ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את הבשלות של התאים השריריים (myofibrils) והקרדיומיוציטים בלב עוברי של עכבר בהתפתחות. זאת על ידי יישור והקפאה ראשונית של הלב העוברי במדיום חיתוך. לאחר מכן, הלב נחתך בשיטת קריו-סection (cryosectioning) בכיוון המתאים.

לאחר מכן, נתחי הלב עוברים סימון אימונופלוורסצנטי של חלבוני העניין. לבסוף, מבוצעת מיקרוסקופיה קונפוקלית של נתחי הלב הצבועים אימונולוגית. בסופו של דבר, נעשה שימוש בניתוחי תמונה דו-ממדיים ותלת-ממדיים כדי להראות את התפתחות ה-MyFi ומבני קרדיומיוציטים אחרים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום ההתפתחות של הלב, כגון כיצד מוטציות וגנים של הלב משפיעים על הרכבת MyFi ועל הופעתם של מבנים ספציפיים כגון דיסקים מקושרים (intercalated discs) וקוסטמרים (costamers). כדי לבצע הקפאה מהירה של לבבות עובריים, השתמשו במדיום OCT (optimal cutting temperature) למילוי של Petri dish בקוטר 3.5 סנטימטר בתוך מ মাপסת כימית. קררו 2-מתיל בוטאן בחנקן נוזלי.

לאחר בידוד לבבות עובריים של עכברים לפי הפרוטוקול הכתוב, מקמו את הלבבות ב-OCT והמתינו מספר שניות לאיזון לפני העברתם לתבנית של שבעה מילימטרים המכילה OCT. כוונו את הדופן הפנימית של הלב אל תחתית התבנית. מקמו בעדינות את התבנית בתוך 2-methylbutane מקורר בחנקן נוזלי.

הקפידו שלא לאפשר לנוזל ה-2-methyl butane לגעת ב-OCT או בלב הקפוא עד שה-OCT הופך ללבן מוצק. לאחר מכן, העבירו את התבנית לדלי קרח המכיל קרח יבש. לאחר שכל הלבבות קפאו, עטפו את תבניות הקריו בנייר אלומיניום ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- °C עד למועד ביצוע החיתוכים הקריוגניים.

לקיבוע לבבות עובריים, השתמשו ב-4% PFA ב-PBS למילוי בארי באלוחה של פלטת תרבית בת 12 בארי. לאחר הוצאת הלבבות העובריים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו כל לב בתוך באר של PFA וקבעו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה. כדי להגן על הלבבות מפני קפיאה (cryoprotection), העבירו באמצעות פיפטת העברה מפלסטיק כל לב למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכילה 1.5 מיליליטר של 15% Sucrose ב-PBS, ונערה בעדינות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שהלב שוקע לתחתית המבחנה. העבירו כל לב ל-30% sucrose ב-PBS ונערה בעדינות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שהלב שוקע לתחתית המבחנה.

הקפיאו את העובריים ב-OCT כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר הנחת תבניות ההקפאה בתא הקריוסטט והבאת הטמפרטורה ל-17- מעלות צלזיוס, הפכו את תבנית ההקפאה והפעילו לחץ עדין כדי להוציא את בלוק הלב מהתבנית. כוונו את הדופן הקדמית של הלב לכיוון החלק העליון של בלוק הרקמה המקובע.

הניחו טיפה גדולה של OCT על הצ'אק (chuck) והניחו את בלוק הלב על טיפת ה-OCT. שמרו על אוריינטציה שבה הדופן הקדמית של הלב רחוקה ככל האפשר מהצ'אק. המתינו עד שהלב יקפא על הצ'אק.

הניחו את הצ'אק ואת בלוק הלב המותקן על תומך הדגימות של הקריוסטט. כווןו כך שזווית הלהב תהיה של שלושה עד חמישה מעלות ביחס לדגימה. אספו נתחים בעובי 10 µm על גבי שקופיות מיקרוסקופ שעברו טיפול מקדים בציפוי בעל מטען חיובי.

יש להניח לדגימות להתייבש לחלוטין לפני האחסנה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לצורך ביצוע אימונופלואורסצנציה. לאחר קיבוע ו/או הסרת OCT מהחתכים, השתמשו בתמיסת חסימה (blocking buffer) בריכוז 1x המדוללת ב-PBS לחסימה למשך 45 דקות תוך써 ניעור עדין. במידה שנעשה שימוש בנוגדן ראשוני שהופק בעכבר, הוסיפו donkey או goat anti mouse IgG H plus L monovalent FAB fragment המדולל ביחס של 1:100 ב-PBS עם 0.1% tween 20, והדגרירו בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות תוך ניעור עדין.

הוסיפו נוגדן ראשוני או נוגדנים ראשוניים המדוללים בבופר חסימה (blocking buffer) בריכוז 1x, והדגרימו למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או במעלות 4°C למשך הלילה. לאחר ההדגירה, השתמשו ב-1x PBS לשטיפת הסעיפים שלוש פעמים למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הוסיפו לדגימות נוגדן משני מזווג המדולל ביחס של 1:500 בבופר חסימה, והדגרימו למשך שעתיים תחת הגנה מאור.

בטמפרטורת החדר, השתמשו ב-XPBS כדי לשטוף את החתכים בטמפרטורת החדר שלוש פעמים למשך 10 דקות, תוך הגנה מאור. הצמידו את השקופיות באמצעות תמיסת anti fade על ידי הנחת שתי טיפות מהתמיסה בכל קצה של השקופית, וכסו באמצעות כיסוי זכוכית. השתמשו בלק לציפורניים כדי לאטום את כיסויי הזכוכית.

אחסן את הדגימה בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius, במיגון מאור, עד למועד הדמיון. באמצעות עדשה של 4x ופלוורסצנציית לייזר, אתר את הדגימה ואת האזור המבוקש. צלם תמונה שתשמש כסימני דרך (map).

בעת ביצוע הדמיה בהגדלה גבוהה, הוצא את השקף תוך ביצוע התאמות מינימליות לבמה. לאחר מכן, עבור לעדשה אובייקטיבית של 60 x עם טבילת שמן.

הניחו טיפה קטנה של שמן על העדשה והחזירו את הפיתח לסביבת הבמה. לאחר מכן, אתרו שוב את הדגימה והגדירו את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה וה-binning לרמות הרצויות עבור כל ערוץ. לאחר קביעת ההגדרות האופטימליות בהתאם להנחיות של הפרוטוקול הכתוב, השתמשו בהגדרות הדגימה אלו עבור כל חתכי הרקמה בניסוי.

השתמשו בהיסטוגרמת העוצמה כדי לקבוע את טווח העוצמה האופטימלי עבור כל ערוץ, אשר ישמש לניתוח. צרו Z stack באמצעות פונקציית הרכישה על ידי בחירת ערוצי הלייזר המתאימים. לאחר מכן, בחרו את הגבול העליון והתחתון של ה-Z stack.

בחרו גודל צעד (step size) ב-Zack שהוא מחצית מערכו של עובי הפרוסה האופטית המסופק על ידי התוכנה. לחצו על run כדי לאסוף את התמונות באמצעות Fiji או תוכנה מקבילה לניתוח תמונות. פתחו את קובץ ה-Zack עם אפשרות למצב צבע מותאם אישית והפרידו את הערוצים לחלונות נפרדים.

מתפריט התמונה (image), פתחו את כלי כוונון הבהירות והניגודיות (adjust brightness contrast) ובכל ערוץ הגדירו את טווח העוצמה האופטימלי של ההיסטוגרמה. כפי שנקבע מראש, יישמו טווחי ערוצים אלו על כל ה-Zacks המנותחים. לאחר מכן, מתפריט צבע התמונה (image color), מיזגו את הערוצים הבודדים לתמונה מורכבת אחת.

השתמש בתפריט Image Stacks Z project כדי ליצור Z-stack שטוח מהתמונה המורכבת. מכיוון שתמונה זו תהיה בהירה משמעותית מהתמונה התלת-ממדית, התאם את טווח העוצמה של ההיסטוגרמה עבור דגימת הביקורת כדי למנוע רוויית יתר, והחל את אותן ההגדרות על ה-Z-stack השטוח של הדגימה הניסויית. כדי להפיק תמונה תלת-ממדית, בחר תחילה בתפריט Image Stacks 3D project. בחר בציר ה-x או בציר ה-Y כציר הסיבוב.

הגדירו את המרווח בין הפרוסות (slice spacing) כמספר המיקרונים של גודל הצעד בערימת ה-Z (Z stack step size). בחרו את סך הסיבוב הרצוי והגדירו את גודל קפיצת זווית הסיבוב לאחד. לאחר מכן, פתחו את ה-image J 3D viewer מתוך תפריט הנגלש של התוספים (plugins).

בחרו בתצוגה של תמונה מורכבת שנוצרה כנפח (volume) והגדירו את מקדם הדגימה מחדש (resampling factor) לאחד או שתיים. דמויות אלו מציגות תוצאות טיפוסיות לצביעה משולבת של חלבונים שונים בלב שהוקפא במהירות וקובע באצטון; הנוגדן נגד S alpha actinin סימן באופן עקבי דיסקים Z ובדיסקים משובצים (intercalated discs) בסגוליות גבוהה ועם רקע מינימלי. הנוגדן נגד חלבון צומת ההיצמדות beta-catenin נקשר לממברנה של קרדיומיוציטים ותאים שאינם קרדיומיוציטים, וקו-לוקליזציה עם SFA actinin התרחשה בדיסקים משובצים משוערים בשלב E 16.5. אימונופלורסנציה של beta one Integrin בלב עוברי היא מאתגרת במיוחד, אך צביעה של beta one integrin במחקרים אלו חשפה אות עם אותה מחזוריות של דיסקים Z שסומנו על ידי SFA Actinin, מה שעשוי לשקף קוסטמרים (costamers) ראשוניים שנוצרים ב-E 16.5.

בשלב E 12.5, דפוסי הצביעה של SFA actinin ו-tropomyosin הראו מחזוריות סדירה בתאי שריר הלב הטרבכולריים, באופן העולה עם סיבי שריר (myofibrils) בשלים באזור הקומפקטי החיצוני; ה-SFA actinin היה נקודתי יותר מאשר קווי, ואות ה-tropomyosin היה מפוזר במקום להיות קווי. צביעה של NCA adherent ותאי שריר לב טרבכולריים בלבבות בשלב E 12.5 נמצאו במיקום משותף עם אזורים של צביעה עזה של SFA actinin, מה שעשוי לייצג דיסקים בינתיים (intercalated discs). מוצג כאן לב עוברי בשלב E 12.5 מקובע ב-PFA, המסומן עבור SFA actinin ו-filamentous actin מעכבר טרנסגני life act RFP Ruby. יחס אות לרעש של SFA actin היה נמוך יותר בהשוואה לחתכי לב שהקפאו באופן מהיר (snap frozen).

שחזור תמונה תלת-ממדי חשף כי סיבי שריר הלב (MyFi) בתוך תאי שריר לב (cardiomyocytes) היו מקבילים בקירוב זה לזה, אך תאי שריר לב בודדים היו מכוונים בזוויות משתנות זה ביחס לזה. לאחר צפייה בסרטון זה, עליכם להגיע להבנה טובה של האופן שבו יש להכווין ולבצע חיתוך קריוגני של לבבות עובריים, וכן לבצע צביעה אימונולוגית, מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה כדי להעריך את הבשלת ה-MyFi ותאי שריר הלב במהלך התפתחות לב העכבר.Admit.