Ein schneller Screening-Workflow zur Identifizierung einer potenziellen Kombinationstherapie für GBM unter Verwendung von vom Patienten abgeleiteten Gliomstammzellen

Gliomstammzellen sind Subpopulationen von Zellen im Gliom, die in der Regel resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie sind. Hier haben wir die Methode zur schnellen Identifizierung von Kombinationstherapien beschrieben, die auf Gliomstammzellen anstelle von differenzierten Gliomzellen abzielen. Im Vergleich zu anderen Methoden, die mühsam und kompliziert sein können.

Dieses Protokoll ist relativ einfach und schnell, um potenzielle nützliche Arzneimittelkombinationen zu identifizieren. Beginnen Sie, indem Sie die Gliomstammzellen oder GSCs aus dem Kulturmedium sammeln und sie bei 70 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, verdauen Sie die Zellen mit Accutase für vier Minuten bei 37 Grad Celsius.

Pipetten Sie die Zellen mit einer 200-Mikroliter-Spitze wiederholt, um sich zu dissoziieren, und regenerieren Sie das Zellpellet. Fügen Sie die GSCs mit einer Dichte von 200.000 Zellen in einem Milliliter Kulturmedium in jede Vertiefung einer 12-Well-Kulturplatte hinzu und inkubieren Sie sie über Nacht. Oh am nächsten Tag, fügen Sie 30 Mikroliter Luciferase-eGFP-Virusüberstand in jede Vertiefung der Platte hinzu.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1000 mal G für zwei Stunden, bei 25 Grad Celsius und inkubieren Sie sie über Nacht. Ersetzen Sie am nächsten Tag das Medium in den Vertiefungen, indem Sie die GSCs sammeln, zentrifugieren, den Überstand entfernen, sie in frischem Medium wieder auffüllen und neu plattieren. Kulturieren Sie die Zellen für weitere 48 Stunden.

Beobachten Sie die Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop und bestätigen Sie das Auftreten von GFP-positiven Zellen. Sortieren und sammeln Sie die GSCs mit hoher Fluoreszenz mit einem Flusszellensortierer und kulturieren Sie sie weiter. 96 gut optische Bodenplatten mit einer extrazellulären Matrixmischung wie Matrigel beschichten und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Entfernen Sie die überschüssige Mischung und spülen Sie die Platten vorsichtig einmal mit PBS aus, dann säen Sie XG387-Luc-Zellen mit einer Dichte von 1000 Zellen in 100 Mikrolitern Kulturmedium und zu jeder Vertiefung der beschichteten Platten und kultivieren Sie sie über Nacht. Beobachten Sie am nächsten Tag die Zellen unter einem Mikroskop, um ihre Befestigung an der Platte zu bestätigen. Als nächstes bereiten Sie eine 200-mikromolare Temozolomid-Lösung und zwei mikromolare Lösungen der Zielmittel in Kulturmedium vor.

Für das Kombinations-Arzneimittel-Screening entfernen Sie das leere Medium und fügen Sie das Medium, das entweder 200 mikromolaren Temozolomid oder zwei mikromolaren Zielmittel oder eine Kombination aus beiden enthält, in jede Vertiefung für drei technische Replikate pro Behandlung hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für drei Tage. Nehmen Sie Bilder der zellulären Biolumineszenz in der Platte mit dem IVIS-Spektrum-Bildgebungssystem auf.

Erstellen Sie mit der integrierten Software mehrere kreisförmige Bereiche der interessierenden Region und quantifizieren Sie die zelluläre Biolumineszenz. Um potenzielle Kandidaten zu identifizieren, die die Antiglioblastom-Wirkung von Temozolomid verstärken könnten, wurden 20 zielselektive niedermolekulare Inhibitoren durch Arzneimittelkombinationsscreening analysiert. Die empfindlichen Indexwerte von 13 Zielerregern lagen über Null und fünf von ihnen über 0,1.

Der empfindliche Index der beiden Top-Kandidaten UMI-77 und A 83-01 lag über 0,25, was auf ihr Potenzial zur Synergie mit Temozolomid hindeutet. Die kombinierte Behandlung von Temozolomid und UMI-77 wurde mit einem antiproliferativen Assay in einer Titrationsmatrix mit sechs mal sechs Dosen bewertet. Die Kombinationsindexwerte lagen unter eins.

Und die hohen Einzelmittelwerte waren für die meisten Kombinationen von Temozolomid und UMI-77 in unterschiedlichen Konzentrationen größer als Null. Dies deutet auf eine synergistische Gesamtinteraktion von Temozolomid und UMI-77 in XG387- und XG328-GSCs hin. Dieses Protokoll kann auch bei der Suche nach einer Arzneimittelkombination mit adhärenten Krebszellen angewendet werden, indem einfach der Plattenbeschichtungsschritt entfernt wird.