Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source
26. Februar 2021
Wir präsentieren einen umfassenden Leitfaden für die Vorbereitung, Datenerfassung und Datenverarbeitung von Festnetzproben für die serielle Synchrotronkristallographie an der Diamond Beamline I24.
Die serielle Synchrotronkristallographie oder SSX ist ein relativ neues und sich schnell entwickelndes Gebiet der MX.Es eignet sich sehr gut für Experimente mit niedriger Dosis und Raumtemperatur, aber vielleicht am wichtigsten ist, dass es wirklich gut geeignet ist, der Dynamik zu folgen. So können Stop-Motion-Filme von Proteinen in Aktion gedreht werden. Bei I24 stehen mehrere Modi von SSX zur Verfügung.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf SSX mit festem Ziel, das eine breite Palette von seriellen Experimenten mit begrenzten Probenmengen ermöglicht. Die Silikonchips können beim Laden und Reinigen beschädigt werden, wenn Sie mit ihnen nicht vertraut sind. Außerdem ist das Chip-Alignment-Protokoll für viele Kristallographen völlig neu, und die Datenverarbeitung unterscheidet sich geringfügig von Ihren Standard-Rotationsdaten.
Um einen Chiphalter vorzubereiten, schneiden Sie zwei Blätter Polyesterfolie in etwa 6 x 6 Zentimeter große Quadrate und legen Sie die Blätter über die beiden Grundplatten. Befestigen Sie die Bleche mit Metalldichtungsringen an Ort und Stelle und ziehen Sie dann vorsichtig an der überschüssigen Folie, um Falten zu entfernen. Wählen Sie als Nächstes einen Siliziumchip mit entsprechend großen Aperturen relativ zur Größe der zu analysierenden Kristalle aus.
Glow entladen den Chip für 25 Sekunden bei 0,39 Millibar, mit einem Strom von 15 Milliampere. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Siliziumchip auf die Chipladestufe zu legen, wobei die erhöhten Stäbe nach unten zeigen. Tragen Sie dann mit einer Pipette 200 Mikroliter der Mikrokristallschlämme auf die flache Seite des Chips auf und verteilen Sie die Aufschlämmung, um alle Stadtblöcke des Chips abzudecken.
Wenn der Chip beschädigt ist, bedecken Sie alle Löcher mit einem kleinen Stück Polyesterfolie, um sicherzustellen, dass ein gleichmäßiges Vakuum angewendet werden kann. Wenden Sie dann ein sanftes Vakuum an, um die gesamte überschüssige Flüssigkeit durch den Chip abzusaugen. Entfernen Sie den Chip aus der Chip-Ladestufe und tupfen Sie die Unterseite des Chips vorsichtig mit Filterpapier ab, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
Legen Sie den geladenen Chip auf die größere Hälfte des Chiphalters zwischen den Führungsmarken, flach mit der Seite nach unten. Legen Sie die kleine Hälfte des Chiphalters auf den Chip, um ihn zu versiegeln. Die beiden Hälften des Chiphalters sollten einrasten.
Befestigen Sie den Chip dann mit Sechskantschrauben sicher an Ort und Stelle. Um den Chip auszurichten, halten Sie den Chiphalter in einem Winkel von 30 Grad, während Sie sich der Halterung nähern. Verwenden Sie dann die kinematischen Halterungen, um den geladenen Chip auf die XYZ-Stufe an der Strahllinie zu legen.
Wenn die Magnete Kontakt aufnehmen, lassen Sie den Chiphalter parallel zur Strömung drehen und klicken Sie ein. Sobald der Chip platziert ist, verwenden Sie das Beamline-On-Axis-Betrachtungssystem und die grafische Benutzeroberfläche für die Chipausrichtung, um den oberen linken Fiducial des Chips zu lokalisieren. Um in X, Y und Z auf das Fiducial 0 zu zentrieren, bewegen Sie sich in und aus dem Fokus, um Z auszurichten, nach oben und unten, um Y auszurichten, und nach links und rechts, um X auszurichten.Klicken Sie dann auf Set Fiducial 0"Nachdem Sie Fiducial 1 und 2 auf die gleiche Weise mit dem Röntgenstrahl ausgerichtet haben, klicken Sie auf Koordinatensystem erstellen", um eine Koordinatenmatrix zu generieren.
Klicken Sie dann auf "Block Check", um die XYZ-Stufe in die erste Vertiefung jedes Stadtblocks zu verschieben. Wenn das Röntgenkreuz mit den Blenden übereinstimmt, wird der Chip ausgerichtet. In dieser grafischen Darstellung der Spotfindungsergebnisse von DIALS kann ein aktualisierendes Trefferratendiagramm beobachtet werden.
Wenn ein Treffer angeklickt wird, wird das entsprechende Beugungsbild im DIALS-Bildbetrachter angezeigt. In dieser Tabelle können aktuelle Indizierungs- und Integrationsraten visualisiert werden, die in Echtzeit aktualisiert werden, wenn die Daten während des Besuchs gesammelt werden. Die Visualisierung der Unit-Cell-Parameter kann Polymorphe aufdecken.
Zweidimensionale Diagramme nützlicher Parameter können ebenfalls erstellt werden, um Variationen aufzudecken, die aufgrund von Belastungs- oder Dehydrationseffekten entstehen. Stereographische Projektionen können das Vorhandensein oder Fehlen bevorzugter Orientierungen aufdecken, die in das Ladeprotokoll zurückgeführt werden können. In dieser Projektion können beispielsweise die Auswirkungen der Überlastung eines Chips mit Lysozymkristallen beobachtet werden.
Wenn Sie den Chip einlegen, pipettieren Sie langsam und verwenden Sie Ihren Finger, um die Pipette über dem Chip abzustützen. Dies verhindert, dass Sie den Chip berühren und versehentlich Löcher in das Silizium stechen. Nutzen Sie bei der Verarbeitung von Daten die verfügbaren automatisierten Pipelines.
Dies gibt Ihnen eine gute Vorstellung davon, wie Ihr Experiment voranschreitet und ob Sie etwas variieren müssen. Diese Methode kann auf jedes Proteinsystem angewendet werden, das in signifikanten Mengen kristallisiert werden kann. Und die Reaktion kann durch leichte Röntgenstrahlen oder schnelles Mischen ausgelöst werden.
Dynamische Studien an einer Reihe von Strukturen können Aufschluss darüber geben, wie Proteine funktionieren.
Übersicht
Dieser Artikel bietet eine umfassende Anleitung zur Probenvorbereitung an festen Targets, Datenerfassung und Datenverarbeitung für die serielle Synchrotronkristallographie an der Diamond-Strahllinie I24. Er legt den Schwerpunkt auf die Methodik zur Durchführung von Experimenten mit begrenzten Probenmengen unter gleichzeitiger Sicherstellung der Chip-Integrität.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Strukturbiologie
- Kristallographie
- Proteindynamik
Hintergrund
- Die serielle Synchrotronkristallographie (SSX) ist ein sich entwickelndes Gebiet der makromolekularen Kristallographie.
- Sie eignet sich für Experimente mit niedriger Dosis und bei Raumtemperatur.
- SSX ermöglicht dynamische Studien von Proteinen und erlaubt die Visualisierung ihrer Funktionen.
- Die Festtarget-SSX kann begrenzte Probenmengen effektiv nutzen.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung für die Festkörper-SSX an der Diamond-Beamline I24 bereitstellen.
- Sicherstellen einer korrekten Chip-Vorbereitung und -Ausrichtung für eine optimale Datenerfassung.
- Die Unterschiede in der Datenverarbeitung im Vergleich zu Standard-Rotationsdaten hervorheben.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Silizium-Chips unter Verwendung von Polyesterfolie und Versiegelungstechniken.
- Auftragung einer Mikrokristall-Suspension auf die Chips und Vakuumaspiration.
- Chip-Ausrichtung mittels grafischer Benutzeroberfläche an der Messstelle.
- Echtzeit-Datenvisualisierung und -verarbeitung mithilfe automatisierter Pipelines.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Ausrichtung der Chips führt zu einer genauen Datenerfassung.
- Echtzeitüberwachung der Indexierungs- und Integrationsraten während der Experimente.
- Die Visualisierung der Elementarzellenparameter zeigt Polymorphe und Beladungseffekte auf.
- Dynamische Studien liefern Einblicke in die Proteinfunktionalität.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll verbessert die Effizienz von Festkörper-SSX-Experimenten.
- Korrektes Handhaben und Ausrichten des Chips sind entscheidend für eine erfolgreiche Datensammlung.
- Dynamische Studien mittels SSX können unser Verständnis des Proteinverhaltens erheblich voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Serien-Synchrotron-Kristallographie an festen Targets ermöglicht es Strukturbiologen, dynamische Untersuchungen von Proteinen mit begrenzten Probemengen durchzuführen und liefert hochauflösende strukturelle Einblicke zur Unterstützung der Target-Validierung. Diese Methode verringert den Probenverbrauch, während die Datenqualität erhalten bleibt, was besonders in frühen Entwicklungsphasen entscheidend ist, in denen Proteinexpression und -reinigung oft Engpässe darstellen. Durch die Durchführung von Experimenten bei Raumtemperatur und zeitaufgelösten Messungen verbessert sie das mechanistische Verständnis der Proteinfunktion und unterstützt damit die Optimierung von Wirkstoffkandidaten sowie die Risikominimierung in der präklinischen Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem Proteinstrukturen in Aktion erfasst werden, was die funktionelle Zielvalidierung unterstützt.
- Operationaler Wert: Verringert die Abhängigkeit von großen Kristallmengen und ermöglicht das Screening von anspruchsvollen Zielstrukturen mit begrenzten Expressionsausbeuten.
- Vorhersagegenauigkeit: Liefert strukturelle Daten, die die Charakterisierung der Bindungsstelle und den Wirkmechanismus beleuchten und somit die Entscheidungen zur Zielstrukturwahl verbessern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantitative Elektronendichtekarten aus Mikrokristallen und ermöglicht präzise Aussagen zur Ligandenbindung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenaufbringung und -ausrichtung mithilfe chipbasierter Systeme und verbessert so die Reproduzierbarkeit über verschiedene Screening-Kampagnen hinweg.
- Bereitschaft für Assays: Erzeugt Echtzeit-Hit-Raten- und Indizierungsmetriken, die Entscheidungen über Fortsetzung oder Abbruch während Fragment- oder Substanz-Screenings unterstützen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Aufdeckung polymorpher Formen und konformationeller Veränderungen, die die Arzneimittelbindung oder -stabilität beeinflussen können, und unterstützt damit die Entwicklung von Formulierungsstrategien.
- Operativer Wert: Erfasst strukturelle Daten mit zeitlicher Auflösung, die mit funktionellen Assays korreliert werden können, wodurch die Zuordnung translationaler Biomarker verbessert wird.
- Risikominderung: Identifiziert frühzeitig artefaktuelle Effekte durch Belastung oder Austrocknung und verringert so das Risiko fehlerhafter Interpretationen bei der nachfolgenden Optimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
SSX mit festem Target integriert sich in den Entdeckungsworkflow nach der Target-Identifizierung und Assay-Entwicklung und liefert strukturelle Einblicke, die die Leitstruktur-Identifizierung und präklinische Validierung leiten. Es unterstützt iterative Design-Make-Test-Analyze-Zyklen, indem es schnelle strukturelle Rückmeldungen zur Bindung von Verbindungen und Protein-Dynamik bereitstellt.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Visualisierung ligandeninduzierter Konformationsänderungen und Proteindynamiken, die für den Wirkmechanismus relevant sind.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft von Assays durch standardisierte Chip-Präparation und -Ausrichtung und gewährleistet dadurch eine konsistente Datenqualität über verschiedene Substanzscreenings hinweg.
- Analytik: Liefert quantitative Ergebnisse, einschließlich Gitterparameter, Trefferquoten und Integrationsmetriken, die einen objektiven Vergleich experimenteller Bedingungen erlauben.
- Translationale Forschung: Verbindet strukturelle Beobachtungen mit funktionellen Ergebnissen, indem sie Dynamiken aufdeckt, die möglicherweise die Bioverfügbarkeit oder Zielmolekülbindung beeinflussen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für strukturelle Screenings an mehreren Zielstrukturen und reduziert so den Validierungsaufwand in umfassenden, mehrprojektigen Umgebungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem hochauflösende, zeitlich aufgelöste Strukturdaten unter nahezu physiologischen Bedingungen bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit durch standardisierte Chip-Handhabung, Ausrichtungsprotokolle und automatisierte Datenverarbeitungspipelines.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem der Probenverbrauch minimiert und eine schnelle Iteration in Kampagnen zur strukturellen Optimierung ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen zur Vorwärtsentwicklung, indem mechanistische Unklarheiten bei Target-Ligand-Wechselwirkungen reduziert werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der makromolekularen Kristallographie und Vertrautheit mit auf Synchrotronstrahlung basierenden Probenvorbereitungs- und Handhabungstechniken.
- Hängt von dem Zugang zu Beamline-Infrastruktur mit kinematischer Montage, on-axis-Visualisierung und automatisierten Datenpipelines wie DIALS ab.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen bei der Chip-Präparation, dem Vakuum-Aspirationsverfahren und den Justierprozeduren, um eine Konsistenz der Daten sicherzustellen.
- Beinhaltet Anpassungen hinsichtlich unterschiedlicher Kristallgrößen und Raumgruppen, die eine Anpassung der Blendenwahl und der Auftragetechniken notwendig machen.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die Zerbrechlichkeit der Chips beim Beladen und Reinigen sowie die Empfindlichkeit gegenüber Austrocknungseffekten, die die Kristallqualität im Laufe der Zeit beeinträchtigen können.
