Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Um Wechselwirkungen zwischen heteromeren Proteinkomplexen, an denen mehrere Proteine beteiligt sind, mit Ziel-DNA unter Verwendung des modifizierten Hefe-One-Hybrid-Assays nachzuweisen, entnehmen Sie eine Multi-Well-Platte, die die gewünschte Konzentration einer aktiv wachsenden, transformierten Hefezellkultur enthält.

Diese Zellen enthalten eine spezifische DNA-Sequenz stromaufwärts des Reporter- β-Galactosidase-kodierenden Gens, die vom GAL-4-Promotor gesteuert wird, während ihnen das endogene GAL-4-Transkriptionsfaktor-Protein fehlt. Die Zellen exprimieren ein Zielprotein, das mit der GAL-4-Aktivierungsdomäne fusioniert ist, und ein weiteres Protein, dem die GAL-4-DNA-Bindungsdomäne fehlt.

Wenn diese Proteine interagieren, könnten sie einen Komplex bilden, der es dem Zielprotein ermöglicht, an die vorgeschaltete DNA-Sequenz in der Promotorregion des Reportergens zu binden. Die GAL-4-Aktivierungsdomäne aktiviert die Expression von Reporter- β-Galactosidase-Enzymen.

Zentrifuge. Resuspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Puffer. Frosten und tauen Sie die Zellen auf, um sie zu lysieren und β-Galactosidase freizusetzen. Fügen Sie Beta-Mercaptoethanol und einen β-Galactosidase-