Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Die serielle Synchrotronkristallographie oder SSX ist ein relativ neues und sich schnell entwickelndes Gebiet der MX.Es eignet sich sehr gut für Experimente mit niedriger Dosis und Raumtemperatur, aber vielleicht am wichtigsten ist, dass es wirklich gut geeignet ist, der Dynamik zu folgen. So können Stop-Motion-Filme von Proteinen in Aktion gedreht werden. Bei I24 stehen mehrere Modi von SSX zur Verfügung.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf SSX mit festem Ziel, das eine breite Palette von seriellen Experimenten mit begrenzten Probenmengen ermöglicht. Die Silikonchips können beim Laden und Reinigen beschädigt werden, wenn Sie mit ihnen nicht vertraut sind. Außerdem ist das Chip-Alignment-Protokoll für viele Kristallographen völlig neu, und die Datenverarbeitung unterscheidet sich geringfügig von Ihren Standard-Rotationsdaten.

Um einen Chiphalter vorzubereiten, schneiden Sie zwei Blätter Polyesterfolie in etwa 6 x 6 Zentimeter große Quadrate und legen Sie die Blätter über die beiden Grundplatten. Befestigen Sie die Bleche mit Metalldichtungsringen an Ort und Stelle und ziehen Sie dann vorsichtig an der überschüssigen Folie, um Falten zu entfernen. Wählen Sie als Nächstes einen Siliziumchip mit entsprechend großen Aperturen relativ zur Größe der zu analysierenden Kristalle aus.

Glow entladen den Chip für 25 Sekunden bei 0,39 Millibar, mit einem Strom von 15 Milliampere. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Siliziumchip auf die Chipladestufe zu legen, wobei die erhöhten Stäbe nach unten zeigen. Tragen Sie dann mit einer Pipette 200 Mikroliter der Mikrokristallschlämme auf die flache Seite des Chips auf und verteilen Sie die Aufschlämmung, um alle Stadtblöcke des Chips abzudecken.

Wenn der Chip beschädigt ist, bedecken Sie alle Löcher mit einem kleinen Stück Polyesterfolie, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Vakuum angewendet werden kann. Wenden Sie dann ein sanftes Vakuum an, um die gesamte überschüssige Flüssigkeit durch den Chip abzusaugen. Entfernen Sie den Chip aus der Chip-Ladestufe und tupfen Sie die Unterseite des Chips vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Legen Sie den geladenen Chip auf die größere Hälfte des Chiphalters zwischen den Führungsmarken, flach mit der Seite nach unten. Legen Sie die kleine Hälfte des Chiphalters auf den Chip, um ihn zu versiegeln. Die beiden Hälften des Chiphalters sollten einrasten.

Befestigen Sie den Chip dann mit Sechskantschrauben sicher an Ort und Stelle. Um den Chip auszurichten, halten Sie den Chiphalter in einem Winkel von 30 Grad, während Sie sich der Halterung nähern. Verwenden Sie dann die kinematischen Halterungen, um den geladenen Chip auf die XYZ-Stufe an der Strahllinie zu legen.

Wenn die Magnete Kontakt aufnehmen, lassen Sie den Chiphalter parallel zur Strömung drehen und klicken Sie ein. Sobald der Chip platziert ist, verwenden Sie das Beamline-On-Axis-Betrachtungssystem und die grafische Benutzeroberfläche für die Chipausrichtung, um den oberen linken Fiducial des Chips zu lokalisieren. Um in X, Y und Z auf das Fiducial 0 zu zentrieren, bewegen Sie sich in und aus dem Fokus, um Z auszurichten, nach oben und unten, um Y auszurichten, und nach links und rechts, um X auszurichten.Klicken Sie dann auf Set Fiducial 0"Nachdem Sie Fiducial 1 und 2 auf die gleiche Weise mit dem Röntgenstrahl ausgerichtet haben, klicken Sie auf Koordinatensystem erstellen", um eine Koordinatenmatrix zu generieren.

Klicken Sie dann auf "Block Check", um die XYZ-Stufe in die erste Vertiefung jedes Stadtblocks zu verschieben. Wenn das Röntgenkreuz mit den Blenden übereinstimmt, wird der Chip ausgerichtet. In dieser grafischen Darstellung der Spotfindungsergebnisse von DIALS kann ein aktualisierendes Trefferratendiagramm beobachtet werden.

Wenn ein Treffer angeklickt wird, wird das entsprechende Beugungsbild im DIALS-Bildbetrachter angezeigt. In dieser Tabelle können aktuelle Indizierungs- und Integrationsraten visualisiert werden, die in Echtzeit aktualisiert werden, wenn die Daten während des Besuchs gesammelt werden. Die Visualisierung der Unit-Cell-Parameter kann Polymorphe aufdecken.

Zweidimensionale Diagramme nützlicher Parameter können ebenfalls erstellt werden, um Variationen aufzudecken, die aufgrund von Belastungs- oder Dehydrationseffekten entstehen. Stereographische Projektionen können das Vorhandensein oder Fehlen bevorzugter Orientierungen aufdecken, die in das Ladeprotokoll zurückgeführt werden können. In dieser Projektion können beispielsweise die Auswirkungen der Überlastung eines Chips mit Lysozymkristallen beobachtet werden.

Wenn Sie den Chip einlegen, pipettieren Sie langsam und verwenden Sie Ihren Finger, um die Pipette über dem Chip abzustützen. Dies verhindert, dass Sie den Chip berühren und versehentlich Löcher in das Silizium stechen. Nutzen Sie bei der Verarbeitung von Daten die verfügbaren automatisierten Pipelines.

Dies gibt Ihnen eine gute Vorstellung davon, wie Ihr Experiment voranschreitet und ob Sie etwas variieren müssen. Diese Methode kann auf jedes Proteinsystem angewendet werden, das in signifikanten Mengen kristallisiert werden kann. Und die Reaktion kann durch leichte Röntgenstrahlen oder schnelles Mischen ausgelöst werden.

Dynamische Studien an einer Reihe von Strukturen können Aufschluss darüber geben, wie Proteine funktionieren.