Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Um Wechselwirkungen zwischen heteromeren Proteinkomplexen, an denen mehrere Proteine beteiligt sind, mit Ziel-DNA unter Verwendung des modifizierten Hefe-One-Hybrid-Assays nachzuweisen, entnehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die die gewünschte Konzentration einer aktiv wachsenden, transformierten Hefezellkultur enthält.

Diese Zellen enthalten eine spezifische DNA-Sequenz stromaufwärts des Reporter- β-Galactosidase-kodierenden Gens, die vom GAL-4-Promotor gesteuert wird, während ihnen das endogene GAL-4-Transkriptionsfaktor-Protein fehlt. Die Zellen exprimieren ein Zielprotein, das mit der GAL-4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, und ein weiteres Protein, dem die GAL-4-DNA-Bindungsdomäne fehlt.

Wenn diese Proteine interagieren, könnten sie einen Komplex bilden, der es dem Zielprotein ermöglicht, an die vorgeschaltete DNA-Sequenz in der Promotorregion des Reportergens zu binden. Die GAL-4-Aktivierungsdomäne aktiviert die Expression von Reporter- β-Galactosidase-Enzymen.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Puffer. Frosten und tauen Sie die Zellen auf, um sie zu lysieren und β-Galactosidase freizusetzen. Fügen Sie Beta-Mercaptoethanol und einen β-Galactosidase-Substrat enthaltenden Puffer hinzu.

Beta-Mercaptoethanol stabilisiert das Enzym β-Galactosidase. β-Galactosidase hydrolysiert das β-Galactosidase-Substrat und bildet ein gelbes Chromogen.

Fügen Sie Natriumcarbonatlösung hinzu, um β-Galactosidase zu denaturieren und die Reaktion zu stoppen. Zentrifuge. Den Überstand, der gelbes Chromogen enthält, auf eine Multi-Well-Platte übertragen. Messen Sie mit einem Plattenlesegerät die optische Dichte der Lösung bei einer geeigneten Wellenlänge, um die β-Galactosidase-Aktivität zu berechnen.

Eine höhere β-Galactosidase-Aktivität deutet auf positive Wechselwirkungen zwischen den Proteinen und der Ziel-DNA-Sequenz hin, was zu einer β-Galactosidase-Expression führt.

Suspendieren Sie die Kultur wieder und übertragen Sie 125 Mikroliter aus jeder Vertiefung auf eine Spektralphotometerplatte. Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern, um sicherzustellen, dass sie zwischen 0,3 und 0,6 liegt. Die restlichen Zellen im Deep-Well-Block bei 3.000 mal g und 21 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen.

Geben Sie 200 Mikroliter Z-Puffer in jede Vertiefung und jeden Vortex. Zentrifugieren Sie bei 3.000 mal g und 21 Grad Celsius für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand durch Umdrehen. Geben Sie 20 Mikroliter Z-Puffer in jede Vertiefung und jeden Vortex. Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab, die gegen Frost-Tau-Zyklen beständig ist.

Führen Sie in einem Abzug vier Gefrier- und Auftauzyklen mit flüssigem Stickstoff in einem 42 Grad Celsius warmen Wasserbad durch. Geben Sie 200 Mikroliter frisch zubereitete Z-Puffer/Beta-Mercaptoethanol/ONPG-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius für 17 bis 24 Stunden oder bis sich die Farbe entwickelt. Prüfen Sie, ob sich die Farbe entwickelt hat.

Geben Sie 110 Mikroliter 1 molaren Natriumcarbonat in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Notieren Sie die Zeit und wirbeln Sie die Platte. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 3.000 g und 21 Grad Celsius. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 125 Mikroliter Überstand aus jeder Vertiefung auf eine Spektralphotometerplatte zu übertragen. Messen Sie die optische Dichte bei 420 Nanometern.