Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Bildkorrelationsspektroskopie-Protokolls ist es, eine zugängliche Methodik für die Quantifizierung von Clustering-Ereignissen bereitzustellen, die an der Zelloberfläche auftreten. Antikörper, die an Rezeptoren an der Zelloberfläche binden, können zu Bestätigungs- und Clustering-Veränderungen führen. Die Analyse dieser dynamischen Prozesse ist wichtig für die Charakterisierung von Wirkstoffzielen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine zugängliche Methodik für die Quantifizierung von Clustering-Ereignissen an der Zelloberfläche mit Hilfe leicht zugänglicher Bildgebungsgeräte bietet. Zu Beginn säen Sie 10.000 A431-Epidermoidkarzinomzellen in jede Vertiefung eines Achtkammer-Objektträgers. Geben Sie am nächsten Tag 100 Nanogramm pro Milliliter EGF-Liganden unmittelbar in die Zellen, um die EGF-Rezeptoraggregation zu stimulieren.

Inkubieren Sie die Zellen mit dem Liganden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sie fixieren. Befolgen Sie anschließend das Protokoll für Immunzytochemie und konfokale Bildgebung im begleitenden Textprotokoll, achten Sie genau auf die Einstellungen, die während der Erfassung verwendet werden, und laden Sie die erfassten Datensätze nach Fidschi. Eine Übersättigung muss vermieden werden.

Die endgültigen Bilder müssen Pixelgrößen von weniger als 1 Mikrometer im Quadrat enthalten. Zusätzlich können Sie eine flache Oberfläche auf der apikalen oder basalen Oberfläche sowie einen zellfreien Bereich für die spätere Normalisierung der Probe erfassen. Beginnen Sie mit der Identifizierung der apikalen oder basalen Zelloberflächenmembranregion, die im ersten Bild von Interesse ist.

Wählen Sie eine Pixelgröße von 2 bis n im Bereich von 256 x 256, 128 x 128 oder 64 x 64 aus. Gehen Sie dann zum Bildmenü und wählen Sie Duplizieren. Gehen Sie als Nächstes zu Analysieren und dann nach unten zu Messungen.

Berechnen Sie die durchschnittliche Intensität des beschnittenen Bereichs von Interesse. Identifizieren Sie nun einen Hintergrundbereich mit der gleichen Größe wie das Originalbild. Duplizieren Sie es wie zuvor.

Und berechnen Sie die durchschnittliche Intensität des im Hintergrund beschnittenen Bereichs von Interesse. Nachdem sowohl der Interessenbereich als auch der Hintergrund gemessen wurden, gehen Sie zu Verarbeiten und wählen Sie Bildrechner aus. Platzieren Sie den Interessenbereich als Bild 1 und das Hintergrundbild als Bild 2 und wählen Sie Subtrahieren als Operation.

Gehen Sie anschließend zum Prozessmenü. Gehen Sie nach unten zu FFT und wählen Sie FD Math. Wählen Sie im Dialogfeld FFT-Mathematik die Option Geben Sie die Bilder ein, wie hier gezeigt, und legen Sie den Vorgang so fest, dass er korreliert.

Stellen Sie sicher, dass die inverse Transformation aktiviert ist. Normalisieren Sie das resultierende Bild, indem Sie Prozess auswählen, nach unten zu Mathematik scrollen, Dividieren auswählen und die Gesamtzahl der Pixel in das Dialogfeld eingeben. Normalisieren Sie dann erneut, indem Sie durch die durchschnittliche Intensität des normalisierten zugeschnittenen Bereichs zum Quadrat dividieren.

Zeichnen Sie als Nächstes eine Linie durch die Punktspreizungsfunktion. Plotten Sie das Profil dieser Linie, um den Spitzenwert zu berechnen, indem Sie zu Analyse wechseln und Profil plotten auswählen. Berechnen Sie die Cluster pro Balkenfläche, indem Sie den Spitzenwert in eine Tabellenkalkulation übertragen.

Legen Sie dann die Cluster pro Strahlbereich auf eins über dem Spitzenwert minus eins fest. Um die Bilder stapelweise verarbeiten zu können, wird empfohlen, ein Fiji-Makro einzurichten. Dies ermöglicht eine konsistente und schnelle Analyse mehrerer konfokaler Bilder für die Bildkorrelationsspektroskopie-Analyse.

Um ein Makro für den Arbeitsablauf der Bildkorrelationsspektroskopie einzurichten, richten Sie das Programm so ein, dass jeder Menübefehl im Protokoll aufgezeichnet wird. Gehen Sie dazu zu Plug-Ins, runter zu Marcos und wählen Sie Aufnahme. Kehren Sie dann zum Hauptfenster zurück und führen Sie das im vorherigen Abschnitt dieses Videos beschriebene Protokoll aus.

Wenn Sie fertig sind, kehren Sie zum Makrofenster zurück, und wählen Sie Erstellen aus, um ein Makro zu generieren. Stellen Sie als Nächstes sicher, dass Sie im Makrobearbeitungsfenster die Sprache als LJ1-Makro auswählen. Wenn diese Option nicht ausgewählt ist, kann das Programm nicht ausgeführt werden.

Speichern Sie abschließend das Makro. Die optische Übertragungsfunktion eines Mikroskops sorgt dafür, dass selbst molekulare Objekte in der XY-Ebene zwischen 200 und 300 Nanometern als Bilder erscheinen. Durch die Abbildung von Fresin-Kügelchen mit geringer Auflösung auf die gleiche Weise wie Zellen, wie in diesem Protokoll beschrieben, kann die Fläche der Punktspreizungsfunktion des Mikroskops berechnet werden.

Diese Bilder zeigen EGF-stimulierte und nicht simulierte adhärente A431-Epidermoidkarzinomzellen, die mit einem Cetuximab-Primärantikörper markiert sind, der auf den EGF-Rezeptor der Zelloberfläche abzielt. Die gelben Felder stellen die Zellmembran dar, die Pflanzenbereiche mit Pixelabmessungen von 64 x 64 enthält. Diese Bilder wurden verwendet, um eine Bildkorrelationsspektroskopie durchzuführen.

Nach der Normalisierung der Autokorrelationsfunktion kann die Punktspreizungsfunktion mit dem Linienwerkzeug gemessen werden. Das Profil dieser Linienfunktion wird gezeichnet, um den Spitzenwert zu erkennen. Mit diesen Methoden wurde beobachtet, dass die EGF-Stimulation im Vergleich zu unstimulierten Zellen eine 2,56-fache Abnahme der detektierten EGFR-Cluster pro Strahlfläche induzierte.

Einmal gemeistert, dauert die Analyse Ihrer konfokalen Bilder nur wenige Minuten pro Bild. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere Replikate jeder experimentellen Bedingung mit den in diesem Protokoll beschriebenen Einstellungen zu sammeln. Nach diesem Verfahren kann die Bildkorrelationsspektroskopie erweitert werden, um die zeitlichen Veränderungen von Clustering-Ereignissen in lebenden Zellen mit Hilfe der Zeitraffermikroskopie zu untersuchen.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher, Aggregationszustände höherer Ordnung mit Hilfe von Photobleich-ICS zu erforschen, während zwei membranbasierte Proteine mit Hilfe von Bildkreuzkorrelationsspektroskopiemethoden kolokalisiert wurden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Clustering-Zustand Ihres interessierenden Zelloberflächenmoleküls berechnen können.