Fluoreszenzanisotropie-basierter Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Für die auf Fluoreszenzanisotropie basierende Protein-Protein-Interaktionsdetektion beginnen Sie mit rekombinanten Zielproteinen, die mit C-terminalen Tetracysteinmotiven in einem geeigneten Anisotropiepuffer markiert sind.

Fügen Sie einen fluorophorhaltigen Farbstoff hinzu, der über das Tetracysteinmotiv an Zielproteine bindet. Dialysieren Sie mit dem Anisotropiepuffer, wobei ungebundener Farbstoff entfernt wird. Die Mischung in Quarzküvetten umfüllen. Messen Sie die Absorption, indem Sie den Prozentsatz der erfolgreich markierten Zielproteine bestimmen.

Mischen Sie in einer Fluoreszenzküvette die Fluorophor-markierten Zielproteine mit unmarkierten Proteinen. Messen Sie mit einem Spektrofluorometer die Fluoreszenzanisotropie.

Während die Zielproteine frei im Puffer suspendieren, rotieren die an sie gebundenen Fluorophore aufgrund der Brownschen Bewegung zufällig um ihre Achsen. Bei Anregung mit vertikal polarisiertem Licht einer geeigneten Wellenlänge emittieren die Fluorophore Licht, das in der vertikalen und horizontalen Ebene polarisiert ist. Gemessen wird das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der vertikal und horizontal polarisierten Emission – die Anisotropie.

Wenn unmarkierte Proteine an die Fluorophor-markierten Ziele binden, nimmt die Molekülgröße des Proteinkomplexes zu, wodurch seine Rotationsbewegung reduziert wird. Infolgedessen wird das emittierte Licht stärker polarisiert, mit einer höheren Emission in der vertikalen Ebene als in der horizontalen Ebene – was die Anisotropie erhöht.

Fügen Sie zunehmende Konzentrationen des unmarkierten Proteins hinzu und wiederholen Sie die Anisotropiemessung.

Ein nichtlinearer Anstieg der Anisotropie mit erhöhter Zugabe unmarkierter Proteine deutet auf eine unmarkierte Proteinbindung an mehreren nicht-identischen Bindungsstellen auf den Fluorophor-markierten Zielproteinen hin.

Mischen Sie 3 Nanomol des SBDS-FlAsH-Proteins mit 3 Nanomol des Lumio Green-Farbstoffs in einem 5-Mikroliter-Volumen Anisotropiepuffer. Lassen Sie die Reaktion 8 Stunden lang bei 4 Grad Celsius ablaufen. Nach 8 Stunden dialysieren Sie die Probe über Nacht gegen den Anisotropiepuffer, um den freien Farbstoff zu entfernen. Messen Sie die Extinktion bei 280 Nanometern und 508 Nanometern in einem Spektralphotometer mit einer Quarzküvette. Verwenden Sie dann das Lambert-Beer-Gesetz, um den Prozentsatz des markierten Proteins zu quantifizieren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Vor der Messung des Anisotropiewertes sollte jeder Titrationsschritt des Proteinliganden sorgfältig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe in die Lösung abgegeben wird und homogen wird.

In eine Fluoreszenzküvette werden 200 Mikroliter 30 nanomolare SBDS-FlAsH in Anisotropiepuffer gegeben und 2 Mikroliter 30 mikromolare EFL1 titriert. Mischen Sie gründlich und lassen Sie die Reaktion 3 Minuten stehen, bevor Sie die Anisotropie und den Fluoreszenzwert messen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis ein Gesamtvolumen von 40 Mikrolitern EFL1 hinzugefügt wurde. Passen Sie die Daten als letzten Schritt an ein vermutetes Bindungsmodell an, wie im Textprotokoll beschrieben.