2. Herstellung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Sonden HINWEIS: Halten Sie die Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden weg von Licht so viel wie möglich während der Herstellung, Lagerung und Experimente. <ol><li> Gestalten und bestellen Oligonukleotide. <ol><li> Entwerfen Sie lange Oligonukleotid für ~ 51-mere. HINWEIS: Die lange Oligonukleotid - Sequenz des LIM-4 / SOX-2 - Sonde ist TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Lange Oligonukleotide erfordern keine PAGE oder HPLC-Reinigung. </li><li> Entwerfen komplementäre kurze Oligonukleotide für ~ 14-mers mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-Modifikation am 5&#39;-Terminus (5&#39;Dye) und eine Schmelztemperatur über 37 ° C. HINWEIS: Die kurze Oligonukleotid-Sequenz des LIM-4 / SOX2 Sonde ist 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG. Die Mindestsynthesemaßstab von 5&#39;Dye-markierte kurze Oligonukleotide ist 100 nM. Daher erfordern die Oligonucleotide HPLC-Reinigung. </li></ol></li><li> Resuspendieren Oligonukleotiden in 1x Tris-EDTA-Puffer (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) auf eine Endkonzentration von 100 uM. </li><li> Anneal Short (5&#39;Dye) und lange Oligonukleotide. <ol><li> Mischungs 0,6 ul 5&#39;Dye-Short Oligo (100 uM), 1,2 ul Oligo Lange (100 uM), und 28,2 &amp; mgr; l Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) in einem 1,5 ml-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos O / N kühlen im Dunkeln. </li></ol></li><li> Füllen Sie das 5&#39;-Überhang von vergütetem 5&#39;Dye-kurz / lang Oligos mit Klenow-DNA-Polymerase doppelsträngigen DNA-Sonden zu machen. <ol><li> Bereiten Sie die Reaktion durch Vermischen30 ul geglüht kurz / lang Oligos mit 5&#39;Dye Tag, 8,5 ul 10x Klenow-Puffer, 1,7 ul 10 mM dNTPs, 1,7 ul Klenow (3 &#39;-&gt; 5&#39; exo) (5 u / ul) und von 43,1 &amp; mgr; l ddH 2 O in einem 0,2 ml PCR - Röhrchen. </li><li> Inkubieren 60 min bei 37 ° C in einer PCR-Maschine. </li><li> Hinzufügen, 3,4 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA die Reaktion und Wärme inactivate für 20 min in einer PCR-Maschine bei 75 ° C zu beenden. </li></ol></li><li> Verdünnte eingefüllte in Sonden (0,7 uM) in STE für Endkonzentration von 0,1 uM. </li><li> Shop Oligos bei -20 ° C im Dunkeln bis zur Verwendung. Oligos kann für bis zu einem Jahr in diesem Zustand gelagert werden. HINWEIS: Um die DNA-Sonden mit mutierten Bindungsstellen, mutierten Versionen von langen Oligonukleotiden geglüht mit 5&#39;Dye-markierte kurze Oligonukleotide, gefolgt von Fill-in von 5&#39;-Überhänge mit Klenow erzeugen. Es hat sich gezeigt, daß die Sonde mit einem Strang mit einem Infrarot fluoreszierenden markierten gezeigtFarbstoff nur 30% Intensität der Sonde mit den beiden mit dem Farbstoff markierten Stränge. Wenn die Signalintensität verstärkt werden muss, sind lange Oligos beider Stränge mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffen an 5&#39;-Enden markiert und geglüht Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden machen. </li></ol> 3. Herstellung von unbeschriftet / kalt Probes (Wettbewerber) Hinweis: Lange Oligonukleotide komplementäre Sequenzen (Long und LongR) mit unmarkierten Sonden zur Wettbewerbsanalyse zu machen geglüht wurden Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Sonden. <ol><li> Mix 20 ul 100 uM lang, 20 ul 100 uM LongR Oligonukleotiden und 60 &amp; mgr; l STE in einem 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Das Röhrchen wird Wasser für 5 min in kochendem, schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit dem geglüht Oligos über Nacht abkühlen. </li></ol> 4. Bindungsreaktion und Elektrophorese <ol><li> Vorbereitung 1 ml 5x Bindungspuffer um 50 &amp; mgr; l Misch60; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 ul 5 M NaCl; 200 ul 1 M KCl, 5 ul 1 M MgCl 2, 10 ul 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 ul 1 M DTT; 25 ul 10 mg / ml BSA und 695 &amp; mgr; l ddH 2 O. HINWEIS: Der 5x Bindungspuffer kann bei -20 ° C aliquotiert und gelagert werden. Ein weiterer Punkt zu beachten ist, dass verschiedene Transkriptionsfaktoren verschiedene Modifikationen an den Bindungspuffer haben. </li><li> Kurz vor dem Bindungsreaktionen einrichten, Vorlauf 5% nativen Polyacrylamidgel in 0,5x TBE + 2,5% Glycerin alle Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 V für 30 zu entfernen - 60 min, oder bis der Strom nicht ändert länger mit der Zeit. </li><li> Legen Sie die Bindungsreaktion in Endvolumen von 20 &amp; mgr; l auf. <ol><li> Mischungs 4 ul 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 ng gereinigtem Protein A (in 50% Glycerin, dh SOX-2), 1 ul 0,1 uM Farbstoff-konjugierten Sonde (Endkonzentrationentration: 5 nM) und ddH 2 O. </li><li> Optional: Wenn kalte Sonde Konkurrenten erforderlich sind, fügen verschiedene Konzentrationen (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) von kalten Sonden. </li><li> Optional: Wenn die Wechselwirkung zwischen den Proteinen A und B (dh SOX-2 und LIM-4) geprüft wird, hinzufügen von 80 bis 200 ng gereinigtem Protein B (in 50% Glycerin, dh LIM-4). </li><li> Optional: Wenn Kernextraktzubereitung verwendet wird , und spezifische Bindung von Protein A ist , validiert werden, Antikörper , der spezifisch an Protein A addieren (dh anti-6xHis, anti-FLAG, etc.). </li><li> Inkubieren bei R / T in Dunkelheit für 15 min. </li></ol></li><li> Legen Sie alle der Bindungsreaktion auf das Gel, und führen Sie das Gel bei 10 V / cm auf den gewünschten Abstand. </li></ol> 5. Imaging HINWEIS: Das Gel wurde direkt in den Glasplatten mit einer erweiterten Infrarot-Abbildungssystem abgetastet. Daher kann das Gel weiter aufgelöst werden und wiederholt (1C gescannt und <strong&gt; 2). Eine Nahinfrarot-Fluoreszenzabbildungssystem in erster Linie für Western-Blots wurde auch getestet, das Gel zu scannen, sondern nur die erweiterten Infrarot-Abbildungssystem konnte das Gel mit guter Auflösung zu scannen. Die beschriebene Methodik ist spezifisch für ein bestimmtes Infrarot-Abbildungssoftware, obwohl andere Software-Pakete verwendet werden können. <ol><li> Reinigen Sie das Bett des Scanners mit ddH 2 O und gut trocknen vor dem Scannen. Wischen Sie die Glasplatten des Gels trocknen und legen Sie die Platten, die das Gel auf dem Scannerbett. </li><li> Öffnen Sie die Infrarot-Imaging-Software und gehen Sie auf die &quot;Acquire&quot; Tab. Wenn die dünnere Platte (1 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 169 &amp; mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 1,5 mm. Wenn die dickere Platte (3 mm) auf dem Scanner-Bett gelegt wird, verwenden Sie die Einstellungen von Kanal: 700, Intensität: Auto, Auflösung: 84 &amp; mgr; m, Qualität: mittel, und Focus-Offset: 3,5 mm. Fokus-Offset ist abhängig von derDicke der Glasplatte. </li><li> Wählen Sie den Bereich, der das Gel auf dem Scanner einnimmt. Klicken Sie auf &#39;Start&#39;, um den Scanvorgang zu starten. </li><li> Wiederholen Sie die Elektrophorese und scannen zusätzlich nach Bedarf. </li></ol>

<ol><li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li>
<li>Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+probes+in+the+electrophoretic+mobility+shift+assay+to+examine+specific+dsDNA%2C+ssDNA+or+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).</li>
<li>Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+background+problems+in+nonradioactive+northern+and+Southern+blot+analyses+enables+higher+sensitivity+than+32P-based+hybridizations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations.</a> Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).</li>
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<li>Jullien, N., Herman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LUEGO%3A+a+cost+and+time+saving+gel+shift+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure.</a> Biotechniques. 51, 267-269 (2011).</li>
<li>Poulin-Laprade, D., Burrus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+Using+Radiolabeled+DNA+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes.</a> Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).</li>
<li>Ruscher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+based+non-radioactive+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay.</a> J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2+goes+beyond+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Sox2 goes beyond stem cell biology.</a> Cell cycle. , (2016).</li>
<li>Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+competitor+poly%28dI-dC%29.poly%28dI-dC%29+levels+is+advised+in+DNA-protein+interaction+studies+involving+enriched+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins.</a> Biotechniques. 20, 439-444 (1996).</li>
<li>Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+detection+of+biotin-protein+conjugates+with+a+green+fluorescent+streptavidin+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Methods%22%5BJournal%5D)">In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe.</a> Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).</li>
<li>Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+fluorescent+electrophoretic+mobility+shift+assay+improved+for+the+quantitative+and+multiple+analysis+of+protein-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).</li>
<li>Steiner, S., Pfannschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+electrophoretic+mobility+shift+assay+in+the+analysis+of+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins.</a> Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

fEMSAs sind ein leistungsfähiges Werkzeug Protein-DNA-Wechselwirkungen, und sind eine Alternative zur radioaktiven Markierung von DNA zu untersuchen. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise Infrarot-Farbstoffe sind im Handel erhältlich und bieten einen sicheren und umweltfreundlichen Verfahren im Vergleich zur radioaktiven DNA-Markierung. EMSA unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenz-Farbstoff-markierten Oligonukleotiden erfordern keine Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte und somit Zeit und Kosten im Vergleich zu ande...

EMSAs verwendet , durch Verwendung nativer Polyacrylamid - Gelelektrophorese (PAGE) Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu analysieren , um eine Mischung aus einem Protein von Interesse und eine markierte DNA - Sonde enthält , potentielle Zielstellen des Proteins 1 zu lösen. Eine DNA-Sonde mit Protein gebunden langsamer wandert mit einer freien DNA-Sonde verglichen wird, und daher verzögert in seine Wanderung durch eine Polyacrylamid-Matrix. Die radioaktive Markierung von DNA durch 32 P hat die vorherrschende Methode zur Detektion in EMSA gewesen. Obwohl die Anwendung von radioaktiven Markierung in der biochemischen Forschung vorteilhaft war, sind Methoden der alternativen DNA-Markierung mit vergleichbarer Empfindlichkeit wird aufgrund der Risiken Gesundheit und Sicherheit beschäftigt im Umgang mit Radioaktivität in Verbindung gebracht. Diese alternativen Verfahren umfassen die Konjugation von DNA mit Biotin 2 oder Digoxigenin (DIG) 3 (beide werden dann durch Chemilumineszenzsystemen erkannt), SYBR Grün - Färbung der PAGE - Gels 4,oder direkte Detektion von DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate durch das Gel 5,6 scannen. Die aufgelösten Gele von EMSA unter Verwendung von radioaktiv markierten DNA - Sonden erfordern Nachlauf Verarbeitung durch Autoradiographie Filme oder ein Phosporimager System radioaktiven Signale 1,7 erfassen. Gele EMSAs Biotin- 2 oder DIG-konjugierten 3 DNA - Sonden müssen ebenfalls verarbeitet und auf eine geeignete Membran übertragen und dann durch Chemilumineszenz 6 detektiert. SYBR grüne Färbung des Gels erfordert Nachlauf Gel - Färbung und einen fluoreszierenden Scanner 4. Da Nachlauf Gel Verarbeitungsschritte zur EMSAs unter Verwendung dieser DNA-Markierungstechniken benötigt werden, kann die aufgelöste Gel nur einmal getestet werden. Im Gegensatz dazu markierten DNA-Sonden mit Fluorophoren direkt in dem Gel in den Glasplatten durch einen Scanner detektiert werden kann. Daher können die DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten während des Laufs überwacht und analysiert werden, diedeutlich reduziert Zeit und Kosten. Die DNA-Fluoreszenzfarbstoff - Konjugate , die für EMSAs verwendet wurden , umfassen Cy3 6,8, 6,8 Cy5, Fluorescein 9 und Infrarot - Fluoreszenzfarbstoffe 4-6. Transkriptionelle Regulation erfordert Protein-DNA-Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktoren und ihre Zielgene. Die Koordination dieser Interaktionen erzeugt diverse Zelltypen aus einem gemeinsamen Vorläufer bei Tierentwicklung. Eine unvoreingenommene vorwärts genetisches Screening identifizierten eine Missense - Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG DNA-Bindungsdomäne des SOX-2 Caenorhabditis elegans Transkriptionsfaktor. Die Mutation führt zu einer Zellidentität Transformation von AWB olfaktorischen Neuronen in AWC Riechzellen auf molekularer, morphologischen und funktionellen Ebenen 5,10. SOX-2 regelt differentiell die terminale Differenzierung von AWB und AWC Neuronen mit kontextabhängigen Partner Transkriptionsfaktoren interagieren und die jeweiligenDNA - Zielstellen 5,10. SOX-2 Partner mit LIM-4 (LHX) in Terminal AWB neuronale Differenzierung, während SOX-2 Partner mit CEH-36 (OTX / OTD) in Terminal AWC neuronale Differenzierung. Luziferase - Reporter - Assays zeigen , dass SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E Proteine haben kooperative Wechselwirkungen mit Transkriptions Cofaktoren LIM-4 und CEH-36 einen Promotor in AWB und AWC Neuronen zu aktivieren. Allerdings SOX-2 und mutierten SOX-2 G73E angezeigt Differentialaktivierungseigenschaften des Promotors. Um die molekulare Basis der differentiellen DNA - Bindungsaktivitäten von SOX-2 und SOX-2 G73E untersuchen, fEMSAs wurden mit diesen Proteinen und deren potentielle Zielstellen durchgeführt. Zunächst wurde ein Ansatz Bioinformatics die biologisch relevante DNA-Bindungssequenzen innerhalb des 1 kb-Promotorregion in der Luciferase-Assay verwendet, zu identifizieren. Da mehrere potenzielle SOX-2 Bindungsstellen im gesamten Promotor anwesend waren, konzentrierten wir unsauf den vorhergesagten SOX-2-Bindungsstellen neben mutmaßlichen CEH-36 oder LIM-4-Bindungsstellen und evolutionär zwischen verschiedenen Nematodenarten konserviert. Diese Sequenzen wurden deletiert oder mutiert und anschließend in vivo auf ihre Aktivität getestet , um GFP reporter Transgenen in AWB oder AWC Neuronen exprimieren. Durch diesen Ansatz identifizierten wir Potential LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen , die speziell die für die Expression von GFP in AWB und AWC Neuronen sind jeweils 5. Wir untersuchten die möglichen Unterschiede in der DNA - Bindung von SOX-2 und SOX-2 G73E mit FEMSA mit den identifizierten LIM-4 / SOX-2 und CEH-36 / SOX-2 benachbarte Zielstellen. Unsere EMSA - Analyse zeigte , dass SOX-2 G73E nicht die DNA - Sonde hat binden die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen (erforderlich für die Genexpression in AWB) so effizient wie WT SOX-2 tat enthält. Allerdings SOX-2 und SOX-2 G73E hatte keinen Unterschied in der Bindung der DNA - Sonde die CEH-36 / SOX-2 a enthält ,djacent Zielstelle (erforderlich für die Genexpression in AWC) 5,10. Unsere FEMSA Analysen für die AWB-to-AWC Zellidentität Phänotyp Transformation in beeinflussen spezifische DNA - Bindungsaktivität mechanistischen Einblick in die Natur des SOX-2 G73E - Mutation bereitstellen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll von FEMSA unter Verwendung von gereinigtem 6xHis-SOX-2 oder 6 × His-SOX-2 G73E zusammen mit Infrarot - Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA - Sonden mit den LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen als Fallstudie in Angriff zu nehmen eine wichtige biologische Frage.

<table><tbody><tr><td>30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610158</td><td>Acrylamid ist schädlich und giftig.</td></tr><tr><td>6x-His-Epitop-Tag-Antikörper (HIS. H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 Antikörper&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA) Molekularbiologie</td> New <td>England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5'IRDye700-markierte DNA-Oligos</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>Kundenspezifisches DNA-Oligo Diese</td><td>werden im Manuskript als "5'-Farbstoff-markierte oder infrarote fluoreszierende Farbstoff-markierte DNA-Oligos" bezeichnet. Das Unternehmen wird 5'-IRDye-markierte DNA-Oligonukleotide kundenspezifisch synthetisieren. Erfordert mindestens 100&nbsp; &mu; Synthese im M-Maßstab und HPLC-Aufreinigung.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Vertikale Elektrophorese-Zelle&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>Dies wird in der Handschrift als "Mini-Protein-Gel-System" bezeichnet. Jedes elektrophoretische System kann verwendet werden, solange es sich um Klarglasplatten mit einer Größe von weniger als 25 cm x 25 cm handelt.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem</td><td>LI-COR Biotechnologie</td><td>Odyssey CLx Infrarot-Bildgebungssystem</td><td>Dies wird im Manuskript als "fortschrittliches Infrarot-Bildgebungssystem" bezeichnet.</td></tr><tr><td>Odyssey Fc Bildgebungssystem&nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>Dies wird im Manuskript als "Nahinfrarot-Fluoreszenz-Bildgebungssystem hauptsächlich für westliche Blots" bezeichnet.</td></tr><tr><td>Image Studio Software (Version 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio Software&nbsp;</td><td>Dies wird im Manuskript als "besondere Bildgebungssoftware" bezeichnet.</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x Orange Ladefarbstoff</td><td></td><td></td><td>0,25% Orange G; 30% Glycerin</td></tr><tr><td>0,5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM Tris-Borat; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x Bindungspuffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM DVB-T; 250 &#956; g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

ein optimiertes protokoll für die elektrophoretische mobilitäts-shift-assay unter verwendung von infrarot-fluoreszenzfarbstoff-markierten oligonukleotide

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA) sind eine instrumentale Werkzeug, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und deren Ziel-DNA-Sequenzen zu charakterisieren. Die Radioaktivität ist die vorherrschende Methode der DNA-Markierung in EMSA gewesen. Allerdings haben jüngste Fortschritte in der Fluoreszenzfarbstoffe und Scanverfahren die Verwendung von Fluoreszenzmarkierung von DNA als Alternative zu den Radioaktivität für den Vorteilen der leichten Handhabung Aufforderung, Zeitersparnis und reduziert die Kosten und die Verbesserung der Sicherheit. Wir haben vor kurzem fluoreszierende EMSA (FEMSA) erfolgreich adressieren eine wichtige biologische Frage verwendet. Unsere Analyse liefert FEMSA mechanistischen Einblick in die Wirkung einer Missense-Mutation, G73E, in der hochkonservierten HMG Transkriptionsfaktor SOX-2 auf olfaktorische Neuronen Typ Streuung. Wir fanden , dass mutierte SOX-2 G73E Protein spezifische DNA - Bindungsaktivität verändert, wodurch olfaktorischen Neuronen Identität Transformation verursacht. Hier stellen wir ein optimiertes und kostengünstiges Schritt-für-Schritt-Protokollfür FEMSA mit Infrarot - Fluoreszenz - Farbstoff-markierten Oligonukleotiden , die LIM-4 / SOX-2 benachbarte Zielstellen und gereinigt SOX-2 - Proteine (WT und Mutanten - SOX-2 G73E Proteine) als biologisches Beispiel enthält.

Orange G loading dye (6x: 0.12 g Orange G in 100 ml 30% Glycerol) können vor dem Laden in die Bindungsreaktion zugesetzt werden, um das Fortschreiten der Elektrophorese sichtbar zu machen. Weitere Lade- Farbstoffe Bromphenolblau einschließlich wird während des Scannens und daher interferieren Bildanalyse (1B) detektiert werden. In einigen Fällen von EMSAs, insbesondere wenn die Kernextraktzubereitung verwendet...

Wir beschreiben hier ein optimiertes Protokoll von fluoreszierenden elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assays (FEMSA) gereinigtes SOX-2-Proteine ​​zusammen mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten DNA-Sonden als Fallstudie eine wichtige biologische Frage zu bekämpfen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Nachweises besteht darin, Protein-DNA-Wechselwirkungen unter Verwendung nicht-radioaktiver Sonden zu detektieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Molekularbiologie und Biochemie zu beantworten, beispielsweise die Ermittlung der DNA-Zielsequenz von Proteinen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine einfache, sichere und zeitsparende Alternative zum Einsatz radioaktiver Sonden darstellt.Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein fünfprozentiges natives Polyacrylamidgel mit 0,5x Tris-Borat-EDTA oder TBE und 2,5 % Glycerin unter Verwendung eines Mini-Proteingel-Systems vor. Um 30 Milliliter Gellösung für vier Gele herzustellen, mischen Sie destilliertes Wasser, TBE, Ammoniumpersulfat, TEMED, Acrylamid-Bis und Glycerin. Gießen Sie die Gellösung unverzüglich ein.Nach der Polymerisation die Gele in klare Plastikfolie einwickeln, die zuvor mit 0,5x TBE vorgenässt wurde, und bei vier Grad Celsius lagern. Anschließend ein langes Oligonukleotid für etwa 51 Mere entwerfen. Komplementäre kurze Oligonukleotide für etwa 14 Mere mit Infrarot-Fluoreszenzfarbstoffmodifikation am Fünf-Prim-Ende entwerfen.Nachdem die Oligonukleotide hergestellt wurden, resuspendieren Sie diese in 1x Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 100 Mikromolar. Zum Anlassen mischen Sie 0,6 Mikroliter des 5'-Farbstoff-kurzen Oligonukleotids, 1,2 Mikroliter des langen Oligonukleotids und 28,2 Mikroliter Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen. Stellen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang in siedendes Wasser, schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit den annullierten Oligonukleotiden über Nacht im Dunkeln abkühlen.Um doppelsträngige DNA-Sonden herzustellen, mischen Sie 30 Mikroliter der annealeden Oligonukleotide mit dNTPs, Klenow-Puffer, Klenow-Fünf-Prime-Farbstoffmarke und doppelt destilliertem Wasser in einem 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen. Inkubieren Sie die Mischung 60 Minuten bei 37 Grad Celsius in einer PCR-Maschine. Geben Sie anschließend 3,4 Mikroliter 0,5 M EDTA zu, um die Reaktion zu stoppen, und inaktivieren Sie durch Erhitzen bei 75 Grad Celsius für 20 Minuten in der PCR-Maschine.Danach die gefüllten Sonden mit Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikromolar verdünnen. Die Oligonukleotide bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius im Dunkeln lagern. Zum Herstellen unmarkierter Sonden 20 Mikroliter langes Oligonukleotid, 20 Mikroliter Long-R-Oligonukleotid und 60 Mikroliter Natriumchlorid-Tris-EDTA-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen mischen.Stellen Sie das Reagenzglas fünf Minuten lang in siedendes Wasser, schalten Sie dann die Wärmequelle aus und lassen Sie das Wasser mit den annealeden Oligos über Nacht abkühlen. Bereiten Sie ein Milliliter 5x Bindungspuffer durch Mischen von Tris HCl, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, EDTA, DTT, BSA und zweifach destilliertem Wasser vor. Bevor Sie die Bindungsreaktionen aufsetzen, führen Sie das 5% native Polyacrylamidgel in 0,5x TBE und 2,5% Glycerin zur Entfernung sämtlicher Spuren von Ammoniumpersulfat bei 80 Volt 30 Minuten bis eine Stunde vor, oder bis der Strom nicht mehr zeitabhängig variiert.Mischen Sie anschließend vier Mikroliter 5x Bindungspuffer, 80 bis 200 Nanogramm gereinigtes Protein A, ein Mikroliter 0,1 Mikromolar Farbstoff-gekoppelte Sonde und doppelt destilliertes Wasser. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Inkubation laden Sie die gesamte Bindungsreaktion auf das Gel auf und führen das Gel bei 10 Volt pro Zentimeter bis zur gewünschten Distanz durch. Decken Sie die Gelelektrophoresevorrichtung mit Aluminium ab, um das Gel so gut wie möglich vor Licht zu schützen. Reinigen Sie das Scannerglas eines Infrarot-Bildgebungssystems mit destilliertem Wasser. Wischen Sie die Glasplatten, die das Gel enthalten, trocken und legen Sie sie auf das Scannerglas.Öffnen Sie die Infrarot-Bildgebungssoftware, und klicken Sie auf den Reiter „Erfassen“. Verwenden Sie für dickere Platten die Einstellungen 700 für den Kanal, automatisch für die Intensität, 84 Mikrometer für die Auflösung, mittel für die Qualität und 3,5 Millimeter für die Fokusverschiebung. Wählen Sie den Bereich aus, den das Gel auf dem Scanner einnimmt.Klicken Sie abschließend auf „Start“, um den Scan zu beginnen. Der Fortschritt der Elektrophorese kann mit dem Orange-G-Ladefarbstoff sichtbar gemacht werden, während Bromphenolblau während des Scannens detektiert wird und daher die Bildanalyse stört. Die Zugabe von dI-dC zur Bindungsreaktion unterband die Bindung des gereinigten 6xHis-SOX-2 an die mit Farbstoff markierten DNA-Proben am 5′-Ende.Die LIM-4-Mutante und die kalte Sonde von SOX-2, die in der LIM-4-Bindungsstelle mutiert ist, wirkt ebenso effizient wie die Wildtyp-kalte Sonde bei der Konkurrenz mit der mit Infrarotfarbstoff markierten Sonde um die Bindung an 6xHis-SOX-2. Die Konkurrenzwirkung der kalten Sonde mit Mutationen in der SOX-2-Bindungsstelle hingegen ist jedoch deutlich geringer als die der Wildtyp-kalten Sonde bei der Bindung an 6xHis-SOX-2. Supershift-Assays des SOX-2-DNA-Komplexes unter Verwendung von 6xHis- und Flag-Epitopen führten zu einem supershifteten SOX-2-DNA-Band.Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis vier Stunden durchgeführt werden. Während des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Infrarotsonden im Dunkeln zu halten. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die CRISPR-Cas9-Genomeditierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zur Bedeutung einer bestimmten DNA-Bindesequenz.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Biochemie den Weg, um Protein-DNA-Wechselwirkungen in verschiedenen Modellorganismen zu untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Protein-DNA-Wechselwirkungen mithilfe nicht-radioaktiver DNA-Markierungen bestimmt werden können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Acrylamid äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung stets beachtet werden sollten, während dieses Verfahren durchgeführt wird.

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt die Methode zur Analyse der Protein-Liganden-Interaktion durch Mobilitätsverschiebungs-Affinitäts-Kapillarelektrophorese. Diese Methode kann verwendet werden, um das Bindungsverhalten eines Proteins mit verschiedenen geladenen Liganden zu charakterisieren.

Mobilitätsverschiebung Affinitätskapillarelektrophorese: Eine Methode zur Analyse von Proben-Liganden-Wechselwirkungen in Abhängigkeit von der differentiellen Migration von Protein-Liganden-Komplexen

In diesem Video demonstrieren wir den elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay zum Nachweis von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Infrarot-Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden. Wenn das Protein an die DNA-Sonde bindet, bildet es einen großen Komplex, der langsam weiterwandert und als verschobene Bande auf dem Gel erscheint.

Elektrophoretischer Mobilitäts-Shift-Assay zum Nachweis von Transkriptionsfaktor-DNA-Komplexen

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

Internalisierung und Beobachtung von Fluoreszenz Biomoleküle in lebenden Mikroorganismen durch Elektroporation

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur RNA / Protein-Interaktionen zu untersuchen. Elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) auf der differentielle Migration RNA / Protein-Komplexe und freie RNA während nativer Gelelektrophorese. Durch Verwendung eines radioaktiv markierten RNA-Sonde kann RNA / Protein-Komplexe durch Autoradiographie visualisiert werden.

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) für das Studium von RNA-Protein-Wechselwirkungen: Die IRE / IRP Beispiel

Wir präsentieren einen strategischen Plan und ein Protokoll zur Identifizierung nicht-kodierender genetischer Varianten, die die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors (TF) beeinflussen. Es wird ein detailliertes experimentelles Protokoll für die elektrophoretische Mobilitätsverschiebungs-Assay (EMSA) und den DNA-Affinitäts-Präzipitations-Assay (DAPA) der Genotyp-abhängigen TF-DNA-Bindung bereitgestellt.

Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein grundlegendes Instrument zur Analyse von RNA-Protein-Wechselwirkungen. Traditionell haben die meisten Experimente vertikale Gele verwendet. Jedoch bieten horizontale Gele mehrere Vorteile, wie die Möglichkeit, Komplexe während der Elektrophorese zu überwachen. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung und Verwendung von horizontalen nativen Gelelektrophorese zur Verfügung.

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der DNA-Polymerase Synthese von modifizierten DNA durch Beobachtung der Veränderungen an der Nah-Infrarot-Eindringmittel beschrifteten DNA mittels Gelelektrophorese und Gel-Bildgebung. Acrylamid Gele werden für hochauflösende Bildgebung der Trennung von kurzen Nukleinsäuren verwendet, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Abhängigkeit von Größe zu migrieren.

DNA-Polymerase-Aktivität Assay mit Nahinfrarot-Leuchtstoff beschrifteten DNA durch Acrylamid Gelelektrophorese sichtbar gemacht

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Thiazole orange für den Nachweis von DNA in Gel-Elektrophorese Experimente verwenden. Die Verwendung von Thiazole Orange ermöglicht Beseitigung der Interkalation Bromid und Fluoreszenz-Detektion mit UV oder blaues Licht erreicht werden.

DNA-Elektrophorese mit Thiazole Orange statt Interkalation Bromid oder Alternative Farbstoffe

Hier werden Protokolle für biochemische In-vitro-Tests mit Biotin-Etiketten vorgestellt, die für die Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen weit verbreitet sein können.

In Vitro biochemische Assays mit Biotin-Etiketten zur Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen

Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Lernen Sie ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay mit infrarot-fluoreszierenden Oligonukleotiden. Diese nicht-radioaktive Methode ermöglicht sichere und effiziente Analysen von Protein-DNA-Interaktionen.

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide (Video) | JoVE Journal

Ein optimiertes Protokoll für die elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay unter Verwendung von Infrarot-Fluoreszenzfarbstoff-markierten Oligonukleotide

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