צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

פרוטוקול זה מסביר את השלבים הדרושים לביצוע מיקרו-דיסקציה, צביעה אימונופלואורסצנטית שלמה ומיקרוסקופיה במיוחד עבור צומת הסינוס וצומת ה-AV בעכבר. המתודולוגיה השלמה מועילה להתייחסות ללוקליזציה ולמורפולוגיה התלת-ממדית המדויקת של הסינוס וצומת ה-AV ולבחינת הקשר עם הרקמה שמסביב. מורפולוגיה של הרקמות נשמרת במידה ניכרת עם התייבשות מינימלית של רקמות וקרע פיזי בלבד.

כדי להתחיל, נקבו את הלב עם מחט בקוטר 27 באזור הקודקוד על ידי דחיפה זהירה של המחט לחדר השמאלי והזרקה עדינה של חמישה עד 10 מיליליטר PBS קר כקרח כדי להגדיל את הלב. מרימים בזהירות את הלב בעזרת פינצטה וחותכים את כלי הדם הגדולים כדי להסיר את הלב. הכניסו את הלב לצלחת חיתוך מלאה ב-PBS קר כקרח מתחת למיקרוסקופ הניתוח.

לאחר קביעת כיוון הלב, סובב את הלב כך שקדמת הלב תהיה בתחתית המנה. שתק את הלב על ידי הכנסת סיכות קטנות דרך הקודקוד והנספח הפרוזדורי לתוך האגרוז בתחתית צלחת הדיסקציה. בעזרת פינצטה עדינה ומספריים הסר בזהירות רקמה שאינה לבבית סביב הווריד הנבוב העליון והתחתון.

כדי לחשוף את האזור הבין-קאבלי, הסר את רוב החדרים על ידי חיתוך במקביל לחריץ שבין החדרים לפרוזדורים בעזרת מספריים מיקרו. לקיבוע והתייבשות הכניסו את הדגימה ל-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הלב לתמיסת סוכרוז של 15% ודגרו אותו למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה העבירו את הלב לתמיסת סוכרוז 30% למשך 24 שעות נוספות בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הלב ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS. לאחר מכן חסום וחלחל אותו בתמיסת חסימה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

הניחו את הלב בצינור של 1.5 מיליליטר ודגרו עליו עם נוגדנים נגד עכברים של ארנב Connexin 43 ונוגדנים נגד עכברים HTN4 של חולדות מדוללים בתמיסה חוסמת במשך שבעה ימים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שבעה ימים, הסר את התמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים באמצעות פיפטה. שטפו את הלב עם תמיסת 1% Triton X-100 שלוש פעמים למשך שעה אחת בכל שטיפה בשייקר המסלול.

חזור על שלבי הכביסה לאחר הדגירה עם נוגדנים משניים ו-DAPI. לאחר הכנת טבעות פלסטיק ומילוין בפלסטלינה, הכניסו את הלב לחריץ הפלסטלינה כשגב הלב פונה כלפי מעלה. זהה את ה-SAN, הממוקם בצד הגבי של הלב עם האזור הבין-קבלי.

הוסף PBS ללב כדי להוציא את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו ב-PBS. מרחו סיליקון על שולי טבעת הפלסטיק. לחץ בעדינות על החלק שמסביב של הדגימה לתוך הפלסטלינה כדי לתקן את הלב ולכסות את הלב בתלוש כיסוי.

לאחר מכן לחץ בעדינות על הצד האחורי של הפלסטלינה כדי לסחוט חלק מה-PBS ולחבר את הלב להחלקת הכיסוי תוך הקפדה על הימנעות מבועות אוויר באזור ההדמיה. מקם את דגימות הצביעה הפוכות על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי והמשך בהדמיה כמתואר בכתב היד הטקסט. הפרמטרים עבור כל ערוץ של המיקרוסקופ הקונפוקלי נקבעים באמצעות התוכנה המתאימה.

פרוטוקול זה שימש לביצוע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית הן של הצומת הסינו-פרוזדורי והן של הצומת האטריו-חדרי בלבבות עכברים. צביעה ספציפית של מערכת ההולכה ושריר הלב העובד עם נוגדנים פלואורסצנטיים, המכוונים ל-HCN4 ו-Connexin 43 בהתאמה מאפשרים לזהות את הצומת הסינו-פרוזדורי ואת הצומת האטריו-חדרי בתוך האנטומיה השלמה. פרוטוקול צביעה שלם זה מאפשר לחקור את האינטראקציה בין סוגי תאים שונים באמצעות נוגדנים שונים.