Zellulärer Biolumineszenz-basierter Assay: Eine Hochdurchsatzmethode für das kombinatorische Wirkstoffscreening
JoVE Encyclopedia of Experiments
Krebsforschung
0 Ansichten • 3:17 Min. • April 30th, 2023
Die zelluläre Biolumineszenz ist ein hochempfindlicher und schneller Ansatz für das groß angelegte Screening von Krebsmedikamenten.
Bei dieser Technik werden Tumorzellen verwendet, die Luciferase exprimieren - ein Enzym, das eine lichterzeugende chemische Reaktion katalysiert, wodurch die Wirtszellen im Dunkeln leuchten. Die Intensität der emittierten Lumineszenz ist direkt proportional zur Dichte der lebenden Zellen.
ZuBeginn werden Luciferase-exprimierende Zellen in einer optisch klaren Kulturplatte, die mit einer extrazellulären Matrix oder EZM beschichtet ist, ausgesät und inkubiert.
Während der Inkubation fördert die EZM die Anheftung der Zellen an die Kulturvertiefung.
Nehmen Sie als nächstes konzentrierte Vorräte der Arzneimittelkombination und fügen Sie verschiedene Volumina von Nährmedien hinzu, um eine serielle Verdünnung der Arzneimittelmischung vorzubereiten.
Entfernen Sie nun das Kulturmedium von den verklebten Zellen. Geben Sie verschiedene Verdünnungen der Wirkstoffkombination hinzu und inkubieren Sie.
Während der Inkubation wirkt die Wirkstoffkombination synergistisch auf zelluläre Ziele.
Entfernen Sie nun das arzneimittelhaltige Medium und fügen Sie frisches Medium hinzu, das Luciferin enthält.
Luciferin diffundiert durch die Membran und gelangt in die Zellen. Die von den Zellen exprimierten Luciferasen verwenden zelluläres ATP, um Luciferin zu oxidieren und Lichtsignale auszusenden.
Quantifizieren Sie die zelluläre Biolumineszenz unter einem bildgebenden System.
Eine Abnahme der Lichtemission mit erhöhter Wirkstoffkonzentration deutet auf eine verminderte Zellviabilität hin. Dies korreliert mit der antiproliferativen Wirkung des Medikaments auf die Zielzellen.
Beschichten Sieoptische 96-Well-Bodenplatten mit einer extrazellulären Matrixmischung wie Matrigel und inkubieren Sie sie 1 Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie die überschüssige Mischung und spülen Sie die Platten einmal vorsichtig mit PBS aus.
Anschließend werden XG387-Luc-Zellen mit einer Dichte von 1.000 Zellen in 100 Mikrolitern Kulturmedium in jede Vertiefung der beschichteten Platten gesät und über Nacht kultiviert. Beobachten Sie am nächsten Tag die Zellen unter einem Mikroskop, um ihre Anhaftung an die Platte zu bestätigen.
Als nächstes bereiten Sie eine 200-mikromolare Temozolomidlösung und 2-mikromolare Lösungen der Zielwirkstoffe in Kulturmedium vor. Für das Kombinationsscreening von Wirkstoffen entfernen Sie das Blindmedium und fügen Sie das Medium, das entweder 200 Mikromolare Temozolomid oder 2 Mikromolare Zielwirkstoffe oder eine Kombination aus beiden enthält, in jede Vertiefung für 3 technische Replikate pro Behandlung hinzu.
Inkubieren Sie die Platte 3 Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nehmen Sie Bilder der zellulären Biolumineszenz in der Platte mit dem IVIS-Spektrum-Bildgebungssystem auf. Erstellen Sie mit der integrierten Software mehrere kreisförmige Bereiche des interessierenden Bereichs und quantifizieren Sie die zelluläre Biolumineszenz.
Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur großflächigen Untersuchung von Anti-Krebs-Medikamenten mithilfe zellulärer Biolumineszenz beschrieben. Das Verfahren umfasst Tumorzellen, die Luciferase exprimieren und Licht emittieren, das proportional zur Zelldichte ist, wodurch die Wirksamkeit von Medikamenten bewertet werden kann.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- zelluläre Biolumineszenz
- Antikrebs-Wirkstoff-Screening
- Anwendungen des Luciferase-Enzyms
Hintergrund
- Die zelluläre Biolumineszenz bietet eine empfindliche Methode zur Beurteilung der Zellviabilität.
- Die Luciferase katalysiert eine Reaktion, die Licht emittiert und somit die Dichte lebender Zellen anzeigt.
- Mithilfe der Methode lässt sich die Wirkung von Wirkstoffkombinationen schnell bewerten.
- Die extrazelluläre Matrix (ECM) unterstützt die Zellanheftung während der Kultivierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer schnellen Screening-Methode für Anti-Krebs-Medikamente.
- Beurteilung der synergistischen Wirkungen von Wirkstoffkombinationen auf Tumorzellen.
- Quantifizierung zellulärer Reaktionen mittels Biolumineszenz-Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Ansäen von Luciferase-exprimierenden Zellen in mit ECM beschichteten Platten.
- Herstellung serieller Verdünnungen von Wirkstoffkombinationen.
- Inkubation der Zellen mit Wirkstoffmischungen und Luciferin.
- Quantifizierung der Biolumineszenz mittels eines Bildgebungssystems.
Hauptergebnisse
- Die Lichtemission nimmt mit steigender Wirkstoffkonzentration ab, was auf eine verminderte Zellviabilität hinweist.
- Die Methode korreliert effektiv die Wirkstoffkonzentration mit antiproliferativen Wirkungen.
- Aufgenommene Bilder zeigen zelluläre Reaktionen auf Behandlungen.
- Die Ergebnisse untermauern das Potenzial dieser Methode für die Wirkstoffscreening.
Schlussfolgerungen
- Die zelluläre Biolumineszenz ist eine geeignete Methode für die Wirkstoffscreening gegen Krebs.
- Mit der Technik lässt sich die Wirksamkeit von Arzneimitteln schnell und empfindlich bewerten.
- Zukünftige Studien können diese Methode für verschiedene therapeutische Wirkstoffe erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die zelluläre Biolumineszenz ermöglicht eine schnelle und empfindliche Untersuchung von Kombinationen gegen Krebs wirksamer Wirkstoffe, indem die Dichte lebender Zellen über die Lichtemission quantifiziert wird. Dieser Ansatz unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in einem frühen Stadium und die mechanistische Risikominderung, indem er quantitative Messwerte der durch Wirkstoffe induzierten Zytotoxizität liefert. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit bei präklinischen Entscheidungen für Onkologie-Pipelines.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die antiproliferativen Wirkungen von Wirkstoffkombinationen an Tumorzellen mit Luciferase-Expression gemessen werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch dosisabhängige Reduktion der Lumineszenz, die mit der Zellviabilität korreliert.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem synergistische Wirkstoffwechselwirkungen identifiziert werden, die einer weiteren Untersuchung bedürfen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung von mit ECM beschichteten Platten und Luciferase-exprimierenden Zellen vor.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Standardisierung und Reproduzierbarkeit des Assays durch serielle Verdünnungen von Wirkstoffen und technische Replikate.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht eine zuverlässige Evaluierung von Substanzen mittels quantifizierbarer Lumineszenzsignale, die mit bildgebenden Systemen kompatibel sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem patientenstammende Gliom-Stammzellen, die Luciferase exprimieren, zur Modellierung der GBM-Biologie verwendet werden.
- Präklinische Abstimmung: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die Wirkung von Wirkstoffen in einem krankheitsrelevanten System quantifiziert wird.
- Mechanistische Entlastung von Risiken: Verringert die Unschärfe bei der Zielvalidierung, indem Veränderungen der Lichtemission mit spezifischen Wirkstoffmechanismen verknüpft werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der frühen Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung, insbesondere für onkologische Kombinationstherapien.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch Messung zellulärer Reaktionen auf Kombinationen von Wirkstoffen.
- Screening: Bietet Bereitschaft für Assays und quantitative Ergebnisse durch lumineszenzbasierte Messungen der Zellviabilität.
- Analytik: Erzeugt statistische Daten zur Wirkstoffempfindlichkeit und -synergie anhand der Lumineszenzintensität entlang von Konzentrationsgradienten.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, indem patientenabgeleitete Zellen verwendet werden, die die Tumorbiologie widerspiegeln.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbares Screening-Plattform für mehrere therapeutische Wirkstoffe und Kombinationen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine vorhersagbare Sicherheit bei der Zielvalidierung und verringert mechanistische Unklarheiten bei der Wirkstoff-Screening.
- Operativer Wert: Bietet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Workflows.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Einstellung sowie die Kapitalnutzung, indem wirksame Kombinationen frühzeitig identifiziert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf quantitativen Synergie- und Wirksamkeitsdaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Zellkultur, Handhabung von Luciferase-Assays und Bedienung von Bildgebungssystemen.
- Abhängig von optisch klaren Platten, Beschichtungen mit extrazellulärer Matrix und Verfügbarkeit des Luciferin-Substrats.
- Erfordert die Standardisierung von Protokollen zur Verdünnung von Wirkstoffen und Inkubationsbedingungen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Transfer auf verschiedene Zelllinien oder Tumormodelle.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit der Luciferase-Expression, die eine genetische Modifikation primärer Zellen oder Stammzellen erfordern kann.
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Zuletzt aktualisiert: 29 August 2026