ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את הבשלת המיו-פיאל והקרדיומיוציטים בלב העכבר העוברי המתפתח. זה מושג על ידי כיוון והקפאה ראשונית של הלב העוברי במדיום חיתוך. לאחר מכן, הלב נחתך בהקפאה בכיוון הנכון.

לאחר מכן חלקי הלב עוברים תיוג אימונו-פלואורסצנטי של חלבונים מעניינים. לבסוף, מתבצעת מיקרוסקופיה קונפוקלית של קטעי לב כתם חיסוני. בסופו של דבר, ניתוחי תמונה דו מימדיים ותלת מימדיים משמשים כדי להראות את התפתחות MyFi ומבני קרדיומיוציטים אחרים.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התפתחות הלב, כגון כיצד מוטציות וגנים לבביים משפיעים על הרכבת MyFi והופעתם של מבנים ספציפיים כגון דיסקים משולבים ולקוחות. כדי להקפיא לבבות עובריים השתמש בטמפרטורת חיתוך אופטימלית או במדיום OCT כדי למלא צלחת פטרי בגודל 3.5 סנטימטר במכסה מנוע כימי. קריר. שני מתיל בוטאן בחנקן נוזלי.

לאחר בידוד לבבות עובריים של עכברים על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את הלבבות ב-OCT ואפשרו להם להתייצב למשך מספר שניות לפני העברתם לתבנית של שבעה מילימטרים המכילה OCT. כוונו את הדופן הפנימית של הלב לתחתית התבנית. מניחים בעדינות את התבנית לתוך החנקן הנוזלי מקורר שני מתיל בוטאן.

הקפד לא לאפשר לשני נוזלי המתיל בוטאן לגעת ב-OCT או לקפוא את הלב עד שה-OCT הופך לבן מוצק. לאחר מכן העבירו את התבנית לדלי קרח המכיל קרח יבש. לאחר שכל הלבבות קפואים, עוטפים את תבניות הקריו בנייר כסף ומאחסנים אותן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להקפאה.

כדי לתקן לבבות עובריים, השתמש ב-4% PFA ב-PBS כדי למלא את הבארות של צלחת תרבית נייר כסף 12. לאחר ניתוח הלבבות העובריים על פי פרוטוקול הטקסט, הכניסו כל לב לבאר של PFA וקבעו בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להגן על הלבבות באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק, העבירו כל לב לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל 1.5 מיליליטר של 15% סוכרוז ב-PBS וערבבו בעדינות בארבע מעלות צלזיוס עד שהלב שוקע לתחתית הצינור. העבירו כל לב ל-30% סוכרוז ב-PBS וערבבו בעדינות בארבע מעלות צלזיוס עד שהלב שוקע לתחתית הצינור.

הקפיאו את העוברים ב-OCT כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר הכנסת תבניות קריו לתא הקריוסטט והשוואה ל-17 מעלות צלזיוס שליליות, הפוך את תבנית הקריו והשתמש בלחץ עדין כדי להוציא את גוש הלב מהתבנית. כוון את הדופן הקדמית של הלב לחלק העליון של גוש הרקמה המעוצב

הניחו טיפה גדולה של OCT על הצ'אק והרכיבו את בלוק הלב על טיפת ה-OCT. שמירה על הכיוון כך שהדופן הקדמית של הלב תהיה הרחוקה ביותר מהצ'אק. הניחו ללב לקפוא על הצ'אק.

טען את הצ'אק ואת בלוק הלב המותקן על מחזיק החפץ הקריוסטט. התאם כך שזווית הלהב תהיה שלוש עד חמש מעלות ביחס לדגימה. אסוף 10 מקטעים של מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ שטופלו מראש בציפוי טעון חיובית.

הניחו לדגימות להתייבש לחלוטין לפני האחסון בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס כדי לבצע אימונופלואורסצנטיות. לאחר תיקון ו/או הסרת OCT מקטעים, השתמש במאגר חוסם אחד מדולל ב-PBS כדי לחסום למשך 45 דקות בניעור עדין. אם משתמשים בנוגדנים ראשוניים שנוצרו בעכבר, הוסיפו חמור או עז נגד עכבר IgG H בתוספת L שבר FAB חד ערכי מדולל אחד עד 100 ב-PBS 0.1% עד 20 ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות בניעור עדין.

הוסיפו נוגדנים ראשוניים או נוגדנים מדוללים במאגר חוסם אחד, ודגרו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, השתמש ב-XPBS אחד כדי לשטוף את החלקים שלוש פעמים למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר תוסף מצומד נוגדן משני מדולל אחד עד 500 במאגר חוסם לדגימות ודגירה מוגנת מאור למשך שעתיים.

בטמפרטורת החדר, השתמש ב-XPBS אחד כדי לשטוף את החלקים בטמפרטורת החדר שלוש פעמים למשך 10 דקות מוגנים מפני אור. הרכיבו את השקופיות במדיום נגד דהייה על ידי הנחת שתי טיפות של מדיום על כל קצה השקופית והשתמשו בהחלקת כיסוי לכיסוי. השתמש בלק כדי לאטום את החלקות הכיסוי.

אחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס, מוגן מאור עד שהוא מוכן לצילום. באמצעות מטרה פי ארבעה ופלואורסצנטי לייזר, מצא את הדגימה ואת אזור העניין. צלם את התמונה לשימוש כמפה.

בעת הדמיה בהגדלה גבוהה. הסר את השקופית תוך ביצוע התאמות מינימליות לשלב השקופיות. לאחר מכן שנה ליעד טבילה של 60x שמן.

הניחו טיפת שמן קטנה על המטרה והחליפו את השקופית על השקופית tagה. לאחר מכן, מצא שוב את הדגימה, הגדר את זמן החשיפה לכוח הלייזר ואת השילוב לרמות הרצויות עבור כל ערוץ. לאחר קביעת ההגדרות האופטימליות על פי ההנחיות של פרוטוקול הטקסט, השתמש בהגדרות הדגימה עבור כל חלקי הרקמה בניסוי.

השתמש בהיסטוגרמה של העוצמה כדי לציין את טווח העוצמה האופטימלי עבור כל ערוץ, שישמש לניתוח. צור Zack באמצעות פונקציית הרכישה על ידי בחירת ערוצי הלייזר המתאימים. לאחר מכן בחר את הגבולות העליונים והתחתונים של מחסנית Z.

בחר גודל צעד Zack שהוא מחצית מהערך של עובי הפרוסה האופטית המסופקת על ידי התוכנה. לחץ על הפעל כדי לאסוף את התמונות באמצעות פיג'י או תוכנה מקבילה לניתוח תמונות. פתח את קובץ Zack עם אפשרות מצב צבע מותאם אישית והערוצים התפצלו לחלונות נפרדים.

מהתפריט הנפתח של התמונה, פתחו את הכלי התאמת ניגודיות בהירות ובכל ערוץ קבעו את טווח עוצמת ההיסטוגרמה האופטימלי. כפי שנקבע קודם לכן, החל טווחי ערוצים אלה על כל Zacks המנותחים. לאחר מכן, מצבע התמונה, משוך למטה, מיזג את הערוצים הבודדים לתמונה מורכבת אחת.

בעזרת תפריט הפרויקט Stacks Z של תמונות, צור אוסף Z שטוח מהתמונה ללא הפרדות צבע. מכיוון שתמונה זו תהיה בהירה יותר באופן משמעותי מתמונת התלת-ממד, התאם את טווח עוצמת ההיסטוגרמה עבור דגימת הבקרה כדי למנוע רוויית יתר והחל את אותן הגדרות על Zack השטוח הניסיוני כדי ליצור תמונה תלת מימדית, בחר תחילה בתפריט פרויקט תלת מימד של אוסמות תמונות. בחר את ציר x או את ציר הסיבוב Y.

קבעו את ריווח הפרוסות כמספר מיקרונים זהה לגודל הצעד של מחסנית Z. בחר את הסיבוב הכולל הרצוי והגדר את תוספת זווית הסיבוב לאחת. לאחר מכן פתח את מציג התמונה J 3D מהתפריט הנפתח של התוספים.

בחר את התצוגה שנוצרה בתמונה ללא הפרדות צבע כנפח והגדר את גורם הדגימה מחדש לאחד או שניים. נתונים אלה מראים תוצאות אופייניות לצביעה של חלבונים שונים בלב קפוא, לב קבוע אצטון, הנוגדן כנגד S אלפא אקטינין המסומן באופן שחזורי דיסקי Z, ובדיסקים משולבים עם ספציפיות גבוהה ורקע מינימלי. הנוגדן כנגד חלבון צומת ההיצמדות בטא-קטנין קשר את הממברנה של תאים קרדיומיוציטים ותאים שאינם קרדיומיוציטים וקולוקליזציה עם SFA אקטינין התרחשה בדיסקים משוערים ב-E 16.5 בטא אחד אימונופלואורסצנציה אינטגרין בלב העוברי היא מאתגרת במיוחד, אך צביעת אינטגרין בטא אחד במחקרים אלה חשפה אות באותה מחזוריות כמו דיסקי Z של SFA אקטינין, אולי משקף לקוחות מתהווים שנוצרו ב-E 16.5.

ב-E 12.5, דפוס הצביעה של SFA אקטינין וטרופו מיצין הראה מחזוריות קבועה בקרדיומיוציטים טרבקולריים התואמים למיופיברילים בוגרים באזור הקומפקטי החיצוני SFA אקטינין היה יותר מנוקב מאשר ליניארי ואות הטרופו מיוזין היה מפוזר ולא ליניארי צביעה דבקה ב-NCA וקרדיומיוציטים טרבקולריים בלבבות E 12.5 במקביל לאזורים של צביעת אקטינין SFA אינטנסיבית המייצגת אולי דיסקים משולבים. מוצג כאן לב עוברי קבוע PFA E 12.5 המסומן עבור אקטינין SFA ואקטון חוטי ממעשה חיים RFP Ruby עכבר טרנסגני. יחס האקטין לרעש של SFA ירד בהשוואה לקטעי לב קפואים.

שחזור תמונה תלת מימדית גילה כי MyFi בתוך קרדיומיוציטים היו מקבילים בערך זה לזה, אך קרדיומיוציטים בודדים היו מכוונים בזוויות שונות ביחס זה לזה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכוון נכון ולחתוך לבבות עובריים, כמו גם לבצע צביעה חיסונית, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה כדי להעריך את התבגרות MyFi וקרדיומיוציטים במהלך התפתחות לב העכבר. להודות.