In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.

Unser Protokoll beschreibt, wie Techniken wie Pull-Down-Assays analytische Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation und Histon-Chaperoning-Assay verwendet werden können, um zu bestätigen, ob ein Protein ein Histon-Chaperon ist. Die hier behandelten Techniken bei der Verwendung von Tandem könnten direkt angewendet werden, um ein mutmaßliches Chaperon zu charakterisieren. Seine könnte mit der strukturbiologischen Technik einhergehen.

Die Techniken sind auf dem Gebiet der Chromatinforschung anwendbar. Die einzelnen Methoden könnten jedoch bei Bedarf auf jedes andere Protein von Interesse angewendet werden. Das Verfahren wird Herr Surajit Gandhi, ein Doktorand aus meinem Labor, für den komplizierten Pulldown-Assay demonstrieren.

Archana Samal, eine Doktorandin, zusammen mit Herrn Ruchir C. Bobde für das analytische Ultrazentrifugationsexperiment;Herr Somanath Baral, ein Doktorand; zusammen mit Herrn Ketul Saharan für den Plasmid-Super-Coiling-Assay Mischen Sie zunächst fünf mikromolare Histonchaperone mit 20-Mikromolaren H2A / H2B-Dimeren in 300 Mikrolitern Gleichgewichtspuffer. Zentrifugieren Sie den Histon-Chaperon-H2A/H2B-Komplex, um Niederschläge zu entfernen.

Laden Sie die Probe auf die Spinsäule, die mit dem Gleichgewichtspuffer voräquilibriert ist. Waschen Sie die Säule mit 100 Säulenvolumen oder vier Milliliter Waschpuffer, um überschüssiges H2A/H2B-Dimer zu entfernen. Als nächstes mischen Sie den Histon-Chaperon-H2A / H2B-Komplex mit 20 bis 60 Mikromolaren H3 / H4-Tetramer.

Waschen Sie die Säule erneut mit 100 Säulenvolumina oder vier Milliliter Waschpuffer, um ungebundenes H3/H4-Tetramer zu entfernen, und eluieren Sie dann die Proben mit Elutionspuffer. Die eluierten Samples auf 18%SDS-PAGE setzen. Dann mit Coomassie Brilliant Blue R250 färben und das Gel visualisieren.

Reinigen Sie das H2A/H2B-Dimer, H3/H4-Tetramer im Histon-Chaperon einzeln mit dem Dialysepuffer mittels analytischer Größenausschlusschromatographie. Speichern Sie den Puffer aus dem Durchlauf, um später weitere Verdünnungen vorzubereiten und als Referenz in der AUC-Zelle zu verwenden. Für AUC-Proben mischen Sie die gereinigten Chaperone mit Dimer oder Tetramer in separaten Röhrchen unter Verwendung des gespeicherten Dialysepuffers auf ein Endvolumen von 450 Mikrolitern, um einen OD280 von 0,3 bis 0,6 zu erreichen.

Bauen Sie die Zelle mit einem Doppelsektor-Mittelstück und Quarzfenstern zusammen, die mit einer analytischen Ultrazentrifuge mit einem Absorptionsdetektor versehen sind. Füllen Sie 400 Mikroliter der Probenlösung und 420 Mikroliter Dialysepuffer in die Referenz- bzw. Probensektoren der Zelle. Wiegen und balancieren Sie die Zellen genau aus und laden Sie sie in einen Vierloch-Titanrotor.

Richten Sie die Zellen anhand der Markierungen am unteren Rand der Zellen und am Rotor aus. Laden Sie den Rotor in die Zentrifuge, schließen Sie den Deckel und starten Sie den Lauf, wodurch sich ein Vakuum entwickeln und die Temperatur stabilisiert werden kann. Für die Datenanalyse berechnen Sie die Dichte und Viskosität für die Proteinpufferkomponenten und das partielle spezifische Volumen basierend auf der Aminosäurezusammensetzung des Proteins mit dem Programm SEDNTERP.

Laden Sie die Daten von der AUC-Maschine in das Programm SEDFIT. Definieren Sie den Meniskus, die rote Linie, den Zellboden, die blaue Linie und die Datenanalysegrenzen grüne Linien. Wählen Sie Continuous CS distribution als Modell aus.

Stellen Sie im Abschnitt Parameter die maximale Auflösung auf 100 ein. Als nächstes stellen Sie den Sedimentationskoeffizienten minimal auf Null und maximal auf 10 bis 15 ein. Stellen Sie das Reibungsverhältnis zunächst auf 1,2 ein und entscheiden Sie sich für floating, um das Verhältnis aus den Daten abzuleiten.

Stellen Sie das F-Verhältnis für die Ein-Sigma-Regularisierung auf 0,68 ein. Stellen Sie partielles spezifisches Volumen, Pufferdichte und Viskosität ein, wie vom SEDNTURP erhalten. Drücken Sie Ausführen, damit die Software die Lam-Gleichung lösen kann.

Drücken Sie zum Verfeinern auf Anpassen. Wählen Sie in der Anzeigefunktion der Hauptsymbolleiste die Option Peak Mw in CS anzeigen, um die Molekülmassen zu schätzen. Mischen Sie zweimikromolares H3/H4-Tetramer und viermikromolares H2A/H2B-Dimer mit steigenden Konzentrationen von Histon-Chaperon, die von einem bis sechs Mikromolaren reichen, in einem Montagepuffer auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern.

Die Mischung bei vier Grad Celsius 30 Minuten inkubieren. Gleichzeitig werden 500 Nanogramm des negativ überwickelten PUC-19-Plasmids mit einem Mikrogramm Topoisomerase-I-Enzym im Montagepuffer in einem Endvolumen von 50 Mikrolitern vorbehandelt. Als nächstes kombinieren Sie die vorgemischte Lösung, die Tetramer, Dimer und Histon-Chaperon enthält, mit der entspannten Plasma-DNA.

Fügen Sie 100 Mikroliter 2X-Stop-Puffer hinzu und inkubieren, um die Montagereaktion durch Deproteinisierung der Plasmid-DNA zu beenden. Geben Sie eine gleiche Menge Tris-gesättigtes Phenol in das Röhrchen, das das Reaktionsgemisch enthält, und mischen Sie den Inhalt des Reaktionsgemisches gut. Dann zentrifugieren Sie die Probe.

Sammeln Sie vorsichtig die obere wässrige Phase, die die Plasmid-DNA enthält, mit einer Mikropipette und mischen Sie eine gleiche Menge Chloroform. Wirbeln Sie die Mischung. Als nächstes sammeln Sie die obere wässrige Phase, fügen Sie ein 1/10-Volumen dreimoliges Natriumacetat mit pH 5,5 und 2,5 Volumen eiskaltes Ethanol hinzu.

Mischen Sie die Lösung gut, indem Sie das Röhrchen drei- bis viermal umdrehen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16, 200 G für 10 Minuten und verwerfen Sie den Überstand vorsichtig. Halten Sie die Röhrchen bei Raumtemperatur offen, bis auch nur Spuren von Ethanol verdampft sind und die gefällte Plasmid-DNA in der Röhre verbleibt.

Die analytischen SEC-Ergebnisse zeigten, dass die rekombinante N-terminale Nukleoplasmin-Domäne des Arabidopsis thaliana-Proteins FKBP53 ein Pentamer von 65 Kilodalton in Lösung ist. Die Nukleoplasminprobe, die einer Wärmebehandlung unterzogen wurde, zeigte, dass die Domäne sehr thermostabil ist. Die Nukleoplasmindomäne zeigte eine Salzstabilität bis zu zwei Molaren Natriumchlorid und eine Harnstoffstabilität bis zu vier Molaren.

Ein Pull-Down-Assay zeigte, dass die Wechselwirkung der Nukleoplasmindomäne mit H2A/H2B-Dimer bis zu 0,4-molaren Natriumchlorid stabil war, während die Assoziation mit H3/H4 bis zu 0,7 Molaren stabil war. Das Chaperon bindet H2A/H2B-Dimer und H3/H4-Tetramer gleichzeitig, unabhängig von der Reihenfolge, in der sie dem Chaperon zugesetzt werden, was auf separate Interaktionsstellen für die Oligomere hinweist. Die geschätzten Molekülmassen durch AUC-SV zeigen eine 1:1-Stöchiometrie der Nukleoplasmindomäne mit den Histon-Oligomeren.

Im Plasmid-Super-Coiling-Assay erhöhten rekombinante Pflanzen-Histon-Chaperone AtNRP1 und AtNRP2 die Menge an super-coiled Plasmid, was darauf hindeutet, dass es Histone auf der DNA ablagern könnte, um Nukleosomen zu bilden, was zu DNA-Super-Coiling führt. Der Plasmid-Super-Coiling-Assay erfordert besondere Sorgfalt und mögliche Optimierung für die Charakterisierung von Histon-DNA und Chaperon. Die Telemetrie zur isomeren Charakterisierung kann als Folgemaßnahme zu analytischen Größenausschlussexperimenten verwendet werden, um die Bindungsstabilität zu bestätigen.