Fluoreszenzanisotropie-basierter Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen

Für die auf Fluoreszenzanisotropie basierende Protein-Protein-Interaktionsdetektion beginnen Sie mit rekombinanten Zielproteinen, die mit C-terminalen Tetracysteinmotiven in einem geeigneten Anisotropiepuffer markiert sind.

Fügen Sie einen fluorophorhaltigen Farbstoff hinzu, der über das Tetracysteinmotiv an Zielproteine bindet. Dialysieren Sie mit dem Anisotropiepuffer, wobei ungebundener Farbstoff entfernt wird. Die Mischung in Quarzküvetten umfüllen. Messen Sie die Absorption, indem Sie den Prozentsatz der erfolgreich markierten Zielproteine bestimmen.

Mischen Sie in einer Fluoreszenzküvette die Fluorophor-markierten Zielproteine mit unmarkierten Proteinen. Messen Sie mit einem Spektrofluorometer die Fluoreszenzanisotropie.

Während die Zielproteine frei im Puffer suspendieren, rotieren die an sie gebundenen Fluorophore aufgrund der Brownschen Bewegung zufällig um ihre Achsen. Bei Anregung mit vertikal polarisiertem Licht einer geeigneten Wellenlänge emittieren die Fluorophore Licht, das in der vertikalen und horizontalen Ebene polarisiert ist. Gemessen wird das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der vertikal und horizontal polarisierten Emission – die Anisotropie.

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