Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source
February 26th, 2021
Wir präsentieren einen umfassenden Leitfaden für die Vorbereitung, Datenerfassung und Datenverarbeitung von Festnetzproben für die serielle Synchrotronkristallographie an der Diamond Beamline I24.
Die serielle Synchrotronkristallographie oder SSX ist ein relativ neues und sich schnell entwickelndes Gebiet der MX.Es eignet sich sehr gut für Experimente mit niedriger Dosis und Raumtemperatur, aber vielleicht am wichtigsten ist, dass es wirklich gut geeignet ist, der Dynamik zu folgen. So können Stop-Motion-Filme von Proteinen in Aktion gedreht werden. Bei I24 stehen mehrere Modi von SSX zur Verfügung.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf SSX mit festem Ziel, das eine breite Palette von seriellen Experimenten mit begrenzten Probenmengen ermöglicht. Die Silikonchips können beim Laden und Reinigen beschädigt werden, wenn Sie mit ihnen nicht vertraut sind. Außerdem ist das Chip-Alignment-Protokoll für viele Kristallographen völlig neu, und die Datenverarbeitung unterscheidet sich geringfügig von Ihren Standard-Rotationsdaten.
Um einen Chiphalter vorzubereiten, schneiden Sie zwei Blätter Polyesterfolie in etwa 6 x 6 Zentimeter große Quadrate und legen Sie die Blätter über die beiden Grundplatten. Befestigen Sie die Bleche mit Metalldichtungsringen an Ort und Stelle und ziehen Sie dann vorsichtig an der überschüssigen Folie, um Falten zu entfernen. Wählen Sie als Nächstes einen Siliziumchip mit entsprechend großen Aperturen relativ zur Größe der zu analysierenden Kristalle aus.
Glow entladen den Chip für 25 Sekunden bei 0,39 Millibar, mit einem Strom von 15 Milliampere. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Siliziumchip auf die Chipladestufe zu legen, wobei die erhöhten Stäbe nach unten zeigen. Tragen Sie dann mit einer Pipette 200 Mikroliter der Mikrokristallschlämme auf die flache Seite des Chips auf und verteilen Sie die Aufschlämmung, um alle Stadtblöcke des Chips abzudecken.
Wenn der Chip beschädigt ist, bedecken Sie alle Löcher mit einem kleinen Stück Polyesterfolie, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Vakuum angewendet werden kann. Wenden Sie dann ein sanftes Vakuum an, um die gesamte überschüssige Flüssigkeit durch den Chip abzusaugen. Entfernen Sie den Chip aus der Chip-Ladestufe und tupfen Sie die Unterseite des Chips vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
Legen Sie den geladenen Chip auf die größere Hälfte des Chiphalters zwischen den Führungsmarken, flach mit der Seite nach unten. Legen Sie die kleine Hälfte des Chiphalters auf den Chip, um ihn zu versiegeln. Die beiden Hälften des Chiphalters sollten einrasten.
Befestigen Sie den Chip dann mit Sechskantschrauben sicher an Ort und Stelle. Um den Chip auszurichten, halten Sie den Chiphalter in einem Winkel von 30 Grad, während Sie sich der Halterung nähern. Verwenden Sie dann die kinematischen Halterungen, um den geladenen Chip auf die XYZ-Stufe an der Strahllinie zu legen.
Wenn die Magnete Kontakt aufnehmen, lassen Sie den Chiphalter parallel zur Strömung drehen und klicken Sie ein. Sobald der Chip platziert ist, verwenden Sie das Beamline-On-Axis-Betrachtungssystem und die grafische Benutzeroberfläche für die Chipausrichtung, um den oberen linken Fiducial des Chips zu lokalisieren. Um in X, Y und Z auf das Fiducial 0 zu zentrieren, bewegen Sie sich in und aus dem Fokus, um Z auszurichten, nach oben und unten, um Y auszurichten, und nach links und rechts, um X auszurichten.Klicken Sie dann auf Set Fiducial 0"Nachdem Sie Fiducial 1 und 2 auf die gleiche Weise mit dem Röntgenstrahl ausgerichtet haben, klicken Sie auf Koordinatensystem erstellen", um eine Koordinatenmatrix zu generieren.
Klicken Sie dann auf "Block Check", um die XYZ-Stufe in die erste Vertiefung jedes Stadtblocks zu verschieben. Wenn das Röntgenkreuz mit den Blenden übereinstimmt, wird der Chip ausgerichtet. In dieser grafischen Darstellung der Spotfindungsergebnisse von DIALS kann ein aktualisierendes Trefferratendiagramm beobachtet werden.
Wenn ein Treffer angeklickt wird, wird das entsprechende Beugungsbild im DIALS-Bildbetrachter angezeigt. In dieser Tabelle können aktuelle Indizierungs- und Integrationsraten visualisiert werden, die in Echtzeit aktualisiert werden, wenn die Daten während des Besuchs gesammelt werden. Die Visualisierung der Unit-Cell-Parameter kann Polymorphe aufdecken.
Zweidimensionale Diagramme nützlicher Parameter können ebenfalls erstellt werden, um Variationen aufzudecken, die aufgrund von Belastungs- oder Dehydrationseffekten entstehen. Stereographische Projektionen können das Vorhandensein oder Fehlen bevorzugter Orientierungen aufdecken, die in das Ladeprotokoll zurückgeführt werden können. In dieser Projektion können beispielsweise die Auswirkungen der Überlastung eines Chips mit Lysozymkristallen beobachtet werden.
Wenn Sie den Chip einlegen, pipettieren Sie langsam und verwenden Sie Ihren Finger, um die Pipette über dem Chip abzustützen. Dies verhindert, dass Sie den Chip berühren und versehentlich Löcher in das Silizium stechen. Nutzen Sie bei der Verarbeitung von Daten die verfügbaren automatisierten Pipelines.
Dies gibt Ihnen eine gute Vorstellung davon, wie Ihr Experiment voranschreitet und ob Sie etwas variieren müssen. Diese Methode kann auf jedes Proteinsystem angewendet werden, das in signifikanten Mengen kristallisiert werden kann. Und die Reaktion kann durch leichte Röntgenstrahlen oder schnelles Mischen ausgelöst werden.
Dynamische Studien an einer Reihe von Strukturen können Aufschluss darüber geben, wie Proteine funktionieren.
Übersicht
Dieser Artikel bietet eine umfassende Anleitung zur Probenvorbereitung mit festem Ziel, Datenerfassung und Datenverarbeitung für die serielle Synchrotron-Kristallographie an der Diamond-Strahllinie I24. Er legt den Schwerpunkt auf die Methodik zur Durchführung von Experimenten mit begrenzten Probenmengen bei gleichzeitiger Gewährleistung der Chip-Integrität.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Strukturbiologie
- Kristallographie
- Proteindynamik
Hintergrund
- Die serielle Synchrotron-Kristallographie (SSX) ist ein sich entwickelnder Bereich in der Makromolekül-Kristallographie.
- Sie eignet sich für Experimente mit niedriger Dosis und Raumtemperatur.
- SSX ermöglicht dynamische Studien von Proteinen und die Visualisierung ihrer Aktionen.
- Festziel-SSX kann begrenzte Probenmengen effektiv nutzen.
Zweck der Studie
- Ein detailliertes Protokoll für die Festziel-SSX an der Diamond-Strahllinie I24 bereitzustellen.
- Die korrekte Chip-Vorbereitung und -Ausrichtung für eine optimale Datenerfassung sicherzustellen.
- Die Unterschiede in der Datenverarbeitung im Vergleich zu Standardrotationsdaten hervorzuheben.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung von Silizium-Chips unter Verwendung von Polyesterfolie und Versiegelungstechniken.
- Aufbringung von Mikrokristall-Schlämme auf die Chips und Vakuumaspiration.
- Chip-Ausrichtung mithilfe einer grafischen Benutzeroberfläche an der Strahllinie.
- Echtzeit-Datenvisualisierung und -verarbeitung mithilfe automatisierter Pipelines.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Ausrichtung der Chips führt zu präziser Datenerfassung.
- Echtzeit-Überwachung von Indexierung und Integrationsraten während der Experimente.
- Visualisierung der Einheitszellenparameter zeigt Polymorphe und Ladungseffekte.
- Dynamische Studien liefern Einblicke in die Proteinfunktionalität.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert die Effizienz von Festziel-SSX-Experimenten.
- Korrekte Chip-Handhabung und -Ausrichtung sind entscheidend für eine erfolgreiche Datenerfassung.
- Dynamische Studien mit SSX können unser Verständnis des Proteinverhaltens erheblich voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
